花生根全长cDNA文库的构建及分析
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。
其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。
（2）cDNA第一条链的合成。
（3）cDNA第二条链的合成。
（4）双链cDNA的修饰。
（5）双链cDNA的分子克隆。
（6）cDNA文库的扩增。
（7）cDNA文库鉴定评价。
一、Superscipt II—RT合成第一链1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAC TAGTCTCGAGTTTTTTTT TTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。
）。
2. 混匀后，70℃反应10分钟。
3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。
4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂：（1）4 ul 5×first strand buffer（2）2 ul 0.1 M DTT（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。
7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。
二、cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。
DNA和CDNA文库构建
5、双链cDNA与载体连接
1）同聚物加尾： 2）加接头引入酶切位点，添加带有限制性酶切位点的
接头是最常用的方法 3）cDNA的定向插入：cDNA两端添加不同的限制性酶
切位点，双酶切后与对应的双酶切载体连接
同聚物加尾法：
末端转移酶+dCTP
末端转移酶+dGTP 载体和cDNA退火
加接头
CH3 CH3 CH3
3)第二链cDNA的合成
氢氧化钠消化杂合双链中的 mRNA 链 第一链 cDNA 的 3'-末端就会形成一个发夹环 合成第二链cDNA S1 核酸酶消化连接处
自身引导法合成cDNA第二链
常用方法PCR合成法是构建cDNA的一种新策略， 已得到广泛应用。优点：
1）它是以cDNA的第一条链为模板，设计并合成一组 引物，通过PCR扩增获得多拷贝双链cDNA,由于其 放大的高度灵敏性，PCR合成法能利用非常有限的 生物材料构建cDNA，特别适合低拷贝mRNA 的克隆。
DNA, HMW DNA）的提取； ③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size
selection）； ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ⑤ 重组克隆的挑高；二是去磷酸化好。
平均插入片段大小20kb
f= 20Kb/3×109 Kb
N=ln（1-p）/ln（1-f） =69构建程序包含 5 个部分：
① 载体的制备； ② 高纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight
2）同时，可用总mRNA作为合成cDNA第一链的模板， 不用纯化mRNA，所以避免了纯化过程中某些信息 分子的丢失。
3）PCR合成cDNA第二链是通过在第一链3’端同聚物 加尾的方法实现的，不会丢失其末端的最后几个核 苷酸，所以容易得到完整的cDNA。
cDNA文库的构建
cDNA文库的构建cDNA文库的构建基因文库的构建是现代生命科学研究中的一项重要技术。
自70年代初首例cDNA克隆问世以来，已用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了很多基因。
通过构建cDNA文库能直接分离到生命活动过程中的一些调控基因及了解这些基因所编码的蛋白质的相互作用关系．因此cDNA文库的构建是基因克隆的重要方法之一，从cDNA文库中可以筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。
它是发现新基因和研究基因功能的工具。
1.cDNA文库构建的原理真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。
真核生物的基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。
真核生物的基因不能直接在原核生物中表达，只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA （complementary DNA,cDNA）接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。
而且，真核细胞的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都常通过对其cDNA来进行研究。
为分离cDNA克隆或研究细胞的cDNA 谱，需要先构建cDNA文库。
所谓cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。
cDNA文库应包含的克隆数目可由以下公式来计算：N=ln(1-p)/ln(1-1/n)式中：N－cDNA文库所包含的克隆数目；P－低丰度cDNA存在于库中的概率，通常要求其大于99％；1/n－每一种低丰度mRNA占总mRNA的分数。
2.构建cDNA文库的基本步骤构建cDNA文库的基本步骤有五步：①制备mRNA；②合成cDNA；③制备载体DNA；④双链cDN 的分子克隆；⑤对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库包含的克隆数，抽查克隆的质量和异质性，如果需要可适当扩增。
对cDNA的文库的要求：一是希望文库能包括各种稀有mRNA的cDNA克隆；二是克隆的cDNA应是全长的，避免丢掉5’端的序列。
花生果皮全长cDNA文库的构建及初步分析
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全长cDNA文库及构建方法与应用进展
增侵袭性肿瘤细胞 的 : 并 鉴 定 和 检 测 基 因 表 达 特 征% 用 V T3#
万方数据
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第五章_cDNA文库的构建
3’
第二链合成
• 剩下的cDNA单链的3’末端可能形成一个弯回来的 双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条 cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。
5’
cDNA第一链 DNA聚合酶 cDNA第二链合成 cDNA第一链 cDNA第二链
5’ 3’
• 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA 中有用的序列被切掉）。
•λZapcDNA 载体
• 优点：
1、高的转染效率
2、可在体内用M13辅助噬菌体将其变为真核生物的 质粒表达载体。
• 含有一个真核启动子
•λZapcDNA 载杂交 1、已知氨基酸序列的相关简并密码子探针； 2、纯化蛋白质的相应抗体探针；
5’ 3’
cDNA第一链 cDNA第二链 核酸酶S1
5’ 3’
cDNA第一链 cDNA第二链
3’ 5’
cDNA 合成
缺点：合成 效率低;〈1% mRNA能合 成cDNA。
• 改进
• RNase H酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，
并将其降解成许多小片断。 • 小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎 片断。 • DNA聚合酶I能除去引物并修补后再使用DNA连接酶
基本原理：
• 许多真核生物的转录激活因子都是由两个结构上
可以分开的、功能上相互独立的结构域组成； • 应用重组DNA技术，可以将来自同一个转录因子的、 或者两种不同转录因子的结构域分开，分开的两 种结构域在体内重新组装成具有功能的转录因子，
从而激活UAS（上游激活序列）下游启动子调节的
报告基因的表达。
通常由以下原因造成:
• prey蛋白的非特异性结合；
• 无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录。
cdna文库构建流程
cDNA文库组标准流程一. Total RNA的提取 (2)二. mRNA的分离 (5)三．cDNA双链合成 (8)四．载体制备 (11)五. cDNA双链和载体的连接 (13)六．电转化流程 (14)七．快速鉴定、菌落PCR (16)八．pBlueScript cDNA库扩增 (18)一.Total RNA的提取1.试剂配制准备工作：1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。
2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃20mins 高压灭菌。
3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。
4、常用试剂及其配方：▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。
▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5三水合柠檬酸纳22.94g加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。
▲10%肌氨酸钠：肌氨酸钠10g加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。
▲变性裂解液：0.78M柠檬酸钠8.25ml10%肌氨酸钠12.375ml异硫氰酸胍118.05g加DEPC水定容至250ml，室温放置备用临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）▲2M 醋酸钠PH=4.5NaAc·3H2O 13.6g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用▲3M醋酸钠PH=5NaAc·3H2O 20.4g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用▲4M LiCL:LiCL 24.164g加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用▲0.5M EDTA PH=8.0EDTA 18.61g用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):MOPS 41.86gNaAC·3H2O 4.10g0.5MEDTA（PH 8.0）20ml用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。
《cDNA文库构建》
基因库是指某一生物群包选取其中任何一个基因克重组体形式贮存起来; ☆ 是理课件
(1)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes, BACs, fosmids)
基础：大肠杆菌F质粒 导入宿主：电转化 载体筛选：显性选择标记重组筛选：插入片段
大小供体DNA大小：>300kbp主要应用：大基因 组分析评论：低频率的重排和嵌合分子。载体 在每个细胞中维持一个或、噬菌体、粘粒和人工染色体 根据构建过程中是否对克隆进行过全长选择分为
普通cDNA和全长cDNA 依据第一链反转录引物不同分为随机引物c的构建整理课件主要内容
基因的概念及意义 cDNA基因的类型 几种cDNA的介绍 SMAR物类型全部基因的 集合，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。
点和端粒
中不相连的连续片段)；
不稳定(自发缺失)；
很难与酵母染色体分离；
PAC(P1 人工染色体) 细菌噬菌体 P1
100～300kb 稳定，但在细菌外难以维
BAC(细菌人工染色体) F 质粒
300kb
持
MACs(哺乳类人工染色 基于 Epstein-Barr 病 >300kb
体)
毒的游离载体
人类人工游离染色体(human artificial episomal chromosome,HAEC)是一类发展 中的 MACs,它来自于 Epstein-Barr 病毒
整理课件
根据基因类型（重组DNA片段的供体） 基因组 和cDNA1、基因组
★ 基因组(gene library)：用重组DNA
技术，将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后，然后转移到适当的宿主 细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克 隆），这些存在于所有重组P1载体和P1人工染色体(P1 artificial chromosomes, PACs)
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花生根全长cDNA文库的构建及分析
作者：陈华， 张冲， 蔡铁城， 邓烨， 郑奕雄， 庄伟建， CHEN Hua， ZHANG Chong， CAI Tie-cheng，DENG Ye， ZHENG Yi-xiong， ZHUANG Wei-jian
作者单位：陈华,张冲,蔡铁城,邓烨,庄伟建,CHEN Hua,ZHANG Chong,CAI Tie-cheng,DENG Ye,ZHUANG Wei-jian(福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福建福州,350002)， 郑奕雄,ZHENG Yi-xiong(福建省作物分子与细
胞生物学重点实验室,福建福州,350002;仲恺农业工程学院,广东广州,510225)
刊名：
中国油料作物学报
英文刊名：Chinese Journal of Oil Crop Sciences
年，卷(期)：2014,36(5)
引用本文格式：陈华.张冲.蔡铁城.邓烨.郑奕雄.庄伟建.CHEN Hua.ZHANG Chong.CAI Tie-cheng.DENG Ye.ZHENG Yi-xiong.ZHUANG Wei-jian花生根全长cDNA文库的构建及分析[期刊论文]-中国油料作物学报 2014(5)。