逆转录病毒载体
逆转录病毒感染法
细胞工程逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中扩增和表达。
因此，动物病毒载体是较理想的真核基因工程载体。
病毒DNA序列中有很强的启动子，可使其后方的外源基因高产量和高频率地表达。
常用的有杆状病毒载体、SV40载体、痘苗病毒载体、逆转录病毒载体等。
逆转录病毒载体的构建包装细胞重组逆转录病毒感染早期胚胎一、技术要点2.收集细胞3.病毒转导靶细胞4.目的基因整合并表达1.携带目的基因转移载体与包装载体共转染包装细胞 包装细胞 靶细胞联合显微注射技术，将克隆有外源目的基因的逆转录病毒载体注射入处于减数分裂中期Ⅱ的卵母细胞，培育转基因动物。
通过逆转录病毒载体获得基因小鼠♀ 8细胞胚 联合小鼠纯合转基因小鼠杂交、筛选植入代孕小鼠二、逆转录病毒感染法优缺点1.优点◆逆转录病毒可直接感染胚胎，把外源DNA引入细胞，且转移效率很高。
◆逆转录病毒载体DNA没有合成病毒蛋白的能力，所以被转化的宿主细胞不会再产生有害的病毒颗粒，在安全的情况下，能够合成目的基因的产物。
◆利用逆转录病毒作为目的基因载体，通过感染早期胚胎细胞实现基因的转移，产生嵌合体动物，再经过杂交、筛选即可获得转基因动物。
2.缺点◆低拷贝数◆需要逆转录病毒◆插入DNA大小有限◆可能产生不希望的重组◆逆转录病毒的序列可能干扰转基因表达思考题1. 逆转录病毒感染法的技术要点是什么？2. 逆转录病毒感染法联合显微注射技术如何培育转基因动物？3. 逆转录病毒感染法有什么优缺点？。
IRES逆转录病毒载体介导的外源基因在成纤维细胞表达的实验研究
墨鎏堕登奎兰苎主堕塞兰兰垡鲨苎Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓｈａｖｅｂｅｃｏｍｅｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｏｌｓｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｒｏｆｇｅｎｅｓｉｎｔｏｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍｅｅｎｔｒｙｓｉｔｅｓ）ｖｅｃｔｏｒｓｐｅｒｍｉｔｍｕｌｔｉｐｌｅｐｒｏｔｅｉｎｓｔｏｂｅｐｒｏｄｕｃｅｄｆｒｏｍａｓｉｎｇｌｅｖｅｃｔｏｒ，ａｓｉｎｇｌｅｍＲＮＡｉｓｔｒａｎｓｃｒｉｂｅ－ｂｅｄｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆａｎｕｐｓｔｒｅａｍｐｒｏｍｏｔｅｒ，ａｎｄｔｗｏｏｒｍｏｒｅｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｓａｒｅｔｒａｎｓｌａｔｅｄｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙｆｒｏｍａｓｉｎｇｌｅｍＲＮＡ．ＴｈｅｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｏｆｏｎｅＩＲＥＳ，ａｎｄｇｅｎｅｉｓｃａｐ·ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．ａｎｄｏｔｈｅｒｓａｒｅｔｒａｎｓｌａｔｅｄｕｎｄｅｒｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｈｅａｖｏｉｄｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｐｒｏｍｏｔｅｒｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＩＲＥＳｖｅｃｔｏｒｓｈａｖｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔａｄｖａｎｔａｇｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｓｍａｌｌｅｒｇｅｎｏｍｅ，ｈｉｇｈｅｒｖｉｒａｌｔｉｌｅｒａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｔｕｄｙ，ｔｗｏＩＲＥＳｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ—ｐｂＧＨｌｍｄｒａｎｄｐｈＧＭ－ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＩｎｔｈｉｓＣＳＦＩｔｋｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｇｅｎｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｕｔｉｌｉｚｉｎｇｔｈｅｍｄｒｌｇｅｎｅｏｒｔｈｅＨＳＶ－ｔｋｇｅｎｅａｓｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｓ．ＴｈｒｏｕｇｈｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｌｉｎｅｓｗｈｉｃｈｅｘｐｒｅｓｓｂＧＨａｎｄｈＧＭ－ＣＳＥＯｕｒｒｅｓｕｌｔｓｓｕｂｓｔａｎｔｉａｔｅｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｉｎｖＮｏｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ．ＰａｒｔｈＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｂｏｖｉｎｅｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅＩＲＥＳｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒａｎｄｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＮＩＨ３Ｔ３ｃｅｌｌａｎｄｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｌｕｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｃｅｌｌ２ＢＳＯｂｊｅｃｔ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈＩＲＥＳｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｔｏＣＯ—ｅｘｐｒｅｓｓｄｒｕｇ．ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｍｄｒｌｇｅｎｅｗｉｔｈｂｏｖｉｎｅｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ（ｂＧＨ）ｇｅｎｅｉｎｍｏｕｓｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｌｉｎｅＮＩＨ３Ｔ３ａｎｄｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｌｕｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｃｅｌｌ２ＢＳｔｈｒｏｕｇｈｉｎｖｉｔｒｏ７基因转移到哺乳动物细胞的实验研究，为人类基因治疗提供了先导技术，通过将有意义的外源性基因转移并整合到体内特异细胞的染色体内，用于治疗某些严重感染疾病、遗传病及体细胞基因病（如癌症、家族性心脏病和爱滋病等）的基因治疗将成为２１世纪治疗学的最新手段‘。
逆转录病毒载体
另外，国外已有学者将逆转录病毒载体应用于 生殖细胞研究，其意义更加深远，也为逆转录 病毒载体的研究打开了新思路，让机体从最初 就形成某些疾病的抗体。
用于腺苷脱胺酶缺陷症的治疗 1 9 9 0年， W． F r e n c h A n d e r s o n在 美国实施的第一例基因治 疗就是应用逆转录 病毒载体治疗腺苷脱氨酶缺陷症( A D A) 。腺 苷脱氨酶( A D A) 缺乏症是一种严重的免疫缺 陷症， 腺苷脱氨酶的缺乏可使 T淋巴细胞因该 酶缺乏后一些代谢产物的累积而死亡 ， 从而 导致严重的联合性免疫缺陷症( S C I D) 。手 术 取得了良好的效果， 术后并没有发现患者 的不良反应。
将收集的病毒颗粒感染靶细胞就可以将目的基 因整合到靶细胞染色体上， 基因活性得到表 达。而目的基因可以通过细胞分裂传给下一代 子细胞。永久稳定地表达目的蛋白。
应用
用于基因治疗 外源基因表达
基因治疗
逆转录病毒载体无疑是在基因治疗中传递目的 基因最有效的运载工具， 广泛应用于人类基 因治疗的研究中。应用逆转录病毒载体， 携 带所要表达的目的基因， 可以用于基因相关 疾病的检测及治疗。
RN A 干扰 简单地说， RNA干扰是指一种分子生物学上 由双链 RNA 诱发的基因沉默现象。 逆转录病毒载体介导的 R N A i 技术可以长期 稳定表达siRNA ,从而实现基因的稳定沉默。
问题
对环境条件要求高 在不适条件下，重组逆转 录病毒会失去其感染能力，因此 ，保持逆转 录病毒的存在最适条件是非常关键的。
应用机理
这种病毒表达载体是将 g a g 、 p o l 、 e n v 等三个基因的大部分或全部除去， 由于没有 g a g 、 p o l 、 e n v三个基因的存在而不能够 产生有感染性的病毒颗粒， 因此， 人们又设 计出了一种特殊的包装细胞株。
三大类病毒表达载体
逆转录病毒载体系统
杰特伟
选用的背景：由于重组腺病毒对于一些细胞类型难以转染，比如
各种类型的原代细胞、体内细胞，同时希望基因永久性表达，即将基 因整合入靶细胞的基因组中，此时可以考虑选用逆转录病毒。
逆转录病毒简介： 反转录病毒载体是常用的病毒载体之一，是
由具有感染性的小鼠的白血病病毒改造而来，能将非病毒基因导入细 胞体内或体外进行有丝分裂。这些载体能产生病毒基因组的单一拷贝 并高效准确地整和到宿主染色体 。
杰特伟杰特伟基因载体系统基因载体系统病毒载体系统病毒载体系统非病毒载体系统非病毒载体系统腺病毒载体体腺病毒载反转录病毒载体体反转录病毒载腺伴随病毒载体体腺伴随病毒载单纯疱疹病毒载体体单纯疱疹病毒载慢病毒载体体慢病毒载裸裸dnadnadna阳离子脂质复合物dna阳离子脂质复合物dna蛋白质复合物dna蛋白质复合物细胞内包装细胞内包装细胞外包装细胞外包装dna阳离子多聚物dna阳离子多聚物dnarna嵌合物dnarna嵌合物杰特伟杰特伟公司相应的病毒表达载体质粒sirna表达载体去除去除cmv启动子动子和和egfp荧启光蛋白光蛋白质粒较小质粒较小最好最好使用使用的的荧rnai质粒之一质粒之一杰特伟杰特伟质粒sirna表达载体cmv启动子动子和和egfp荧启光蛋白光蛋白荧杰特伟杰特伟诱导性的sirna表达启动子四环素四环素强力霉素强力霉素杰特伟杰特伟teton基因表达系统的小常识gossen等构建了受四环素负调节的teton基因表达系统
常用的病毒载体的特点：
杰特伟
病毒载体
反转录病毒载体 单链 RNA 病毒 8~10kb
腺病毒载体 双链 DNA 病毒 36kb
A AV 病 毒 载 体 单链 DNA 病毒 ~5kb
HSV 病 毒 载 体 双链 DNA 病毒 152kb
逆转录病毒包装系统
逆转录病毒包装系统时间：2009-07-31 13:46:30 来源：生物无忧作者：51atgc点击：1488次一、逆转录病毒概述反转录病毒是RNA病毒，但有反转录酶，可使RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。
逆转录病毒即RNA病毒，需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。
逆转录病毒是RNA病毒，它有三个基因：gag-编码病毒的核心蛋白；pol-编码逆转录酶；env-编码病毒的被膜糖蛋白。
二、逆转录病毒的许多特点便于其发展成为动物基因克隆载体。
①就目前所知，在大多数情况下，逆转录病毒的肿瘤基因（oncogene，ONC）都能够在细胞中转录。
这种特性说明逆转录病毒有可能是一种天然的转录因子，同时根据这种特性，可以在正常细胞中进行操作，将它改建为有用的动物基因转移载体。
②逆转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物，其中有的还能够在人体细胞中生长；③逆转录病毒不但感染效率高，而且通常不会导致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和保持病毒感染性的能力。
逆转录病毒载体最大优点是(1) 转染范围广，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等;(2) 转入的外源基因可完全整合(3) 对细胞感染率高，达到100 %(4) 感染细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因三、逆转录病毒载体的包装原理逆转录病毒载体系统共由两部分组成：包装细胞系和缺陷病毒本身。
在逆转录病毒载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号，通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。
当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配,该病毒颗粒可感染其他宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。
备课素材：逆转录病毒载体 高二下学期生物人教版选择性必修3 (1)
逆转录病毒载体2019版高中生物学选择性必修三说，通常是利用质粒作为载体（vector），将基因送入细胞：基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。
其构建目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
载体（Vector）作用，一是用它作为运载工具，将目的基因转移到受体细胞中去；二是利用它在受体细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。
最终在受体细胞中表达大量目的基因产物，经分离纯化被人们利用。
作为载体必须具有四个条件：①在受体细胞中能保存下来并能大量复制；②有一个至多个限制酶切点，而且每种酶切位点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；③有一定的标记基因，便于进行筛选。
如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。
④对受体细胞无害。
一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。
现今实际所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。
常用的载体主要有两类：一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于拟核区DNA之外的环状DNA(一般有1～200 kb左右，kb为千碱基对)，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。
质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌拟核DNA中，随着拟核DNA的复制而复制。
另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。
除以上两类外，人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。
原因是它们有双链DNA分子，可以与目的基因进行连接。
而目前基因工程中常以逆转录病毒作为载体，其优点是逆转录病毒作为载体时可以将外源基因插入到受体细胞染色体，使外源基因随染色体DNA的复制而复制，并进行表达。
逆转录病毒载体介导DNA转染
逆转录病毒载体介导DNA转染关键词：逆转录病毒载体DNA转染2012-10-09 00:00 来源：丁香园点击次数：164逆转录病毒载体属RNA病毒，但可在受染细胞内反转录产生DNA互补链，此DNA单链可作为模板合成第二条DNA链，第二条DNA链可掺入细胞基因组DNA中。
此病毒可利用宿主细胞的酶自行转录与复制，RNA可合成蛋白，再包装病毒，RNA从胞内释放，成为感染性病毒，该载体可经不同方式改变。
介导过程可使病毒单拷贝基因组稳定地进入细胞。
首先，逆转录病毒的繁殖必须要有适当的包装细胞系，以利于产生高滴度的病毒，同时还具有适当的结构。
如：ψ2(第一代包装细胞)，PA317(第二代包装细胞)，ψ1-CRIP、PG13、DA、CFA(第三代包装细胞)，包装细胞可提供逆转录病毒gag、pol和env蛋白才能使带有包装信号及目的基因的病毒载体RNA进行包装，包装细胞只提供gag、pol和env蛋白而不产生具有复制能力的野生型病毒(RCR)，而第一代包装细胞可产生RCR，安全性较差；第二代包装细胞，临床上已广泛应用，也未发现产生RCR，安全性好；第三代包装细胞更加安全，第三代包装细胞中主要区别是病毒结构基因中env不同。
反转录病毒作为基因转移的载体有如下特点：①反转录病毒感染细胞的效率高，基因转移率在10%-100%；②病毒基因转移能将外源基因整合到宿主细胞基因组中外源基因能稳定存在而不丢失；③外源基因整合的拷贝数一般只有一个；④反转录病毒只选择感染分裂细胞；⑤病毒可容纳外源基因的DNA长度为<8Kb。
反转录病毒载体的结构：已切除了病毒的结构基因gag，大部分pol和env，包括两侧的LTR，被选择(标记)基因和目的基因插入的多聚位点所取代，同时还带有包装信号ψ。
(一)可产生特异性逆转录病毒细胞系的建立1、逆转录病毒载体进入包装细胞系从细胞质粒中产生感染性病毒包括将质粒导入包装细胞系，可从稳定感染细胞中选择病毒产生细胞或用一个包装细胞系暂时产生的病毒感染另一种有不同包装的细胞系，从中选择病毒的产生细胞。
逆转录病毒包装
逆转录病毒（Retrovirus）是一类RNA病毒。
在逆转录酶的作用下，以病毒RNA为模板合成cDNA，再通过DNA复制、转录、翻译等过程形成病毒颗粒。
逆转录病毒表达系统是一种新的重组蛋白高效表达系统，由逆转录病毒载体、辅助载体（表达病毒包装需要的蛋白质）和包装细胞系组成。
逆转录病毒载体在外源基因表达、基因沉默、基因治疗、生物制药等得到广泛的应用。
逆转录病毒载体主要优点：转染范围广，可以感染各种细胞类型,如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等；转入的外源基因可完全整合；对细胞感染率高；感染细胞不产生病变,可建立细胞系长期持续表达外源基因。
逆转录病毒载体系统共由两部分组成：包装细胞系和缺陷病毒本身。
在逆转录病毒载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号，通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。
当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配，该病毒颗粒可感染其他宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。
宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录病毒提供结构蛋白，因而在宿主细胞内不会产生新的感染性病毒颗粒，保证了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。
服务内容
将目的基因片段克隆到逆转录病毒载体上；逆转录病毒的包装、扩增、滴度的测定。
客户提供
样品；目的基因信息或者序列。
我们提供
含有目的基因片段的逆转录病毒；所用的引物序列、测序结果；详尽完整的实验报告。
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逆转录病毒载体
逆转录病毒的许多特点使其成为基因转移载体的最佳选择。
它可有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。
病毒基因组以转座的方式整合，其基因组不会发生重排，因此所携带的外源基因也不会改变。
逆转录病毒属RNA病毒，通过其本身逆转录酶的作用，形成双链DNA原病毒,然后整合于宿主细胞染色体中。
逆转录病毒是一类正链RNA病毒，其分为顺式功能基因和反式功能基因。
由于逆转录病毒包膜上有env 编码的糖蛋白能被许多哺乳动物细胞膜上特异性受体所识别，并能介导逆转录病毒的遗传物质高效地进入宿主细胞内；同时逆转录病毒结构基因gag、env 和pol的缺乏不影响其他部分的活性，因此可用外源性基因代替这部分病毒基因，外源性基因最大容量为8.0kb左右，可适用于大部分目的基因；并且病毒在自身表达的整合酶催化作用下可高效地整合入宿主细胞染色体中，这有利于外源基因在宿主细胞的永久表达。
构建载体时以DNA原病毒为基础，将野生型病毒的3类结构基因gag，pol和env删除，以供外源基因的插入，但是要保存病毒的包装序列（ψ）和双侧的长末端重复（LTR），LTR含有启动子、增强子、整合信号及poly A信号等多种元件。
插入的基因一般为两种或两种以上，如目的基因和标记基因。
因此和逆转录病毒结合的是DNA。
将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。
通过此方法，得到了转基因鸡和转基因牛。
这种逆转录病毒被用重组DNA技术修饰后作为基因载体在应用中优于微注射法之处为：无需要重排，可在整合点整合转移基因的单个拷贝；将胚胎置于高浓度病毒容器中，或者与被感染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘里，整合有逆转录病毒的DNA的胚胎率高。
缺点是：需要生产带有转基因的逆转录病毒；插入逆转录病毒的基因有
一定的大小限度；所得转基因家畜的嵌合性很高，而需要广泛的杂交，以建立转基因系；转基因的表达问题尚未解决。