逆转录病毒载体
逆转录病毒载体
逆转录病毒的许多特点使其成为基因转移载体的最佳选择。它可有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。病毒基因组以转座的方式整合，其基因组不会发生重排，因此所携带的外源基因也不会改变。逆转录病毒属RNA病毒，通过其本身逆转录酶的作用，形成双链DNA原病毒,然后整合于宿主细胞染色体中。
逆转录病毒是一类正链RNA病毒，其分为顺式功能基因和反式功能基因。由于逆转录病毒包膜上有env 编码的糖蛋白能被许多哺乳动物细胞膜上特异性受体所识别，并能介导逆转录病毒的遗传物质高效地进入宿主细胞内；同时逆转录病毒结构基因gag、env 和pol的缺乏不影响其他部分的活性，因此可用外源性基因代替这部分病毒基因，外源性基因最大容量为8.0kb左右，可适用于大部分目的基因；并且病毒在自身表达的整合酶催化作用下可高效地整合入宿主细胞染色体中，这有利于外源基因在宿主细胞的永久表达。构建载体时以DNA原病毒为基础，将野生型病毒的3类结构基因gag，pol和env删除，以供外源基因的插入，但是要保存病毒的包装序列（ψ）和双侧的长末端重复（LTR），LTR含有启动子、增强子、整合信号及poly A信号等多种元件。插入的基因一般为两种或两种以上，如目的基因和标记基因。因此和逆转录病毒结合的是DNA。
将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。通过此方法，得到了转基因鸡和转基因牛。
这种逆转录病毒被用重组DNA技术修饰后作为基因载体在应用中优于微注射法之处为：无需要重排，可在整合点整合转移基因的单个拷贝；将胚胎置于高浓度病毒容器中，或者与被感染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘里，整合有逆转录病毒的DNA的胚胎率高。缺点是：需要生产带有转基因的逆转录病毒；插入逆转录病毒的基因有
一定的大小限度；所得转基因家畜的嵌合性很高，而需要广泛的杂交，以建立转基因系；转基因的表达问题尚未解决。
腺病毒和反转录病毒载体及其在基因治疗中的应用进展-文献综述
腺病毒和反转录病毒载体及其在基因治疗 中的应用进展 （南京农业大学生命科学学院生命基地111班） 摘要：本文首先介绍了最应用最广泛的Baltimore病毒分类系统，然后引用最新的The Journal of Gene Medicine的数据，展示了最新的基因治疗和载体情况，最后对腺病毒和反转录病毒在基因治疗中尤其是在临床医学治疗中的近年来应用情况。 关键词：腺病毒载体；反转录病毒载体；基因治疗 Adenovirus and retrovirus vectors and advances of their application in gene therapy (College of Life Sciences,Nanjing Agricultural University) Abstract:This paper first introduced the most popular Baltimore virus classification system.Then,I cited data statistical data from The Journal of Gene Medicine, in order to show how gene therapy and vectors for it have developed. At last,I reviewed the up to date application of different adenovirus and retrovirus vectors in gene therapy, especially in clinical application. Key words: adenovirus vectors; retrovirus vectors;gene therapy 病毒载体是基础生物学研究中常用的遗传物质传递的载体。随着对病毒的遗传机制和致病机理的深入研究，越来越多的病毒载体被用于人类疾病的诊断和治疗。病毒载体应用于基因诊断有曲折的历史。起初被认为在充分了解病毒的分子和遗传机理的情况下，可用于之治疗任何疾病。但是，1999年，宾夕法尼亚大学用经改造的腺病毒载体治疗一位18岁患有鸟氨酸转氨嫁酰酶部分缺失症男性，导致病人死亡；2002-2003年MLV载体在被用于治疗患有人类联合免疫缺陷症XI时，导致部分病人出现了类似白血病的病症[1]。以上问题都归因于对病毒载体和宿主之间的相互作用不了解。自此，人们开始更加注重对载体生物学和药理学的研究。过去的十多年时间里，人们花了大量的精力研究病毒载体和其与宿主的互作，本文着重讨论近年来在基因诊疗中腺病毒和反转录病毒载体应用的进展情况。 1病毒载体和基因治疗 1.1 病毒分类 Baltimore分类系统根据病毒的核酸类型、核酸链的类型（单链或双链）、正负链和复制类型将病毒分为七类： 表1：Baltimore分类系统 ds:双链；ss:单链 基因治疗首先被设计应用于遗传性单基因疾病[2]，如今获得性疾病例如癌症[3]、心血管
慢病毒载体,稳定表达
慢病毒载体，稳定表达 一、慢病毒 逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。 慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。 最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。 慢病毒结构： 2个调节基因： （1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。 （2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。 4个辅助蛋白（附属）基因： （1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生； （2）vpr和nef参与疾病的表现。 慢病毒的优势： 1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因； 2.可感染分裂和非分裂细胞； 3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验； 4.可以更换特异性启动子； 5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；
二、慢病毒载体 慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。 慢病毒包装过程： 慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。 慢病毒包装和侵染细胞的过程（元和生物） 三、慢病毒的使用和优势 慢病毒的使用量的取决因素：滴度，感染体积，MOI ，细胞密度 滴度（Titer）：单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。单位：TU/mL （活性滴度单位）、copies/mL （物理滴度单位） 检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。 实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。 图3 MOI（multiplicity of infection）：感染复数或者复感染指数。指感染时病毒和细胞数量的比值。在实验中也将某个细胞达到80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。 最后，818 一些有关慢病毒方面的产品： 1.关于慢病毒载体构建方面： ORF表达克隆产品【LPP-货号-载体-100，ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】 shRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，shRNA慢病毒】 miRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，miRNA/inhibitor慢病毒】
逆转录病毒载体
逆转录病毒载体 逆转录病毒的许多特点使其成为基因转移载体的最佳选择。它可有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。病毒基因组以转座的方式整合，其基因组不会发生重排，因此所携带的外源基因也不会改变。逆转录病毒属RNA病毒，通过其本身逆转录酶的作用，形成双链DNA原病毒,然后整合于宿主细胞染色体中。 逆转录病毒是一类正链RNA病毒，其分为顺式功能基因和反式功能基因。由于逆转录病毒包膜上有env 编码的糖蛋白能被许多哺乳动物细胞膜上特异性受体所识别，并能介导逆转录病毒的遗传物质高效地进入宿主细胞内；同时逆转录病毒结构基因gag、env 和pol的缺乏不影响其他部分的活性，因此可用外源性基因代替这部分病毒基因，外源性基因最大容量为8.0kb左右，可适用于大部分目的基因；并且病毒在自身表达的整合酶催化作用下可高效地整合入宿主细胞染色体中，这有利于外源基因在宿主细胞的永久表达。构建载体时以DNA原病毒为基础，将野生型病毒的3类结构基因gag，pol和env删除，以供外源基因的插入，但是要保存病毒的包装序列（ψ）和双侧的长末端重复（LTR），LTR含有启动子、增强子、整合信号及poly A信号等多种元件。插入的基因一般为两种或两种以上，如目的基因和标记基因。因此和逆转录病毒结合的是DNA。 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。通过此方法，得到了转基因鸡和转基因牛。 这种逆转录病毒被用重组DNA技术修饰后作为基因载体在应用中优于微注射法之处为：无需要重排，可在整合点整合转移基因的单个拷贝；将胚胎置于高浓度病毒容器中，或者与被感染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘里，整合有逆转录病毒的DNA的胚胎率高。缺点是：需要生产带有转基因的逆转录病毒；插入逆转录病毒的基因有
病毒转染原理及步骤
病毒转染原理及步骤 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。以慢病毒为例。 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来 的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 一、慢病毒载体构建原理： 慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。对进行稳转细胞株的筛选，为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液提供基础。 二、慢病毒载体构建及包装流程： （一）实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD 酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因 CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装 入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化
慢病毒载体构建步骤
慢病毒载体构建步骤 一、简介慢病毒〔Lentivirus〕载体是以HIV-1〔人类免疫缺陷I型病毒〕为根底发展起来的基因治疗载体.区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞 均具有感染水平.慢病毒载体的研究开展得很快,研究的也非常深入.该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而到达持久性表达.目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中.由于有些类型细胞脂质体转染效果差,转移到细胞内的siRNA半衰期短,体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的,因而使其应用受到较大的限制.采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体,然后转 移到细胞内转录siRNA的策略,不但使脂质体有效转染的细胞种类增加,而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA,在长期稳定表达载体的细胞中,甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用.慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病 毒,在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA, 实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默,为在 原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能,以及产生特定基因表达降 低的动物提供了可能性.慢病毒作为siRNA的携带者,不但具备特异性地使基因表达沉默的水平,而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势,为基因功能的研究提供了更强有力的工具.在所构建的siRNA表达载体中,是由RNA聚合酶田启动子来指导RNA合成的,这是由于RNA聚合酶田有明确的起始和终止序列,而且合成的RNA不会带polyA尾.当RNA聚合酶田遇到连续4个或5个T时,它指导的转录就会停止,在转录产物3'端形成1~4个U.U6和H1RNA启动子是两种RNA 聚合酶田依赖的启动子,具特点是启动子自身元素均位于转录区的上游,适合于表达〜21ntRNA 和〜50ntRNA茎环结构〔stemloop〕.在siRNA表达载体中,构成siRNA的正义与反义链,可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA;也可由载体直接表达小发卡状RNA 〔smallhairpinRNA,shRNA〕,载体包含位于RNA聚合酶ID启动子和4~5T转录终止位点之间的茎环结构序列,转录后即可折叠成具有1〜4个U3'突出端的茎环结花在细胞内进一步加工成siRNA. 构建载体前通常要通过合成siRNA的方法,寻找高效的siRNA,然后从中挑选符合载体要求的序列,将其引入siRNA表达载体〔筛选〕.二、实验流程〔大致的简单过程〕慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息.慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白.为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体〔自己构建〕和包装质粒〔购入〕同时共转染细 胞,在293T细胞〔购入〕中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整
逆转录病毒包装系统
逆转录病毒包装系统 时间：2009-07-31 13:46:30 来源：生物无忧作者：51atgc点击：1488次 一、逆转录病毒概述 反转录病毒是RNA病毒，但有反转录酶，可使RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。逆转录病毒即RNA病毒，需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。逆转录病毒是RNA病毒，它有三个基因：gag-编码病毒的核心蛋白；pol-编码逆转录酶；env-编码病毒的被膜糖蛋白。 二、逆转录病毒的许多特点 便于其发展成为动物基因克隆载体。①就目前所知，在大多数情况下，逆转录病毒的肿瘤基因（oncogene，ONC）都能够在细胞中转录。这种特性说明逆转录病毒有可能是一种天然的转录因子，同时根据这种特性，可以在正常细胞中进行操作，将它改建为有用的动物基因转移载体。②逆转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物，其中有的还能够在人体细胞中生长；③逆转录病毒不但感染效率高，而且通常不会导致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和保持病毒感染性的能力。 逆转录病毒载体最大优点是 (1) 转染范围广，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等; (2) 转入的外源基因可完全整合 (3) 对细胞感染率高，达到100 % (4) 感染细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因 三、逆转录病毒载体的包装原理 逆转录病毒载体系统共由两部分组成：包装细胞系和缺陷病毒本身。在逆转录病毒载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号，通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配,该病毒颗粒可感染其他宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录病毒提供结构蛋白，因而在宿主细胞内不会产生新的感染性病毒颗粒,保证了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。 四、逆转录病毒包装程序 1、接种293细胞 2、磷酸钙转染：编码逆转录病毒载体、逆转录病毒结构基因质粒（是病毒颗粒形成、复制所必需的病毒结构蛋白基因）共导入293细胞
病毒载体技术在基因治疗中的应用
病毒载体技术在基因治疗中的应用 基因治疗是一种利用基因工程技术来治疗疾病的新兴领域。它通过将健康基因 导入患者体内，修复或替代缺陷基因，从而实现疾病的治愈或缓解。然而，基因治疗的成功与否很大程度上取决于有效的基因传递系统，而病毒载体技术成为了当前最具潜力的传递工具之一。 病毒载体是指利用病毒作为基因传递的工具，将所需基因载入病毒颗粒中，通 过感染宿主细胞将基因导入宿主细胞内。病毒载体技术的优势在于其高效、特异性和稳定性。在基因治疗中，常见的病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒和腺相关病毒等。 腺病毒是最常用的病毒载体之一。它具有良好的基因传递效率和生物安全性。 腺病毒通过感染宿主细胞，将基因导入宿主细胞核内，使得基因能够被宿主细胞所表达。此外，腺病毒还能够感染多种细胞类型，包括非分裂细胞，因此在基因治疗中具有广泛的应用前景。 逆转录病毒也是常用的病毒载体之一。逆转录病毒通过将RNA基因转录成DNA，并将其导入宿主细胞核内，实现基因的表达。逆转录病毒在基因治疗中的 应用主要集中在基因修复和基因敲除等方面。通过逆转录病毒载体，可以实现对患者体内缺陷基因的修复或替代，从而达到治疗疾病的目的。 腺相关病毒是一类天然存在于人体中的病毒，其基因组较小，具有良好的基因 修饰能力。腺相关病毒通过感染宿主细胞，将基因导入宿主细胞核内，并在宿主细胞内稳定表达。腺相关病毒在基因治疗中的应用主要包括基因修复、基因敲除和基因表达等方面。由于其较小的基因组，腺相关病毒在基因修饰方面具有独特的优势。 尽管病毒载体技术在基因治疗中具有巨大的潜力，但其应用仍面临一些挑战。 首先，病毒载体可能引起免疫反应，导致治疗效果下降。其次，病毒载体的基因传
逆病毒感染
逆转录病毒载体简介 逆转录病毒载体介导DNA转染技术 逆转录病毒载体属RNA病毒，但可在受染细胞内逆转录产生DNA互补链，此DNA单链可作为模板合成第二条DNA链，第二条DNA链可掺入细胞基因组DNA中。此病毒可利用宿主细胞的酶自行转录与复制，RNA可合成蛋白，再包装病毒，RNA 从胞内释放，成为感染性病毒，该载体可经不同方式改变。介导过程可使病毒单拷贝基因组稳定地进入细胞。 首先，逆转录病毒的繁殖必须要有适当的包装细胞系，以利于产生高滴度的病毒，同时还具有适当的结构。如：ψ2（第一代包装细胞），PA317（第二代包装细胞），ψ1-CRIP、PG13、DA、CFA（第三代包装细胞），包装细胞可提供逆转录病毒gag、pol和env蛋白才能使带有包装信号及目的基因的病毒载体RNA进行包装，包装细胞只提供gag、pol和env蛋白而不产生具有复制能力的野生型病毒（RCR），而第一代包装细胞可产生RCR，安全性较差；第二代包装细胞，临床上已广泛应用，也未发现产生RCR，安全性好；第三代包装细胞更加安全，第三代包装细胞中主要区别是病毒结构基因中env不同。 逆转录病毒作为基因转移的载体有如下特点： (1) 逆转录病毒感染细胞的效率高，基因转移率在10%-100%； (2) 病毒基因转移能将外源基因整合到宿主细胞基因组中外源基因能稳定存在而不丢失； (3) 外源基因整合的拷贝数一般只有一个； (4) 逆转录病毒只选择感染分裂细胞； (5) 病毒可容纳外源基因的DNA长度为<8Kb。 逆转录病毒载体的结构：已切除了病毒的结构基因gag，大部分pol和env，包括两侧的LTR，被选择（标记）基因和目的基因插入的多聚位点所取代，同时还带有包装信号ψ。 可产生特异性逆转录病毒细胞系的建立 逆转录病毒载体介导DNA转染技术 (一) 逆转录病毒载体进入包装细胞系 从细胞质粒中产生感染性病毒包括将质粒导入包装细胞系，可从稳定感染细胞中选择病毒产生细胞或用一个包装细胞系暂时产生的病毒感染另一种有不同包装的细胞系，从中选择病毒的产生细胞。 1. 准备工作（用品） (1) 适当的包装细胞系及培养液。 (2) 大多数包装细胞系为鼠源的，含有鼠“Helpe病毒”，此病毒可帮助被去除某些功能结构基因的逆转录病毒复制，并包装于蛋白衣壳中。 (3) 逆转录病毒质粒DNA常构建成含有抗药基因neo新霉素基因的载体。 (4) Hepes-缓冲液（HeBs） (5) 2mol/L CaCl2
腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒的区别优缺点及应用场景
腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒的区别优缺点及应 用场景 前言：病毒系统知识点get，四种主流基因转导病毒工具：腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒的区别优缺点及应用场景 随着病毒生物学的发展，种类繁多的病毒载体已越来越成为向各种实验系统（如细胞系、原代细胞、组织脏器等）转运核酸的重要工具。除了在实验室的组织培养和动物模型生产中发挥重要作用，它们还被用于治疗遗传性疾病的临床试验中。目前主流的病毒载体系统主要包括慢病毒（LV）、（γ-）逆转录病毒（RV）、腺病毒（Ad）和腺相关病毒（AAV）。我们分述之。 慢病毒和逆转录病毒均属于逆转录病毒科。其典型特征为其RNA 基因组能逆转录为 cDNA 副本，cDNA 副本又能稳定整合至宿主细胞基因组中（这就是常说的稳转）。逆转录病毒通常分两种：简单的（有时又称为致癌病毒或γ- 逆转录病毒，如鼠白血病病毒）和复杂的（如慢病毒）。这些亚型间主要的差异在于复杂的逆转录病毒存在一些附属基因和调控基因，而简单的则没有（下文有进一步的讨论）。这两类病毒颗粒都含有两份正链RNA，RNA 上附有病毒反转录酶（RT），它们位于病毒的内核（图1）。位于内核的还有结构蛋白和酶，包括核壳（NC）、衣壳（CA）、整合酶（IN）和蛋白酶（PR）。内核由一圈外周蛋白层包围，外周蛋白包括基质蛋白（MA），基质蛋白又被来源于宿主细胞细胞膜插有包膜糖蛋白的腹膜所包围。
图1. 简单和复杂逆转录病毒粒子结构。病毒颗粒含有两份正链RNA，RNA 上附有反转录酶（RT），它们位于病毒的内核。除此之外，内核还包含核壳（NC）、衣壳（CA）、整合酶（IN）和蛋白酶（PR）。内核由一圈基质蛋白（MA）所包围，基质蛋白又被来源于宿主细胞细胞膜插有包膜糖蛋白（ENV）的腹膜所包围。图片来源：汉恒生物 实验室常用的慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA 干扰、microRNA 研究以及活体动物实验中。在整合宿主基因组过程中，逆转录病毒（比如MLV）通常大约 20% 的感染事件发生在转录单位的 5' 端，对 CpG 岛和 DNase I 超敏感位点附近有一定的倾向性。而慢病毒载体多整合到远离转录起始点的位点。因此，与逆转录病毒载体相比，慢病毒载体似乎致癌可能性较低，临床应用可能更安全。重组腺病毒（Adenovirus，Ad）载体系统是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。重组腺病毒具有以下几个显著的优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织；感染效率高达100%，全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染；对外源基因容载能力大（可以高达8Kb）；不整合基因组；滴度高，操作方便。因此，重组腺病毒是最具有潜力的一种基因递送工具。目前常用
病毒包装实验整体流程及原理(慢病毒、腺病毒)
广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务，病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA/miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。? 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、-80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒 1.2.1原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1和E3缺失)的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA的腺病毒载体 2）采用PacI消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较
重组逆转录病毒双表达载体的构建及其对K562细胞增殖活性的影响
重组逆转录病毒双表达载体的构建及其对K562细胞增殖活性 的影响 重组逆转录病毒双表达载体的构建及其对K562细胞增殖活性的影响 目的构建针对慢性粒细胞白血病bcr-abl b3a2型mRNA的双表达逆转录病毒载体,初步探讨其对K562细胞表型的影响.方法以逆转录病毒载体pMSCV-neo为骨架,构建eGFP及针对bcr-abl b3a2型mRNA的反义RNA双表达载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40AS,同时构建对照载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40S和pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL80AS,酶切及测序鉴定各重组载体;以脂质体法转染各载体到PT67包装细胞后,G418筛选稳定的病毒产生细胞株,再以NIH3T3细胞测定病毒滴度并感染K562细胞,计数细胞数绘制细胞生长曲线,FCM检测细胞凋亡情况、并用Western blot检测PKR激活情况.结果酶切及测序结果证实各重组载体构建完全正确;G418筛选到高滴度重组逆转录病毒生产细胞株:PT67-MSCV/GFP、PT67-40as、PT67-40s和PT67-80as,且PT67-40as上清感染组K562细胞生长受抑制,其24 h 时早期细胞凋亡率为22.54±3.19%,与除PT67-80as组外的其余各组相比有显著差异(P＜0.05);PT67-40as和PT67-80as处理组细胞PKR 磷酸化水平分别增高了59.20%和60.33%,2AP能抑制PT67-40as的作用.结论成功构建重组逆转录病毒双表达载体,并发现其能抑制K562细胞生长并引起细胞凋亡,通过激活PKR抗肿瘤可望成为肿瘤新的靶向治疗策略. 作者：曾建明冯文莉王小中赵世巧白卫君罗云萍温健萍涂植光黄宗干 ZENG Jian-ming FENG Wen-li WANG Xiao-zhong ZHAO Shi-qiao BAI Wei-jun LUO Yun-ping WEN Jian-ping TU Zhi-guang HUANG Zong-gan 作者单位：曾建明,冯文莉,王小中,赵世巧,白卫君,罗云萍,ZENG Jian-ming,FENG Wen-li,WANG Xiao-zhong,ZHAO Shi-qiao,BAI Wei-jun,LUO Yun-ping(重庆医科大学临床血液学教研室,临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室,重庆,400016)
慢病毒包装原理-介绍
慢病毒包装系统简介及应用 一、慢病毒包装简介及其用途 慢病毒（Lentivirus ）载体是以HIV-1 （人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基 因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA 表达载体中，是由RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA 合成的，这是因为RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA 不会带poly A 尾。当RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续4 个或5 个T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物3' 端形成1~4 个U 。U6 和H1 RNA 启动子是两种RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA 和～50ntRNA 茎环结构（stem loop ）。在siRNA 表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA 聚合酶Ⅲ启动子和4 ～5 T转录
逆转录病毒载体介导的SynNotch门控系统构建
逆转录病毒载体介导的SynNotch门控系统构建 张野;陈静;王佩佩;林伟;王建勋 【期刊名称】《山东医药》 【年(卷),期】2022(62)15 【摘要】目的构建一种逆转录病毒载体介导的SynNotch门控系统。方法对逆转录病毒载体进行设计改造,在其两端插入绝缘子序列(insulator),并基于Gal4/UAS 基因表达调控系统进行SynNotch门控系统的构建。首先采用逆转录病毒载体分别构建仅含有Gal4-VP64融合蛋白转录调控元件的门控质粒以及含有UAS激活序列的效应质粒,效应质粒使用绿色荧光蛋白(EGFP)及荧光素酶(luciferase)作为报告基因,共分为6种,其中三种为正向序列设计,将UAS序列以及报告基因正向插入逆转录病毒载体中(5’~3’),分别包括正向无绝缘子、正向单绝缘子、正向双绝缘子;另三种为反向序列设计,将UAS序列以及报告基因反向插入逆转录病毒载体中(3’~5’),分别包括反向无绝缘子、反向单绝缘子、反向双绝缘子。测序成功的质粒进一步通过病毒包装制备病毒载体,包括门控载体和效应载体。PCR法检测逆转录病毒滴度。将病毒载体转导入293T细胞,效应载体单独转导的293T细胞作为未诱导组,门控载体与效应载体共转导的293T细胞作为诱导组,分别通过流式细胞术及荧光素酶化学发光实验检测两组报告基因的表达效率。结果逆病毒载体滴度均在107~108拷贝/mL之间,且不低于阳性对照。流式细胞术的检测结果显示,正向设计的三种效应载体在未诱导的情况下EGFP的表达效率分别为95.5%、69.7%、76.2%,诱导后EGFP的表达效率分别为99.9%、95.3%、97.1%。反向设计的三种效应载体在未诱导的情况下EGFP的表达效率分别为0.085%、0.610%、7.400%,诱导后EGFP的表达效率分别为59.900%、77.900%、89.500%。荧光素酶化学
病毒转染原理及步骤
病毒转染原理及步调之羊若含玉创作 在细胞相关的实验操纵中，对于一些按通例办法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验可以或许大大提高基因的转导效率，以达到目标基因的高效瞬时表达. 病毒转染包含以下步调：1构建载体2包装提纯病毒3沾染靶细胞.以慢病毒为例. 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基本成长起来的基因治疗载体.区别一般的逆转录病毒载体，它对决裂细胞和非决裂细胞均具有沾染才能.慢病毒载体的研究成长得很快，研究的也异常深入.该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达.在沾染才能方面可有效地沾染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到优越的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果异常幻想，因此具有辽阔的应用前景. 一、慢病毒载体构建原理： 慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分.包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，可以或许反式提供产生病毒颗粒所必须的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子掌握下的
多克隆位点及在此位点拔出的目标基因.将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目标基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒. 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息.慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有帮助蛋白.为产生高滴度的病毒颗粒，需要应用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒排泄到细胞外的造就基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的沾染，目标基因进入到宿主细胞之后，经由反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目标基因转导效率，并且目标基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及陈述基因的研究提供了一个有利的途径.对进行稳转细胞株的筛选，为活体动物模子实验提供高质量的包含目标基因的病毒液提供基本.
人bax基因逆转录病毒表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达
人bax基因逆转录病毒表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达 【摘要】［目的］构建带有报告基因EGFP的bax基因逆转录病毒表达 载体，建立高表达bax基因的Hela细胞。［方法］通过RTPCR方法从Hela细胞克隆bax基因，根据基因工程原理，经PCR、酶切等方法构建bax基因和报告基因EGFP双基因逆转录病毒表达载体pLBaxSNIRES2EGFP，转染Hela细胞后，荧光显微镜和Western Blotting检测bax基因的表达情况。［结果］成功构建了带有EGFP 的bax基因的逆转录病毒表达载体，并将其转入Hela细胞。［结论］成功建立的高表达bax基因的Hela细胞株，为探讨bax基因与放射敏感性之间的关系奠定了基础。 【关键词】 bax基因逆转录病毒表达载体IRES序列载体构建 Recombinant Human bax Gene Retroviral Vector Construction and Its Expression in Hela Cells Abstrac:［Purpose］To construct the human bax gene retroviral expressive vector with EGFP gene and obtain a Hela strain overexpressing bax gene by transfection. ［Methods］Bax gene was cloned from Hela cell with RTPCR. The retroviral vector carrying both bax and EGFP gene was constructed using PCR and enzyme digestion etc， then this new vector pLBaxSNIRES2EGFP was used to transfect Hela cell to establish a new Hela strain， and the expression of the exogenous bax gene was verified by fluorescence microscope and Western Blotting. ［Results］The recombinant retroviral vector with exogenous bax and EGFP gene was constructed， and the recombinant vector was transfected into Hela cell. ［Conclusion］ The successful establishment of Hela cell strain that overexpresses exogenous bax gene provides the basis for further studies on the relationship between the bax gene expression and the sensitivity to radiotherapy for Hela cell. Key words: bax gene;retroviral vector;IRES;vector construction 1993年，Oltvai等[1]发现的一种能与Bcl2共沉淀的蛋白质，其分子量为21kD，命名为Bax (Bcl2 associated X protein)，是Bcl2家族的重要的促凋亡蛋白。已有证据表明Bax作为一个重要的促凋亡蛋白，通过对凋亡调节而干预肿瘤发生、发展及预后[2]。另有文献报道，组织或培养的细胞受到放射线照射后，其bax基因表达上调，与其蛋白促进细胞凋亡有关[3]。我们在前期工作中发现，宫颈癌放疗前Bax高表达者的近期疗效优于低表达者[4]，郑建勇等[5]研究表明，
病毒包装实验整体流程及原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难以转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒
1.2.1原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较
反转录病毒载体感染法
反转录病毒载体感染法 原核注射和ES细胞的基因打靶在小鼠上取得了巨大的成功，但是这些方法在其他物种上尚未获得明显成功，促使科学家寻找其他的替代方法。如，研究表明用反转录病毒特别是慢病毒载体可有效地将外源DNA导入卵母细胞。反转录病毒转导的雄性生殖系干细胞已成功产生转基因小鼠。 反转录病毒载体的基本结构：反转录病毒载体的两端有长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。LTR含有启动子和增强子序列，可以转录表达外源基因。在反转录病毒载体的5' LTR序列后，有病毒包装信号，去掉包装蛋白基因，留下的空间可用于克隆外源基因。反转录病毒载体克隆容量有限，插入的DNA片段需小于10kb。包装蛋白基因克隆入表达载体，制备包装细胞系。用反转录病毒表达载体转染包装细胞系或者与病毒包装载体共转染293T细胞制备病毒颗粒；然后用病毒上清感染胚胎细胞或ES细胞。由于透明带构成一个物理屏障，不能直接感染受精卵，可以将重组病毒上清注射到卵透明带与卵质膜间隙；或者先去掉透明带，然后感染无透明带的受精卵细胞；也可用显微注射操作系统，将病毒上清注入囊胚腔内，感染早期胚胎。将胚胎移入受体动物的输卵管，发育成转基因动物。病毒感染后，反转录病毒RNA基因组释放入宿丰细胞，在反转录酶的作用下，病毒RNA 反转录为DNA，在病毒整合酶和其末端特异核酸序列作用下，随机整合到宿主细胞基因组中。 早期使用小鼠白血病反转录病毒(moloney murine leukemia virus，MMLV)感染制备转基因动物，后来发现MMLV介导的转基因，进入动物基因组后会发生基因表达沉默现象。最近发现慢病毒介导的转基因在动物体内更稳定。反转录病毒载体感染法转基因法操作简单，宿主范围广，不受胚胎发育阶段的影响，无导入基因的连环化现象，且单一位点单拷贝整合、整合效率高。该方法的不足之处是需要生产带有外源基因的反转录病毒；插入外源基因的长度有一定限制。反转录病毒整合只能发生在分裂期的细胞，而重组慢病毒可以用来感染未