逆转录病毒包装

逆转录病毒（Retrovirus）是一类RNA病毒。在逆转录酶的作用下，以病毒RNA为模板合成cDNA，再通过DNA复制、转录、翻译等过程形成病毒颗粒。逆转录病毒表达系统是一种新的重组蛋白高效表达系统，由逆转录病毒载体、辅助载体（表达病毒包装需要的蛋白质）和包装细胞系组成。逆转录病毒载体在外源基因表达、基因沉默、基因治疗、生物制药等得到广泛的应用。逆转录病毒载体主要优点：转染范围广，可以感染各种细胞类型,如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等；转入的外源基因可完全整合；对细胞感染率高；感染细胞不产生病变,可建立细胞系长期持续表达外源基因。

逆转录病毒载体系统共由两部分组成：包装细胞系和缺陷病毒本身。在逆转录病毒载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号，通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配，该病毒颗粒可感染其他宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录病毒提供结构蛋白，因而在宿主细胞内不会产生新的感染性病毒颗粒，保证了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。

服务内容

将目的基因片段克隆到逆转录病毒载体上；逆转录病毒的包装、扩增、滴度的测定。

客户提供

样品；目的基因信息或者序列。

我们提供

含有目的基因片段的逆转录病毒；所用的引物序列、测序结果；详尽完整的实验报告。

293T逆转录病毒制备最终版

293T逆转录病毒制备（慢病毒包装） 1.转染前一天，10%FBS DMEM不含双抗培养基种3*10^6细胞至10cm dish，培养24h （3盘 NC #3 #4） 2. a.用OptiMEM 470ul稀释Fugene9 30ul(NC/Sh#3/Sh#4)，充分吹打混匀，RT5min b.Target plasmid：3.75ug (NC/Sh#3/Sh#4) Gag-pol：3.75ug VSVG：2.5ug （8/5ug pCDH 6/3.33ug psPAX2 2/1.67ug PMD） c. 将上述准备的质粒混合液滴加到optimem与Fugene9的混合液中，RT静置20min；转染混合物逐滴加至细胞中 3. 转染24h之后，弃上清液，更换新鲜培养基，置37°细胞培养箱中继续培养病毒液的收集 1.转染48h 后（此时293T长满），收集上清液于15ml 离心管中，3000rpm离心20min 2.将上清液用0.45um滤头过滤,再向10cm dish 加10ml培液 3.24h之后，再次收集上清液，0.45um滤头过滤，随后保存于-80°冰箱中。慢病毒感染目的细胞 1.需要提前一天铺板至8个10cm dish中（细胞接种个数是1*10^6），以保证感染时的密度为30-40%；（Control，NC，#3，#4 PLC和7405各四盘） 2.贴壁后弃上清液，配置25ml+40ul （10mg/ml）polybrene混匀（24ml）培养基DMEM (10％FBS不含双抗) , 6个dish加3ml混匀液，然后加入3ml病毒2盘Control组只加3ml混匀液+3ml DMEM（10%FBS不含双抗） 10cm dish置于细胞培养箱中再培养48h 3.48h后，弃上清，更换各自新鲜培养液8ml，并加入puromycin筛选 PLC/PRE/5 0.6ug/ml（4.8ul 1mg/ml puromycin） Bel-7405 0.5ug/ml（4ul 1mg/ml puromycin） 4.筛选2-3天之后，观察dish中细胞生长的状况，判断筛选是否成功(比较 Control和感染组生存情况) 5.若筛选成功，继续加入相应浓度抗生素筛选（注意杀菌） 6.WB验证

慢病毒包装

慢病毒包装．慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，它需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。它包括人免疫缺陷病毒（HIV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）、猿免疫缺陷病毒（SIV）、牛免疫缺陷病毒等。其中研究最多的是HIV-1慢病毒。慢病毒载体（Lentivirus vector）是以慢病毒基因组为基础，由所需的目的基

因取代部分基因构建而成。目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。与一般的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而实现持久表达。在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。随着人们对慢病毒载体的深入研究，为了提高慢病毒在临床上使用的安全性，慢病毒载体的优化也在不断的探讨中。慢病毒载体的发展经历了三个阶段，第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表，在构建时把HIV-1基因组中进行包装、逆转录和整合所需的顺式作用原件与编码反式作用蛋白的序列分离，分别构建在三个质粒表达系统上，即包装质粒、包膜质粒和载体质粒。包装质粒在巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）启动子的作用下，控制除env以外所有病毒结构基因的表达；包膜质粒编码水泡口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）G 糖蛋白；载体质粒中含有目的基因。用这三种质粒共转染包装细胞如人胚胎肾293T细胞，在细胞上清中即可收获只有一次感染能力、而无复制能力的慢病毒颗粒。第一代慢病毒载体系统的特点是在构建三种包装质粒时，为了降低产生有复制能力的病毒的可能性，尽可能减少三种质粒之间的同源序列，但包装质粒中仍然保留HIV的附属基因。第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进，在包装质粒中删除了HIV的所有附属基因。这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。第三代慢病毒载体系统又增加了两个安全特性：一是构建自身失活的慢病毒载体，即删除了U3区的3′LTR,

逆转录病毒载体

逆转录病毒载体逆转录病毒的许多特点使其成为基因转移载体的最佳选择。它可有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。病毒基因组以转座的方式整合，其基因组不会发生重排，因此所携带的外源基因也不会改变。逆转录病毒属RNA病毒，通过其本身逆转录酶的作用，形成双链DNA原病毒,然后整合于宿主细胞染色体中。逆转录病毒是一类正链RNA病毒，其分为顺式功能基因和反式功能基因。由于逆转录病毒包膜上有env 编码的糖蛋白能被许多哺乳动物细胞膜上特异性受体所识别，并能介导逆转录病毒的遗传物质高效地进入宿主细胞内；同时逆转录病毒结构基因gag、env 和pol的缺乏不影响其他部分的活性，因此可用外源性基因代替这部分病毒基因，外源性基因最大容量为8.0kb左右，可适用于大部分目的基因；并且病毒在自身表达的整合酶催化作用下可高效地整合入宿主细胞染色体中，这有利于外源基因在宿主细胞的永久表达。构建载体时以DNA原病毒为基础，将野生型病毒的3类结构基因gag，pol和env删除，以供外源基因的插入，但是要保存病毒的包装序列（ψ）和双侧的长末端重复（LTR），LTR含有启动子、增强子、整合信号及poly A信号等多种元件。插入的基因一般为两种或两种以上，如目的基因和标记基因。因此和逆转录病毒结合的是DNA。将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。通过此方法，得到了转基因鸡和转基因牛。这种逆转录病毒被用重组DNA技术修饰后作为基因载体在应用中优于微注射法之处为：无需要重排，可在整合点整合转移基因的单个拷贝；将胚胎置于高浓度病毒容器中，或者与被感染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘里，整合有逆转录病毒的DNA的胚胎率高。缺点是：需要生产带有转基因的逆转录病毒；插入逆转录病毒的基因有

病毒包装

基因编码p55的蛋白前体,经蛋白酶裂解而形成病毒的核衣壳蛋白(p7) 、内膜蛋白(p17) 和衣壳蛋白 (p24) 。pol 基因编码病毒复制所需的酶类,env编码gp120 和gp41 两种包膜糖蛋白,决定病毒感染宿主的靶向性。tat 基因编码的gp14 是一种反式激活的转录因子,与LTR 结合后能促进病毒所有基因的转录。rev 基因编码的产物gp19 能促进未经拼接的大mRNA 分子从细胞核向胞浆转运,并相对减少拼接后小mRNA 分子的数量。nef基因编码负调节蛋白,对病毒的结构蛋白和调节蛋白的表达均有下调作用。vif编码产物与病毒体的感染性有关,vpu产物与病毒的装配、成熟和释放有关,而vpr编码产物的功能尚不清楚。 1.3 HIV-1 生活史 HIV-1 病毒通过gp120 与宿主细胞的CD4 分子和趋化因子受体结合,然后将病毒的基因(RNA) 、蛋白及酶等释放到宿主细胞内;随后,逆转录酶将病毒RNA 转录成DNA,病毒DNA 在整合酶的作用下插入宿主细胞核的基因组中,此时的病毒DNA 也称为原病毒;紧接着,原病毒转录成mRNA ,mRNA 从细胞核进入细胞质,并利用宿主细胞的原料合成病毒的各种成分(蛋白质) ,新合成的各种蛋白、酶及RNA 等聚集在宿主细胞的膜下,病毒的包膜蛋白(gp120 ,gp41) 插入宿主细胞的细胞膜并形成一种未成熟的病毒(此时病毒无传染性) ;最后蛋白酶将病毒核心中的许多过长的蛋白及酶切短,便形成成熟的病毒。病毒利用宿主细胞的细胞膜将自己包被起来,离开该细胞去寻找新的宿主。 1.4 慢病毒载体转导非分裂期细胞的分子机制慢病毒载体能转导非分裂期细胞,3 种分子元件决定了这种能力:MAN、IN 和vpr。这3 类蛋白利用细胞核的输入机制,靶向作用于细胞核的前整合复合物( PIC)。细胞核的输入系统包括: 胞质蛋白、importin-a 、importin-b 及核孔蛋白。importin-a含有一个细胞定位序列(NLS) 的结合位点,当含有NLS的蛋白与importin-a 结合在一起,发生构象变化,与importin-b 相互作用,然后importin-b通过与核孔蛋白结合,靶向作用于核孔复合物。而在实际构建时,vpr可以完全敲除而不影响慢病毒载体感染非分裂期细胞的能力。二、慢病毒载体的构建 2.1 早期HIV21 来源的慢病毒载体早期构建的HIV21 来源的慢病毒载体,是作为研究HIV21生物特性的工具,而非作为基因转移载体。该慢病毒载体包含了完整的病毒基因组,仅仅是在env基因框内插入了一个报告基因,由于存在病毒滴度较低,以及产生有复制能力的反转录病毒(RCR) 的巨大风险,这种载体从未被考虑用于基因治疗。但是,这种载体可以应用于病毒的生物学研究。 2.2 第一代HIV-1 来源的慢病毒载体以Naldini以及Kafri构建的三质粒系统为代表。该载体系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒3 种质粒组成。载体质粒携带了5′端LTR 和全部5′端非翻译区域(包括gag 编码序列的350 个核苷酸) ,另外还带有rev 应答元件(Rev responsive element ,RRE) 及3′端LTR。其瞬时表达盒采用巨细胞病毒(CMV) 启动子及增强子元件,在某些研究领域,可以携带绿色荧光蛋白基因、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基因作为生物标记。包装质粒由HIV-1 前病毒基因组作简单修改得到,其5′端LTR 由异源病毒启动子/ 增强子元件取代。为了防止来自辅助质粒的RNA 衣壳化, 特意将5′端主要剪接供体位点(splice donor site) 和gag 编码序列起始端之间的包装信号区(E/Ψregion) 删除,而下游的启动子由外源多聚腺苷酸信号(poly A)取代。另外,利用点突变将env编码序列打断,但仍然保留rev 反应元件。这样的辅助结构能表达所有的病毒蛋白,包括tat 及rev(env除外) 。env由单独的包膜质粒携带并在病毒生产过程中共转染后表达。本系统包膜质粒的改进之处在于,引入了VSV-G基因表达包膜结构,这样做的结果至少具有3个方面的积极意义: ①包膜的更换进一步降低了HIV-1 载体恢复成野生型病毒的可能; ②使HIV 载体感染宿主的范围不再仅限于CD4 + 细胞,而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞; ③VSV 的包膜赋予HIV 载体颗粒高度的稳定性,使其能够通过超速离心而浓缩,达到高滴度。使HIV-1 载体滴度由105 转录单位(TU) / ml 达到108TU/ ml 。这样的改进无疑是HIV 载体系统走向应用而迈出的一大步。 2.3 第二代HIV-1 来源的慢病毒载体尽管第一代载体产生RCR 的几率极小,仍然不能忽略产生的可能性。毕竟包装质粒可以表达除env外所有HIV-1 病毒蛋白,其中部分蛋白与HIV-1的毒力密切相关,且已发现部分蛋白对细胞存在潜在的毒害作用,比

逆转录病毒包装系统

逆转录病毒包装系统时间：2009-07-31 13:46:30 来源：生物无忧作者：51atgc点击：1488次一、逆转录病毒概述反转录病毒是RNA病毒，但有反转录酶，可使RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。逆转录病毒即RNA病毒，需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。逆转录病毒是RNA病毒，它有三个基因：gag-编码病毒的核心蛋白；pol-编码逆转录酶；env-编码病毒的被膜糖蛋白。二、逆转录病毒的许多特点便于其发展成为动物基因克隆载体。①就目前所知，在大多数情况下，逆转录病毒的肿瘤基因（oncogene，ONC）都能够在细胞中转录。这种特性说明逆转录病毒有可能是一种天然的转录因子，同时根据这种特性，可以在正常细胞中进行操作，将它改建为有用的动物基因转移载体。②逆转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物，其中有的还能够在人体细胞中生长；③逆转录病毒不但感染效率高，而且通常不会导致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和保持病毒感染性的能力。逆转录病毒载体最大优点是 (1) 转染范围广，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等; (2) 转入的外源基因可完全整合 (3) 对细胞感染率高，达到100 % (4) 感染细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因三、逆转录病毒载体的包装原理逆转录病毒载体系统共由两部分组成：包装细胞系和缺陷病毒本身。在逆转录病毒载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号，通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配,该病毒颗粒可感染其他宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录病毒提供结构蛋白，因而在宿主细胞内不会产生新的感染性病毒颗粒,保证了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。四、逆转录病毒包装程序 1、接种293细胞 2、磷酸钙转染：编码逆转录病毒载体、逆转录病毒结构基因质粒（是病毒颗粒形成、复制所必需的病毒结构蛋白基因）共导入293细胞

逆转录病毒在293T细胞中的包装及病毒的收集

逆转录病毒在293T细胞中的包装及病毒的收集? （一）病毒包装转染 1、293T细胞胰酶消化离心后悬于完全培养基； 2、取4.0*10e5细胞接种于6孔板 3、24h后转染准备： 293T细胞融合度控制在40％～60％为宜；转染前两小时细胞换液（可做可不做）：质粒总用量2.5μg；（gag-pol）0.9375 pVSvg 0.625 The gene of interest 0.9375 4、按照上表取适量加入120ul DMEM无血清中，用枪吹打混匀 5、加入7.5ul hilymax转染试剂，轻轻震荡混匀，室温静置15min 7、轻轻滴加DMEM、FuGene DNA混合物于待转染的293T细胞中并轻轻旋转混匀； 8、293T细胞培养24h后换入2.5ml新鲜培液； 9、试细胞状态24-48h后收病毒。（二）病毒收集 1、收细胞上清于无菌离心管，2000RPM 10min离心沉淀细胞和细胞碎片， 2、用低蛋白结合的孔径为45μm的无菌针式滤器过滤）；转移上清于另一无菌管中，此上清可直接用于转染目的细胞也可分装保存于－80℃待用。病毒转染靶细胞黏附细胞感染接种细胞于六孔培养皿中，接种密度：3×105个/孔，培养基：2ml/孔； 24小时后细胞密度控制在20％～40％融合度；移去细胞培液基，每孔加入2mL病毒上清8μg polybrene；（病毒用量依病毒滴度而定体积可用培养基补齐；冻存病毒应在37℃解冻融化。）培养箱中感染6小时后换新鲜的培养基感染48小时后可加入抗生素筛选或进行其它实验；四.注意事项： 1、支原体污染对逆转录病毒的产生及靶细胞感染效率影响影响非常大，因此，用于病毒系

慢病毒包装原理介绍

慢病毒包装原理介绍慢病毒包装系统简介及应用、慢病毒包装简介及其用途慢病毒(Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶川启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶川有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A 尾。当RNA聚合酶川遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3'端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶川依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达?21ntRNA和?50ntRNA 茎环结构(stem loop )。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成

慢病毒包装步骤及经验总结

慢病毒包装步骤及经验总结慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，它能够将靶基因导入到一些较难转染的细胞，如原代细胞等，并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中，从而大大增加了转染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若干代，可以进行稳转细胞株的筛选。因为是随机整合，也有不确定因素，有些公司还能提供定点整合技术，将靶基因定点整合到基因组特定的部位，从而保证其高效表达并且对细胞不产生随机整合可能产生的伤害。慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染。慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白或产生RNAi干扰。慢病毒包装系统由一个包装质粒混合物（Mix）和一个慢病毒载体质粒（LentiviralVector）组成，如下图（图片来自MIT）：载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件等。不同系统包装质粒混合物也不一样，以本实验室的三质粒系统为例，包装质粒混合物中含pMDL，VSVG，pRSV-Rev，比例为5:3:2；其中pMDL含有编码HIV病毒主要结构蛋白的gag基因和编码病毒特异性酶的pol基因，pRSV-Rev含编码调节gag和pol基因表达的调

慢病毒感染细胞实验原理与实用流程（一）

慢病毒感染细胞实验原理与实用流程（一）首先，包装病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒：慢病毒（Lentivirus ）是逆转录病毒的一种。可用于感染依靠传统转染试剂瞬转，难于转染的细胞系，如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。腺病毒 (Adenovirus ，Ad) 是一种无包膜的线状双链DNA 病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。几乎可以感染所有类型的细胞，可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒。它的病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL 。腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单。感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较病毒表达系统慢病毒表达系统腺病毒表达系统病毒基因组 RNA 病毒双链DNA 病毒复制自主复制自主复制是否整合病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因感染细胞类型感染分裂和不分裂细胞，适用于难转染的原代细胞（如神经细胞）及体内实验感染分裂和不分裂细胞表达丰度中水平表达高水平表达表达时间慢（1-3天）快（1-2天）滴度滴度最高可达10*8pfU/ml 滴度最高可达10*11pfU/ml 克隆容量插入不超过8kb 的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低插入高达8kb 的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低免疫原性低免疫原性高免疫原性质粒DNA 和包装质粒共转染293T 细胞病毒包装原理

慢病毒包装原理介绍

慢病毒包装系统简介及应用一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的 siRNA 表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。 U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构（ stem loop ）。在 siRNA 表达载体中，构成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ～ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有 1~4 个 U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA 。构建载体前通常要通过合成 siRNA 的方法，寻找高效的 siRNA ，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入 siRNA 表达载体。慢病毒载体（ Lentiviral vector ）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达 shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达 shRNA ，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装 RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题： 1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为 RNAi，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 2. 进行稳转细胞株的筛选；

【干货】慢病毒包装原理及注意事项

【干货】慢病毒包装原理及注意事项慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1（人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。和一般的逆转录病毒载体不同，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。并且它可以有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，因此具有广阔的应用前景。目前慢病毒被广泛地应用于RNAi 的研究中。由于体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达 siRNA的载体, 然后转入细胞内转录 siRNA的策略，不但对基因表达抑制效果不逊色于体外合成 siRNA，而且稳定整合表达载体的细胞中，可以发挥长期阻断基因表达的作用。但上述两种方法，一是受到转染试剂转染效率的影响，在一些细胞内无法有效敲低（Knockdown）一些基因；二是传统方法得到稳定细胞株通常需要挑取单克隆，进行克隆化，这样费时费力。利用慢病毒介导的方法可以解决上述问题，这是因为慢病毒介导的RNAi具有下述优点： ● 慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，不存在某些细胞难以转染的问题。 ● 慢病毒可以在细胞基因组上稳定整合表达siRNA的元件，siRNA 表达效率比较均一，因此，无需挑取单克隆。

● 慢病毒载体具有嘌罗霉素（Puromycin）抗性基因，Puromycin 可以在 2-3天内杀死细胞，只有整合了病毒载体的细胞能够存活，这样缩短了得到稳定细胞株的时间。慢病毒表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为 RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当 RNA聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成 1~4个 U。U6 和 H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21nt RNA和～50nt RNA茎环结构（stem loop）。在 siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA；也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体内的位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和4～5Ｔ转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后可折叠成具有 1~4 个 U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA

第二代和第三代慢病毒包装系统

第二代和第三代慢病毒包装系统将HIV-1 基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分:包装成分由HIV—1 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的HIV—1顺式作用序列.同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。第一代包装系统中，除vpu之外的辅助基因都被保留下来，Env包膜蛋白由VSV—G蛋白代替,应用VSV-G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性。3质粒系统,包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。其中包装质粒在CMV 启动子的控制下，表达HIV 21 复制所需的全部反式激活蛋白,但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白（VSV 2G），应用VSV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性,允许通过高速离心对载体进行浓缩,提高了滴度；转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列，还保留350 bp 的gag 和RRE，并在其中插入目的基因或标志基因( 绿色荧光蛋白GFP) . 在第二代系统中辅助基因vif、vpr、nef被进一步剔除，这些辅助基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。第二代系统中5’LTR 634bp,3' LTR 634bp,5'LTR前不需要强启动子。4质粒系统. 第三代系统中，tat调节基因也被剔除，对5’LTR进行了改造，换上了异源启动子，从而不需依赖tat基因（Tat 基因编码蛋白可与LTR结合，增加病毒所有基因转录率）；构建自身失活的慢病毒载体（SIN)，即删除了U3区的3’LTR, 使载体失去HIV—1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；一些增强包装病毒滴度的元件被加入，如cPPT、WPRE。因此,第三代系统的安全性大大提升，进一步减少重组成复制型病毒（RCV) 的可能性.5’ LTR (truncated）181bp，3' LTR (ΔU3）234bp，5’LTR前要有强启动子。4质粒系统.

慢病毒包装原理-介绍

慢病毒包装系统简介及应用（一）一、慢病毒包装简介及其用途慢病毒（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的 siRNA 表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。 U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构（ stem loop ）。在siRNA 表达载体中，构成 siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ～5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有 1~4 个 U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA 。构建载体前通常要通过合成 siRNA 的方法，寻找高效的 siRNA ，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入 siRNA 表达载体。慢病毒载体（ Lentiviral vector ）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达 shRNA ，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装 RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

病毒包装实验整体流程及原理(慢病毒、腺病毒)

广州英思特生物科技有限公司为您提供高效快速的病毒包装实验外包服务，病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA/miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。? 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、-80 ℃保存。

6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒 1.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1和E3缺失)的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA的腺病毒载体 2）采用PacI消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较

逆病毒感染

逆转录病毒载体简介逆转录病毒载体介导DNA转染技术逆转录病毒载体属RNA病毒，但可在受染细胞内逆转录产生DNA互补链，此DNA单链可作为模板合成第二条DNA链，第二条DNA链可掺入细胞基因组DNA中。此病毒可利用宿主细胞的酶自行转录与复制，RNA可合成蛋白，再包装病毒，RNA 从胞内释放，成为感染性病毒，该载体可经不同方式改变。介导过程可使病毒单拷贝基因组稳定地进入细胞。首先，逆转录病毒的繁殖必须要有适当的包装细胞系，以利于产生高滴度的病毒，同时还具有适当的结构。如：ψ2（第一代包装细胞），PA317（第二代包装细胞），ψ1-CRIP、PG13、DA、CFA（第三代包装细胞），包装细胞可提供逆转录病毒gag、pol和env蛋白才能使带有包装信号及目的基因的病毒载体RNA进行包装，包装细胞只提供gag、pol和env蛋白而不产生具有复制能力的野生型病毒（RCR），而第一代包装细胞可产生RCR，安全性较差；第二代包装细胞，临床上已广泛应用，也未发现产生RCR，安全性好；第三代包装细胞更加安全，第三代包装细胞中主要区别是病毒结构基因中env不同。逆转录病毒作为基因转移的载体有如下特点： (1) 逆转录病毒感染细胞的效率高，基因转移率在10%-100%； (2) 病毒基因转移能将外源基因整合到宿主细胞基因组中外源基因能稳定存在而不丢失； (3) 外源基因整合的拷贝数一般只有一个； (4) 逆转录病毒只选择感染分裂细胞； (5) 病毒可容纳外源基因的DNA长度为<8Kb。逆转录病毒载体的结构：已切除了病毒的结构基因gag，大部分pol和env，包括两侧的LTR，被选择（标记）基因和目的基因插入的多聚位点所取代，同时还带有包装信号ψ。可产生特异性逆转录病毒细胞系的建立逆转录病毒载体介导DNA转染技术 (一) 逆转录病毒载体进入包装细胞系从细胞质粒中产生感染性病毒包括将质粒导入包装细胞系，可从稳定感染细胞中选择病毒产生细胞或用一个包装细胞系暂时产生的病毒感染另一种有不同包装的细胞系，从中选择病毒的产生细胞。 1. 准备工作（用品） (1) 适当的包装细胞系及培养液。 (2) 大多数包装细胞系为鼠源的，含有鼠“Helpe病毒”，此病毒可帮助被去除某些功能结构基因的逆转录病毒复制，并包装于蛋白衣壳中。 (3) 逆转录病毒质粒DNA常构建成含有抗药基因neo新霉素基因的载体。 (4) Hepes-缓冲液（HeBs） (5) 2mol/L CaCl2

腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒的区别优缺点及应用场景

腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒的区别优缺点及应用场景前言：病毒系统知识点get，四种主流基因转导病毒工具：腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒的区别优缺点及应用场景随着病毒生物学的发展，种类繁多的病毒载体已越来越成为向各种实验系统（如细胞系、原代细胞、组织脏器等）转运核酸的重要工具。除了在实验室的组织培养和动物模型生产中发挥重要作用，它们还被用于治疗遗传性疾病的临床试验中。目前主流的病毒载体系统主要包括慢病毒（LV）、（γ-）逆转录病毒（RV）、腺病毒（Ad）和腺相关病毒（AAV）。我们分述之。慢病毒和逆转录病毒均属于逆转录病毒科。其典型特征为其RNA 基因组能逆转录为 cDNA 副本，cDNA 副本又能稳定整合至宿主细胞基因组中（这就是常说的稳转）。逆转录病毒通常分两种：简单的（有时又称为致癌病毒或γ- 逆转录病毒，如鼠白血病病毒）和复杂的（如慢病毒）。这些亚型间主要的差异在于复杂的逆转录病毒存在一些附属基因和调控基因，而简单的则没有（下文有进一步的讨论）。这两类病毒颗粒都含有两份正链RNA，RNA 上附有病毒反转录酶（RT），它们位于病毒的内核（图1）。位于内核的还有结构蛋白和酶，包括核壳（NC）、衣壳（CA）、整合酶（IN）和蛋白酶（PR）。内核由一圈外周蛋白层包围，外周蛋白包括基质蛋白（MA），基质蛋白又被来源于宿主细胞细胞膜插有包膜糖蛋白的腹膜所包围。

图1. 简单和复杂逆转录病毒粒子结构。病毒颗粒含有两份正链RNA，RNA 上附有反转录酶（RT），它们位于病毒的内核。除此之外，内核还包含核壳（NC）、衣壳（CA）、整合酶（IN）和蛋白酶（PR）。内核由一圈基质蛋白（MA）所包围，基质蛋白又被来源于宿主细胞细胞膜插有包膜糖蛋白（ENV）的腹膜所包围。图片来源：汉恒生物实验室常用的慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA 干扰、microRNA 研究以及活体动物实验中。在整合宿主基因组过程中，逆转录病毒（比如MLV）通常大约 20% 的感染事件发生在转录单位的 5' 端，对 CpG 岛和 DNase I 超敏感位点附近有一定的倾向性。而慢病毒载体多整合到远离转录起始点的位点。因此，与逆转录病毒载体相比，慢病毒载体似乎致癌可能性较低，临床应用可能更安全。重组腺病毒（Adenovirus，Ad）载体系统是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。重组腺病毒具有以下几个显著的优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织；感染效率高达100%，全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染；对外源基因容载能力大（可以高达8Kb）；不整合基因组；滴度高，操作方便。因此，重组腺病毒是最具有潜力的一种基因递送工具。目前常用的腺病毒载体是基于人腺病毒5 型（Ad5）的，其基因组是36Kb 长的线性双链DNA。腺病毒是通过自身的纤维（Fiber）和细胞表面的受体（如CAR）结合被内吞进入细胞，然后从内吞体（endosome）转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装 (图 2)。一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。