逆转录病毒包装
被「病毒包装」虐了千百遍，吐血整理这7个关注点
被「病毒包装」虐了千百遍，吐血整理这7个关注点师兄 & 师姐 & 师傅曰（shuo）如果你选择科研这条路必要耐得住乏味与寂寞白天做实验，晚上写论文吃饭看文献，走路思课题忙碌一整年，毕业仍无期今天就来跟大家来聊聊，虐我千百遍我却依旧没初恋的「病毒载体包装」技术。
所谓的「病毒」可以说其是一种优秀的基因传输载体，也一直是科学家们研究的热点。
它利用病毒具有传递基因组进入其他细胞的特性，进行感染。
病毒可用于体内或细胞培养中的基因递送，在基础研究、基因疗法或疫苗中都有极高的应用价值。
病毒载体包装过程是复杂的，在实验中常常会遇到：用同样一个病毒载体系统进行病毒包装实验，为什么有人做的很好，次次成功。
有人却是时常做不出来，稳定性很差，不是滴度低就是根本不出毒?病毒载体的选择：慢病毒 or 腺相关病毒（AAV）？慢病毒高效的转染，可插入细胞基因组，持续时间长，包装周期短（一般两个月）；表达稳定，可遗传，包装基因整合到基因组 DNA 上，高水平表达，低变异；不干扰细胞，细胞功能不受侵染过程影响；生物安全，四质粒系统包装最大的安全性，非人源 FIV 病毒最大限度降低风险。
慢病毒纯化后梯度稀释观察腺相关病毒（AAV）安全性高，极低基因组整合概率；极低免疫原性，外源基因不涉及原癌基因、有毒基因的载体；长效转导，至今录有最长的灵长类肌肉内表达时间有 10 年以上；多样的组织倾向性，目前文献中已经存在数千的突变型血清，具有极广的可选择性。
AAV 感染观察效果慢病毒、腺相关病毒（AAV）区别对比10+ 年经验分享「病毒包装」心路历程为了让大家在病毒包装这块少走弯路，莱德盟生物资深技术大咖通过多年实验服务项目的纵深，针对不同载体系统病毒包装进行全方位的经验总结与心得分享，主要以下几个方面：一、病毒包装的关键点病毒包装的几个关键节点就是细胞因素、载体系统（尽量使用成熟的商业化载体系统）、构建重组的质粒正确与否、质粒抽提纯化情况、包装转染控制（24、48 小时的细胞及荧光状态判断）、目的基因对病毒包装影响（基因大小、序列情况、蛋白功能毒性等都会影响到是否能包装成功）。
逆转录病毒试用装操作手册
汉恒逆转录病毒操作手册一、逆转录病毒的试用装分装与储存1.收到汉恒生物逆转录病毒产品后，请先对逆转录病毒产品进行分装处理，建议20-50μl/管。
如1-2天内使用，则留足够量病毒4℃保存，余下逆转录病毒置于-80℃长期保存。
2.病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前重新测定病毒滴度。
3.反复冻融会降低逆转录病毒滴度：逆转录病毒滴度越低，冻融对滴度的影响越大，108IU/ml的逆转录病毒冻融2次滴度没有显著性差异，第3次冻融开始，每冻融一次滴度降低约10%；滴度107IU/ml滴度逆转录病毒，从第2次冻融开始，每次冻融病毒滴度下降10%-15%。
二、逆转录病毒试用装实验策略与关键知识点1.逆转录病毒感染策略：逆转录病毒本身的病毒滴度不高，感染细胞时病毒消耗量较大，试用装体积较小，建议使用96孔板进行MOI梯度感染测试。
逆转录病毒感染细胞后会反转录并插入基因组形成稳转，因此逆转录病毒感染一般采用感染少量细胞，然后将细胞放大化培养。
而不是直接大量感染。
注意：对于一些传代能力较差的原代细胞，比如BMSC等，建议采用腺病毒感染。
2.逆转录病毒感染关键知识点1）细胞准备：由于试用装体积有限，请使用96孔板准备细胞，逆转录病毒感染细胞前，请确保目的细胞状态良好、无支原体污染。
逆转录病毒感染的时候细胞汇合率为40%～60%间为宜。
2）感染细胞最佳MOI的测定：MOI（感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。
逆转录病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适MOI各有差别，原则上最适MOI是感染效率较好的最低MOI。
MOI一般以3：10：30：100的比例递增进行梯度摸索，一般的细胞基础逆转录病毒感染MOI 可从3为开始，即设立4个常规的MOI摸索，即3，10，30，100。
3)助转剂polybrene的选择：实验证明，polybrene可提高逆转录病毒对大部分细胞的感染效率，但polybrene 有一定的细胞毒性，不同细胞对polybrene的敏感度不同，polybrene最常用的工作浓度为5～8μg/ml。
293T逆转录病毒制备最终版
293T逆转录病毒制备（慢病毒包装）1.转染前一天，10%FBS DMEM不含双抗培养基种3*10^6细胞至10cm dish，培养24h（3盘 NC #3 #4）2. a.用OptiMEM 470ul稀释Fugene9 30ul(NC/Sh#3/Sh#4)，充分吹打混匀，RT5minb.Target plasmid：3.75ug (NC/Sh#3/Sh#4)Gag-pol：3.75ugVSVG：2.5ug（8/5ug pCDH 6/3.33ug psPAX2 2/1.67ug PMD）c. 将上述准备的质粒混合液滴加到optimem与Fugene9的混合液中，RT静置20min；转染混合物逐滴加至细胞中3. 转染24h之后，弃上清液，更换新鲜培养基，置37°细胞培养箱中继续培养病毒液的收集1.转染48h 后（此时293T长满），收集上清液于15ml 离心管中，3000rpm离心20min2.将上清液用0.45um滤头过滤,再向10cm dish 加10ml培液3.24h之后，再次收集上清液，0.45um滤头过滤，随后保存于-80°冰箱中。
慢病毒感染目的细胞1.需要提前一天铺板至8个10cm dish中（细胞接种个数是1*10^6），以保证感染时的密度为30-40%；（Control，NC，#3，#4 PLC和7405各四盘）2.贴壁后弃上清液，配置25ml+40ul （10mg/ml）polybrene混匀（24ml）培养基DMEM (10％FBS不含双抗) , 6个dish加3ml混匀液，然后加入3ml病毒2盘Control组只加3ml混匀液+3ml DMEM（10%FBS不含双抗）10cm dish置于细胞培养箱中再培养48h3.48h后，弃上清，更换各自新鲜培养液8ml，并加入puromycin筛选PLC/PRE/5 0.6ug/ml（4.8ul 1mg/ml puromycin）Bel-7405 0.5ug/ml（4ul 1mg/ml puromycin）4.筛选2-3天之后，观察dish中细胞生长的状况，判断筛选是否成功(比较Control和感染组生存情况)5.若筛选成功，继续加入相应浓度抗生素筛选（注意杀菌）6.WB验证。
MIG7shRNA逆转录病毒表达载体的构建及包装细胞株的建立
１ＴｈｅＳｅｖｅｎｔｈＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌ，ＳｕｎＹａｔ－ｓｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＳｈｅｎｚｈｅｎ５１８１０７，Ｃｈｉｎａ；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｎｃｏｌｏｇｉｃａｌＳｕｒｇｅｒ ｙ；３ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ，ＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＬｏｇｉｓｔｉｃｓＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰＡＰＦ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００１６２，Ｃｈｉｎａ；４ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｎｃｏｌｏ ｇｙ，ＴｉａｎｊｉｎＢｅｉｃｈｅｎＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３００４００，Ｃｈｉｎａ．
现代肿瘤医学 ２０１９年 ０５月 第 ２７卷第 １０期 ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｍａｙ２０１９，ＶＯＬ２７，Ｎｏ１０
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ＭＩＧ７－ｓｈＲＮＡ逆转录病毒表达载体的构建及包装细胞南南２，宁莉莉３，王宇鹏４，屈 波２
ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＭＩＧ７－ｓｈＲＮＡｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒａｎｄｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｉｔｓｐａｃｋａｇｅｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ
【收稿日期】 ２０１８－１１－２０ 【基金项目】 国家 自 然 科 学 基 金 面 上 项 目 （编 号：８１２７２５４７）；天 津
市科技计划项目（编号：１５ＺＸＬＣＳＹ０００４０） 【作者单位】 １中山大学附属第七医院，广东 深圳 ５１８１０７
２武警后勤学院附属医院肿瘤外科；３ 科研科，天津 ３００１６２ ４天津市北辰医院肿瘤科，天津 ３００４００ 【作者简介】 余飞（１９９０－），男，湖北随州人，医师，硕士，主要从事 肝脏恶性肿瘤的临床和基础研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｏｃｔｏｒ＿ｙｕｆ ＠１２６．ｃｏｍ 【通讯作者】 屈波（１９７１－），男，陕西西安人，博士，硕士生导师，副 主任医师，主要 从 事 实 体 瘤 的 基 础 和 临 床 研 究。 Ｅ－ ｍａｉｌ：ｄｏｃｔｏｒ＿ｑｂ＠１６３．ｃｏｍ
慢病毒包装步骤及经验总结
慢病毒包装步骤及经验总结慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的⼀种，它能够将靶基因导⼊到⼀些较难转染的细胞，如原代细胞等，并且将靶基因随机整合到宿主的基因组中，从⽽⼤⼤增加了转染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若⼲代，可以进⾏稳转细胞株的筛选。
因为是随机整合，也有不确定因素，有些公司还能提供定点整合技术，将靶基因定点整合到基因组特定的部位，从⽽保证其⾼效表达并且对细胞不产⽣随机整合可能产⽣的伤害。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋⽩。
为产⽣⾼滴度的病毒颗粒，需要利⽤表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进⾏病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离⼼取得上清液后，可以直接⽤于宿主细胞的感染。
慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进⼊细胞后，在细胞浆中被其⾃⾝携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进⼊细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。
整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达⽬的蛋⽩或产⽣RNAi⼲扰。
慢病毒包装系统由⼀个包装质粒混合物（Mix）和⼀个慢病毒载体质粒（LentiviralVector）组成，如下图（图⽚来⾃MIT）：载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件等。
不同系统包装质粒混合物也不⼀样，以本实验室的三质粒系统为例，包装质粒混合物中含pMDL，VSVG，pRSV-Rev，⽐例为5:3:2；其中pMDL含有编码HIV病毒主要结构蛋⽩的gag基因和编码病毒特异性酶的pol基因，pRSV-Rev含编码调节gag和pol基因表达的调节因⼦rev基因，VSVG含有提供病毒包装所需要的单纯疱疹病毒来源的VSVG基因。
以下介绍⽤293T细胞在六孔板（35mm）中包装病毒，其他孔板相应增加或减少体积。
准备试剂篇? 核⼼质粒；? 指数⽣长的293T细胞；? 病毒包装质粒Mix:1 µg/µl（Mix=pMDL: VSV-G : REV=5:3:2），不同载体系统所⽤的包装病毒质粒也不⼀样，此系统可⽤于包装PBOBi，PLKO， Plv等载体质粒。
病毒包装实验整体流程及原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒1.1慢病毒1.1.1原理慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。
构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难以转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4）无需任何转染试剂，操作简便。
5）可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4）病毒的纯化和浓缩。
5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒1.2.1原理腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。
有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。
这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。
1.2.2特点1）几乎可以感染所有类型的细胞2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。
逆转录病毒包装系统
逆转录病毒包装系统时间：2009-07-31 13:46:30 来源：生物无忧作者：51atgc点击：1488次一、逆转录病毒概述反转录病毒是RNA病毒，但有反转录酶，可使RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。
逆转录病毒即RNA病毒，需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。
逆转录病毒是RNA病毒，它有三个基因：gag-编码病毒的核心蛋白；pol-编码逆转录酶；env-编码病毒的被膜糖蛋白。
二、逆转录病毒的许多特点便于其发展成为动物基因克隆载体。
①就目前所知，在大多数情况下，逆转录病毒的肿瘤基因（oncogene，ONC）都能够在细胞中转录。
这种特性说明逆转录病毒有可能是一种天然的转录因子，同时根据这种特性，可以在正常细胞中进行操作，将它改建为有用的动物基因转移载体。
②逆转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物，其中有的还能够在人体细胞中生长；③逆转录病毒不但感染效率高，而且通常不会导致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和保持病毒感染性的能力。
逆转录病毒载体最大优点是(1) 转染范围广，可以感染各种细胞类型，如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等;(2) 转入的外源基因可完全整合(3) 对细胞感染率高，达到100 %(4) 感染细胞不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因三、逆转录病毒载体的包装原理逆转录病毒载体系统共由两部分组成：包装细胞系和缺陷病毒本身。
在逆转录病毒载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号，通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。
当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配,该病毒颗粒可感染其他宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。
绿色荧光蛋白-逆转录病毒的包装、筛选及克隆技术
绿 色荧 光 蛋 白一 逆 转 录病 毒 （ Ｆ — Ｖ） 因 载 ＧＰＲ 基
４ ８ｈ后 ． ４ ８浓度 增 至 ４ ０Ｉ ／ ｌ此时 已有 少量 死 Ｇ １ ０ ｇｍ ， ｘ
体 ， 用于组 织 工程研 究 中 的细胞标 记 ， 可 具有 良好 的
效果 。 由于 Ｇ Ｐ Ｒ Ｆ — Ｖ是 个 假 病毒 ， 要 经过 一 系 列 需 的 细 胞包 装 、 选及 扩 增 ， 为重 组 的 Ｇ Ｐ 逆 筛 成 Ｆ一 转 录病 毒 ， 能有 效转 染整 合人 细胞 基 因组 内 ， 而 才 从 形 成对 目的细胞 的长 时 间的标记 。我 们将 本 实验 室 常用方 法介 绍如 下 。 １ Ｐ 舒细胞 包 装 Ｔ 带 有 目的基 因 Ｇ Ｐ的逆 转 录病 毒 载 体 通 过 脂 Ｆ
并 溶液 Ａ和 溶液 Ｂ， 轻轻 混 合 ， 室温 下 静 置 １ ｎ ５ｍｉ。 弃 去 Ｐ 细胞 的培 养液 ， 用 无血 清 培 养基 洗 涤 细 Ｔ 并 胞 １次 。加 ０８ｍ 无 血清 培 养基 至脂 质体 一 Ｎ 混 ． ｌ ＤＡ 合 物 中（ 总量 １ｍ ） 混匀 后 ， 心滴 加 之 细胞 上 ， １， 小 轻 轻 混匀 。３ ７℃ ， ５％ Ｃ ２ 养箱 中孵 育 １～ ４ ｈ 弃 Ｏ培 ２ １ ， 去 转染 液 ， ２ｍ 完 全培 养基 继续 培养 ４ ～ ２ｈ 待 加 ｌ ８ ７ 。 包 装 细胞形 成单层 ， ０２ 用 ． ５％胰 酶 消化后 ， ｌ 按 ： ３密
养 皿 中 ，７℃， ３ ５％ Ｃ ： 养 箱 中孵 育 １ ～ ４ ｈ 使 Ｏ培 ８ ２ ，
细 胞 达 到 ６ ～ ０％融合 。在 １ ｌ 菌 ｅ ｐ ｎ ｏｆ ０７ ．ｍ 无 ５ ｐ ｅｄｒ 管 中制 备 下 列 溶 液 ：溶 液 Ａ，将 １ ｇ质 粒 Ｄ Ａ ２ Ｎ
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逆转录病毒包装
逆转录病毒（Retrovirus）是一类RNA病毒。
在逆转录酶的作用下，以病毒RNA为模板合成cDNA，再通过DNA复制、转录、翻译等过程形成病毒颗粒。
逆转录病毒表达系统是一种新的重组蛋白高效表达系统，由逆转录病毒载体、辅助载体（表达病毒包装需要的蛋白质）和包装细胞系组成。
逆转录病毒载体在外源基因表达、基因沉默、基因治疗、生物制药等得到广泛的应用。
逆转录病毒载体主要优点：转染范围广，可以感染各种细胞类型,如淋巴细胞或肝细胞、肌细胞等；转入的外源基因可完全整合；对细胞感染率高；感染细胞不产生病变,可建立细胞系长期持续表达外源基因。
逆转录病毒载体系统共由两部分组成：包装细胞系和缺陷病毒本身。
在逆转录病毒载体中，去除了正常的蛋白编码序列而保留了复制和包装信号，通过分子克隆技术将目的基因插入此载体上，而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。
当重组病毒载体导入包装细胞后，缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配，该病毒颗粒可感染其他宿主细胞，此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中，导致插入序列在宿主细胞中表达，产生目的蛋白。
宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录病毒提供结构蛋白，因而在宿主细胞内不会产生新的感染性病毒颗粒，保证了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。
服务内容
将目的基因片段克隆到逆转录病毒载体上；逆转录病毒的包装、扩增、滴度的测定。
客户提供
样品；目的基因信息或者序列。
我们提供
含有目的基因片段的逆转录病毒；所用的引物序列、测序结果；详尽完整的实验报告。