反转录病毒载体RCASBP介导的EGFP基因在DF-1细胞中的表达

反转录病毒载体RCASBP介导的EGFP基因在DF-1细胞中的表达秦建如;黎娜铭;许长剑;廖明;曹伟胜【摘要】为建立反转录病毒载体RCASBP介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在DF-1细胞中的表达体系,本研究将PCR获得的EGFP基因插入反转录病毒载体RCASBP,构建重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP,之后将重组载体转染DF-1细胞;用基于禽白血病病毒(ALV) p27抗原的ELISA检测盲传至第4代的细胞上清,ELISA阳性结果说明重组病毒拯救成功;荧光显微镜观察发现80％以上DF-1细胞都有明显的绿色荧光信号,证明DF-1细胞表达绿色荧光蛋白;对DF-1细胞基因组进行特异性PCR检测,扩增出特异性条带说明重组反转录病毒载体RCASBP-EGFP携带的EGFP基因整合到DF-1细胞的基因组中.本研究建立的RCASBP介导反转录病毒表达体系为研究ALV基因的结构和功能奠定了基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)010【总页数】6页(P2538-2543)【关键词】禽白血病病毒;反转录病毒载体RCASBP;增强型绿色荧光蛋白基因;DF-1细胞【作者】秦建如;黎娜铭;许长剑;廖明;曹伟胜【作者单位】华南农业大学兽医学院,农业部兽用疫苗创制重点实验室,广州510642;华南农业大学兽医学院,农业部兽用疫苗创制重点实验室,广州510642;华南农业大学兽医学院,农业部兽用疫苗创制重点实验室,广州510642;华南农业大学兽医学院,农业部兽用疫苗创制重点实验室,广州510642;华南农业大学兽医学院,农业部兽用疫苗创制重点实验室,广州510642【正文语种】中文【中图分类】Q785禽白血病（avian leukosis，AL）是由禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）／肉瘤病毒群病毒（Rous sarcoma virus，RSV）引起的肿瘤性疾病［1］，临床上多以免疫抑制、生长缓慢和多器官组织出现肿瘤等为其主要特征［2］。

根据病毒宿主范围、干扰情况及中和反应等可将ALV 划分为A～J共10个亚群，其中A、B、J是常见的鸡外源性ALV［3］，对养禽业的危害极大。

RCAS载体是在RSV 的基础上通过分子改造和修饰得到的反转录病毒载体［4］。

该病毒载体保留了RSV 结构组成和复制所必须的gag、pol和env基因，删除了病毒的致瘤基因src，并加入ClaⅠ酶切位点用于插入外源基因［5］。

RCASBP载体是将Bryan毒株的pol基因替换原始RCAS载体的pol基因，从而使病毒的滴度提高了5～10倍［6］，该载体被广泛用于基因功能和动物转基因模型的研究［7］。

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白［8］，当受到紫外或蓝光激发时，GFP就会发射绿色荧光［9］。

目前，通过基因改造GFP有较多的突变体，但增强型绿色荧光蛋白（EGFP）是最常用的［10］，EGFP 是一种优化的突变型绿色荧光蛋白，其荧光比野生型强35 倍，具有结构稳定、高效表达、无种系依赖性等特点［11］，更适用于细胞基因表达和蛋白定位检测及细胞示踪标记。

本研究将EGFP 基因插入反转录病毒载体RCASBP中，构建重组反转录病毒载体RCASBP－EGFP，并转染DF－1细胞，进行RCASBP－EGFP 病毒的拯救，观察EGFP蛋白在DF－1细胞上的表达，从而建立反转录病毒表达系统，为进一步进行ALV 相关基因的结构与功能研究奠定了基础。

1 材料与方法1.1 质粒、菌株与细胞株含EGFP 基因的大肠杆菌重组质粒pcDNA3.1－EGFP、反转录病毒载体RCASBP 和DF－1细胞均由农业部兽用疫苗创制重点实验室保存；大肠杆菌Top10感受态细胞购自天根生化科技公司；克隆载体pMD18－T 购自TaKaRa公司。

1.2 主要试剂ClaⅠ限制性内切酶、T4DNA 连接酶均购自NEB公司；质粒快速提取试剂盒、去内毒素质粒抽提试剂盒、SQ 组织DNA 抽提试剂盒和小量胶回收试剂盒均购自Omega公司；细胞培养基DMEM、胎牛血清和0.25%胰酶均购自Gibco 公司；脂质体LipofectamineTM2000和Opti－MEM 培养基均购自Invitrogen公司；ALV p27抗原ELISA 检测试剂盒购自IDEXX 公司。

1.3 引物设计与合成参考GenBank 中EGFP 基因的参考序列，利用生物学软件Oligo 7 设计扩增EGFP 基因的引物。

引物序列：EGFP－F：5′－GCTGAATCGATATGGTGAGCAAGG－3′；EGFP－R：5′－GCTAGATCGAT TTACTTGTACAGCTC－3′，下划线部分为ClaⅠ酶切位点，预期目的片段大小为720bp。

重组表达载体RCASBP－EGFP 的鉴定引物序列：RCASBP－F：5′－GGCAGGAAAGACAGCTATTGG－3′；RCASBP－R：5′－TGGCGACCACACCCGTCCTG－3′，预期目的片段大小为1 467bp。

引物均由上海英潍捷基生物技术有限公司合成1.4 目的基因的扩增以重组质粒pcDNA3.1－EGFP为模板，用PCR扩增EGFP 基因。

PCR 反应体系50μL：2×Go Taq PCR Mix 25μL，25pmol／L 上、下游引物各1μL，模板DNA 1μL，去离子水22μL。

PCR 反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72 ℃延伸45s，30 个循环；72 ℃再延伸10min。

将PCR 产物进行1.0%琼脂糖凝胶（含0.5μg／mL EB）电泳检测。

1.5 中间载体pMD18－T－EGFP的构建按照小量胶回收试剂盒说明书回收长度约为720bp的EGFP 基因PCR 产物，回收片段与克隆载体pMD18－T 连接30 min 后，转化至大肠杆菌Top10感受态细胞，涂菌于含Amp＋的LB 固体培养基，37 ℃倒置培养12h。

挑取单个菌落用含Amp＋的LB固体液体基培养5h后进行菌液PCR鉴定，随机选取3个阳性克隆送上海美吉生物医药科技有限公司测序，测序正确的阳性菌用锥形瓶扩大培养，之后按照质粒快速提取试剂盒说明书抽提质粒并进行ClaⅠ酶切鉴定。

1.6 重组反转录病毒载体RCASBP－EGFP的构建用ClaⅠ限制性内切酶分别酶切反转录病毒载体RCASBP和pMD18－T－EGFP，酶切体系50μL：反转录病毒载体RCASBP（pMD18－T－EGFP）2μg，10×Buffer 5μL，ClaⅠ2μL，ddH2O 补至50μL。

37 ℃酶切2h，切胶回收酶切片段。

将回收的两种产物用T4DNA 连接酶16 ℃连接过夜并转化至大肠杆菌Top10感受态细胞。

用RCASBP－F／RCASBP－R 引物进行菌液PCR 鉴定、序列测定，鉴定正确的阳性菌用锥形瓶扩大培养，并用去内毒素质粒抽提试剂盒抽提质粒，测定质粒浓度，经ClaⅠ酶切鉴定正确后于－20 ℃保存。

1.7 重组反转录病毒载体RCASBP－EGFP 转染DF－1细胞将重组反转录病毒载体RCASBP－EGFP 和反转录病毒载体RCASBP 用脂质体介导的方法转染6孔板中已长成80%～90%的DF－1 细胞，转染操作参照脂质体LipofectamineTM 2000说明书。

转染24h后，按传正常细胞的方法传代已转染的细胞，盲传至第4 代。

期间荧光显微镜观察EGFP 蛋白表达情况，细胞维持5d 后于－80 ℃保存。

1.8 拯救病毒RCASBP－EGFP的验证1.8.1 细胞培养上清的ELISA 测定将盲传至第4代的已转染重组反转录病毒载体RCASBP－EGFP或转染反转录病毒载体RCASBP的DF－1细胞反复冻融3次，细胞上清按照ALV p27抗原ELISA 检测试剂盒说明书进行。

1.8.2 病毒感染效率的测定利用半定量方法对拯救病毒进行滴度测定。

将RCASBP －EGFP 和RCASBP病毒用维持液做连续10 倍稀释（100 至10－6），分别接种已长至80%单层DF－1 细胞的96孔板，每个稀释度接种8孔，同时设两组不接种病毒的空白对照。

培养7d后测定病毒滴度，按照Reed－Muench氏法计算其TCID50。

1.8.3 前病毒基因组DNA EGFP 基因的PCR 检测将1.8.1中的已冻融3次的DF－1细胞沉淀按照SQ 组织DNA 抽提试剂盒说明书用于提取前病毒基因组DNA。

以抽提的基因组DNA 为模板，以EGFP－F／EGFP－R 为引物，对病毒基因组DNA进行EGFP 基因的PCR 检测。

2 结果与分析2.1 EGFP 基因的PCR 扩增结果以pcDNA3.1－EGFP 质粒为模板、EGFP－F／EGFP－R 为引物进行PCR 扩增，扩增出约720bp的目的条带（图1），与预期结果相符。

2.2 中间载体pMD18－T－EGFP鉴定结果将EGFP 基因插入克隆载体pMD18－T，构建中间载体pMD18－T－EGFP，pMD18－T－EGFP 经菌液PCR 和测序鉴定正确后，进行ClaⅠ酶切，出现2 692bp的载体条带和720bp的目的片段条带（图2），与预期结果相符。

2.3 重组反转录病毒载体RCASBP－EGFP鉴定结果经菌液PCR 和测序正确的重组反转录病毒载体RCASBP－EGFP，用ClaⅠ酶切鉴定，出现两条特异性条带，分别约11 600bp 的反转录病毒载体RCASBP和720bp的EGFP基因条带（图3），与预期结果一致，表明重组反转录病毒载体RCASBPEGFP构建成功。

图1 EGFP 基因的PCR 扩增电泳图Fig.1 PCR amplification of EGFPgeneM，DL2000 DNA Marker；1、2，EGFP 基因PCR 扩增产物M，DL2000 DNA Marker；1 and 2，PCR products of EGFPgene图2 pMD18－T－EGFP的酶切鉴定电泳图Fig.2 Enzyme digestion identification of pMD18－T－EGFPM，DNA Marker Ⅲ；1，pMD18－T－EGFP 质粒；2、3：pMD18－T－EGFP ClaⅠ酶切M，DNA MarkerⅢ；1，pMD18－T－EGFP plasmid；2and 3，pMD18－T－EGFP digested by ClaⅠ2.4 EGFP蛋白的表达重组反转录病毒载体RCASBP－EGFP 利用脂质体LipofectamineTM 2000转染入DF－1细胞，并盲传至第4 代，荧光显微镜观察发现约80%的DF－1细胞有绿色荧光蛋白的表达（图4A），而转染反转录病毒载体RCASBP组（图4B）和正常DF－1（图4C）均未见EGFP蛋白表达信号。