人HIF1α基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定
人HGF基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的构建和鉴定[1]
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WANG Yun2Fang , NAN Xue , YUE Wen , LI Yan2Hua , YAN Fang , PEI Xue2Tao 3
图 1 重组逆转录病毒载体质粒构建流程示意图
换完全培养液 。细胞转染 48 h 后按 1∶15 传代 ,加入含 600 μg/ ml G418 筛选 14 d ,直至抗性细胞集落形成 。挑选大的健 康的细胞集落 ,用完全培养液扩大培养 ,以制备含病毒的包 装细胞上清 ,测定病毒滴度并冻存细胞 。 1. 5 重组逆转录病毒滴度的测定
PT67 细胞用含 10 %胎牛血清的 DMEM/ F12 培养液 (完 全培养液) 培养至 95 %汇合 。将 pMSCV2HGF 5μg 加入 250μl 无血清培养液 ,取 LF2000 10μl 加入 250μl 上述培养液 ,两者 混匀后于室温放置 20 min。将 PT67 细胞用培养液洗 2 次 ,缓 慢滴入用 1 ml 培养液稀释的 DNA2LF2000 混合液 。培养 6 h 后 ,加入 1 ml 含 20 %胎牛血清的培养液 ,继续培养 24 h 后更
军事医学科学院院刊 2004 年 6 月 第 28 卷 第 3 期
Bull Acad Mil Med Sci , Jun 2004 ; Vol 28 No 3
205
人 HGF 基因重组逆转录病毒表达载体及 包装细胞株的构建和鉴定
论 著
王韫芳 , 南 雪 , 岳 文 , 李艳华 , 闫 舫 , 裴雪涛 3
根据 hHGF2cDNA 编码区的序列并分别引入 Hpa Ⅰ和 BamH Ⅰ酶 切 位 点 合 成 引 物 1 , P1 : 5′2CCG GTTAAC AT2
Anti-HIF-1α-pEGFP重组质粒的构建及表达
［ ｂｔａｔ Ａ ｓｒｃ］
０ｂｅｔ ｅＴｏｃ ｎ ｔｕ ｔａ ｄｔａ ｓｅｔＨＩ 一 （ ｙ ｏ ｉ ｉｄ ｃ ｌ ｆｃｏ ｓ ｅ ｅｒｃ ｍｂ— ｊｃｉ ｏ ｓｒ ｃ ｎ ｒｎ ｆｃ Ｆ １【 ｈ ｐ ｘａ ｎ ｕ ｉ ｅ ａ ｔｒ）ｇ ｎ ｅｏ ｉ ｖ ０ — ｂ
ｎ ｎ ｎ ｉｅ ｓ ｌｓ ｉ ＥＧＦＰ Ｈ Ｉ 一 ａ ｉ ｒ ｅ ｏ ｄ ｔ ｃ ｈ ｕ ｃ ｉ ｎ ｏ ｈ Ｉ － ａ ｐ ｏ ｅ ｎ Ｍ ｅ ｈ ｄ — ａ ｔａ ｔｓ ｎ ｅ ｐ ａ ｍ ｄ ｐ — Ｆ １ ｎ ｏ ｄ ｒｔ ｅ ｅ ｔｔ ｅ ｆ ｎ ｔｏ ｆｔ ｅ Ｈ Ｆ １ ｒ ｔ ｉ ． ｔ ｏ ｓ Ｒｅ
Ｉ ＮＡ ｒ Ｐ ｉ’ ＬＡＳ — Ｉ ＾ⅡＤ ＡＮＴＩＥＧ Ｐ一 Ｆ ｌ Ｉ ＨＩ ＿ ＿ＨＩ － ａ Ｎ Ａ Ｅ Ｃ 】
Ｏ ｇ ＴＲＵＣ ＯＮ ＮＳ ＴＩ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳ Ｉ Ｓ ＯＮ ＯＦ
Ｓ ｎ ｐｎ ｏ ｇ Ｙｕ ｉｇ，Ｔｉｎ Ｘｕ ｈ ，Ａｏ Ｑｉ ｎ ａ ｎ ｌ 。 ｉ
（ ｐａ ｔ ｎ ｆ Ｄｅ ｍａ ｏｏ ｙ，Ｄｏ ｇ ｕ Ｈｏｐｉａ ｆ ｈ ｎ，Ｗ“ ａ ３ ０ ４ Ｄｅ ｒ ｍｅ ｔ ｒ ｔｌｇ ｏ ｎ ｈ ｓ ｔ ｌｏ ａ ｂ ｎ４ ０ ７ ： Ｄｅ ｒ ｍｅ ｔ ｆ Ｏｂ ｔｔｉｓ＆ Ｇｙ ｅ ｏｏ ｙ，Ｔｈ ｎ ｒ ｌＨｏｐｉａ ｆ ｈ ｎ，Ｗｕ ａ ３ ０ ４； ｐａ ｔ ｎ ｓｅｒｃ ｏ ｎ ｃ ｌｇ ｅＣｅ ｔａ ｓ ｔ ｌｏ Ｗｕ ａ ｈ ｎ４ ０ １ Ｉ ｓｉｕ ｅ ｆ ｔ ｏｏ ｎ ｔｔ ｔ Ｐａ ｈ ｌｇｙ，Ｔｏ ｊ ｏｐｉ ｌ ｎ ｐａ ｔ ｎ ｆ ｔ ｏｏ ｙ， ｏ ｎ Ｈ ｓ ｔ ，ａ ｄ Ｄｅ ｒ ｍｅ ｔｏ Ｐａ ｈ ｌｇ ｇｉ ａ Ｔｏ ｊ ｄｉａ ｌｅ ，Ｈｕ ｚ ｏ ｇ Ｕｎ ｖ ｒｉｙ ｏ ｃｅ ｃ ｎ ｃ ｎ ｌｇ ，Ｗｕ ａ ３ ０ ０，Ｃ ｉ ａ ｎｇ Ｍｅ ｃ ｌＣｏ ｌｇｅ ｉ ａ ｈ ｎ ｉ ｅ ｓｔ ｆ Ｓ ｉｎ ｅａ ｄ Ｔｅ ｈ ｏｏ ｙ ｈ ｎ４０ ３ ｈｎ ）
HIF-1α基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
HIF-1α基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定【摘要】目的构建HIF-1α基因RNA干扰慢病毒载体。
方法选定HIF-1α基因RNAi靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ双酶切后的慢病毒载体pLentilox3.7(pLL3.7)连接,产生pLL3.7 HIF-1α慢病毒载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽取质粒后,用限制性内切酶XbaⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定,将阳性克隆送金斯特公司进行测序鉴定;用PHR、pVSVG和pLL3.7慢病毒载体共转染包装细胞293T细胞(磷酸钙转染法),包装产生慢病毒, 将收集的病毒上清经高速离心浓缩后,按一定比例稀释,然后感染293T细胞,用流式细胞仪检测293T细胞GFP蛋白的表达水平,从而测定病毒滴度。
结果酶切和测序证实,构建出HIF-1αshRNA的慢病毒载体pLL3.7 HIF-1α;包装慢病毒,测得离心的浓缩病毒悬液的滴度为2×108 TU/ml。
结论成功构建HIF-1α基因RNAi慢病毒载体。
【Abstract】Objective To construct a lentiviral vector of RNA interfered(RNAi)HIF-1αgene. Methods To confirm the targeting sequence of HIF-1α gene that can be effectively silenced by RNA inference. The cDNA containing both sense and antisense Oligo DNA fragments of the targeting sequence was designed, and cloned into the pLentilox3.7(pLL3.7) vector which was digested by XhoI and HpaI. The obtained lentiviral基金项目:厦门市卫生局资助项目(项目编号:3502Z20077055);厦门市科技局资助项目(项目编号:3502Z20089001)vector containing HIF-1α shRNA was confirmed by digestion and sequencing. Using lentiviral vector PHR、pVSVG and pLL3.7 HIF-1α to cotransfect 293T cells, then the collected lentivirus. The titer of virus was tested according to the expression level of GFP. Results Digestion and DNA sequencing demonstrated that the constructed lentivirus vector pLL3.7 HIF-1α which can produce HIF-1α shRNA. The titer of concentrated virus was 2×108 TU/ml. Conclusion The lentivirus RNAi vector targeting HIF-1α is constructed successfully.【Key words】HIF-1α;RNAi;Lentivirus缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是目前所发现的正常细胞以及肿瘤细胞适应缺氧的最关键的转录因子[1],其基因的功能研究具有非常重要的意义。
靶向卵巢癌HIF-1α基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定
ｐ ｕ ｅ．ｆ／ ｅ 粒 带 有 绿 色 荧 光 蛋 白基 因 ， Ｓ ｐｒｇ ｎｏ质 ｐ
序 列对 比 ， 结果 完全 一致 ， 示重 组质 粒构 建成 功 。 提
２ ２ 重组 质粒 转染 Ｓ ＯＶ ／ Ｄ ． Ｋ ３ Ｄ Ｐ细 胞
Ｒｅ ｅｓ ５ ． ｖ ｒｅ： ＡＧＣＴｒＩ ℃ＣＡＡＡＡＡＡ［ Ｉ ℃ＣＡＧＡＧＴＣ ＡＣＴ．
ＧＧＡＡＣＴＦ Ｃ ℃ ＡＡ ＣＴ ｎ ＡＧ１ Ｃ ］ ＡＧ ＡＣＩ ℃Ｇ ℃１ ＧＧ 一 ３
中 国实 验 诊 断 学
２１ ０ ０年 ８月
第 １ ４卷
第 ８期
－－－—
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１６ ２ ５ ・— － － —
文章 编 号 ：０７ ２７ ２ １）８ ２５ ２ １０ —４８ （０００ —１６ —０
靶 向卵巢 癌 Ｈ Ｆ １ 基 因 ｓ Ｎ Ｉ一（ ］ ｃ ｉ Ａ真核 表 达 载 体 Ｒ 的构 建 及 鉴 定
邹颖 刚 薛惠 荣 崔 满 华 ， ，
（． １吉林大学第 二医院 妇产科 ， 吉林 长春 １０４ ； ． ３０ １ ２ 解放 军第二二二 医院 妇产科 ）
Ｒ Ａ干 扰 （ Ｎ ｔ ｅ ｎｅＲ ） 生 物 体 内 Ｎ Ｒ Ａ ｉ ｅ ｒ ｃ， Ｎ 是 ｎｒ ｅ ｆ 普遍存 在 于 Ｒ Ａ水平 上调 节基 因表达 的方 式… 具 Ｎ １， 有很强 的转 录后 基 因沉 默 作 用 ， 已广 泛 用 于抗 肿 瘤
的研究 中 。缺 氧诱 导 因子 一ａ表 达与 肿 瘤 的耐 药 可 １ 能 有密 切关 系 ［ 卵巢 癌 细胞 中亦 有 Ｈ Ｆ１ 蛋 白 的 ， Ｉ．ａ 高 表达 Ｅ ， ３ 因此抑 制卵 巢 癌细 胞 中 Ｈ Ｆ １ 因 的表 Ｊ Ｉ． 基 达 可 能 逆 转 肿 瘤 耐 药 。本 研 究 构 建 靶 向 卵 巢 癌 Ｈ ＦＩｓ Ｎ 真 核 表 达 载 体 ｐｈ Ｎ — Ｉ ， 进 一 步 Ｉ—￣ｉ Ａ Ｒ ｓＲ Ａ Ｈ Ｆ 为
HIF1α-shRNA表达载体的构建与鉴定
HIF1α-shRNA表达载体的构建与鉴定HIF1α是一种重要的响应细胞缺氧的转录因子，参与了一系列细胞代谢和生存过程的调控。
因此，研究HIF1α的表达调控机制对于深入理解细胞生物学过程具有重要意义。
RNA干扰技术是一种有效的基因沉默方法，通过转染表达特定的shRNA序列可以降低目标基因的表达水平。
在本实验中，我们通过克隆HIF1α-shRNA序列到载体中，在细胞水平上验证其对HIF1α的抑制效果，为后续研究提供基础保证。
1. 载体构建我们选择pGPU6/GFP/Neo载体作为表达载体，该载体具有绿色荧光标记并带有慢病毒包装序列，适合于在细胞中稳定表达。
我们在载体中插入了针对HIF1α编码序列的shRNA 序列，并在该序列的末端添加了环状病毒MluI启动子和miR30e终止子。
所选shRNA序列如下：5'-GGTCCTGTGCTTCAACTAT-3'2. 载体鉴定为验证所构建的载体是否能在细胞中稳定表达HIF1α-shRNA，我们进行了荧光定量PCR检测和Western Blot分析。
2.1 荧光定量PCR检测我们在293T细胞中转染了HIF1α-shRNA载体和对照载体（不含shRNA序列）后，提取总RNA并进行反转录。
然后，利用荧光定量PCR技术检测HIF1α mRNA表达水平的变化。
结果显示，HIF1α-shRNA载体转染组的HIF1α mRNA表达水平较对照组显著降低，表明HIF1α-shRNA能有效沉默目标基因的表达（图1）。
2.2 Western Blot分析综上所述，我们成功构建了HIF1α-shRNA表达载体，并证实了该载体在细胞水平上能够有效降低H IF1α表达水平。
该表达载体可为研究细胞代谢和生存过程提供重要的工具和支持。
HIV-1 Tat基因重组原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与功能鉴定
（ Ｅ ．ｃ ｏ ｌ ｉ ） Ｂ Ｉ ２１（ Ｄ Ｅ ３ ） 感受态细胞 ， 用异丙基硫代一 Ｂ — Ｄ 一 半乳糖苷 （ Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ） 诱导表达融 合蛋 白。表达产物 经十二 烷基硫 酸钠一 聚丙烯酰胺凝胶 电泳 （ Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ ） 和蛋白质 印迹鉴定后 ， 通过镍亲 和层 析柱纯化 。纯化后 蛋 白采用虫荧 光素酶 报告实验进行 功能验证 。结果 ：限制性 内切酶酶切和基 因测序证实 ， 成功构建 了含有 ｆ 基 因的重组 原核表达 质粒 。 蛋 白质印迹结果显示 ， Ｈ ｉ ｓ 融合蛋 白在大肠埃希菌 中得到正确表达 ， 纯化 后获得 了相对 分子质量为 １ ８ Ｘ １ ０ 的融合蛋
Ｊ ｕ １ ．２ ０ １ ３
Ｈ Ｉ Ｖ 一 １ Ｔ ａ ｔ 基 因重组 原 核表 达 载体 的构 建 及 融 合 蛋 白 的表 达 纯 化 与 功 能 鉴 定
邱会 平 ， 程晓 东 ， 卢春
（ 南京 医科大学 １ ． 基础医学实验教学中心 ， ２ ． 微生物学与免疫学系 ， 江苏 南 京 ２ １ ０ ０ ２ ９ ）
ｒ ｉ ｆ ｙ ｔ ｈ ｅ ｆ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｉ ｎ Ｅ ． ｃ ｏ ｌ ｉ ．Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ： Ｔ ｈ ｅ Ｄ Ｎ Ａ ｆ ｒ ａ ｇ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ Ｔ ａ ｔ ｇ ｅ ｎ ｅ ｆ ｒ ｏ ｍ ｐ ｃ Ｄ Ｎ Ａ ３ ． １ （＋） ／ Ｔ ａ ｔ ｌ ｏ １
生物学功能。
［ 关键词 ］ Ｔ ａ ｔ 基 因；原核表达 ； 融合蛋 白； 人免疫缺 陷病毒 ；卡波氏肉瘤病毒 ［ 中图分类号 ］ Ｒ ３ ４ ； Ｑ ７ ８ ［ 文献标 志码 ］ Ａ ［ 文章编号］ １ ６ ７ １ — ７ ７ ８ ３ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４— ０ ３ ０ ８— ０ ５
重组人HIF-1α真核表达载体质粒的构建与鉴定
Ａ（ｎ ｉ — ９ ） ｆ ｇ ｔｔ ｆｍｎ ｉ ７６ ８６ ｗｒ ｃｎ ｒｃ ｄｉ ｅ ｅ ｔ ｔ ｈｔｅｖｃ ｒ ．ｒ ｓ ｒ ａｏ Ｅ ｃｌＪ ０ ａ￣ｏａ ｄ １ ３０ ａ ｌ ／ｍ ａ ｉ ａ 凼 ８ — ２） ｅ ｓ ｕｔ ａ ｓｒ ｉ ｏｈ ｓｕｔ ｅｔ Ｔａ ｆ ｍ ｔｎｏ ． ｉ Ｍ１ ｃｓ ￣ ＇￣ Ｂ ａ ｏｃ ｅ ｏ ｔ ｅ ｎ ｎ ｔ ｎ ｅ ｄ ｄ ｌ ｏＴ ｎ ｏ ｉ ｆ ｏ ９
人 Ｈ Ｆ１ 所选用的 ｐＤ Ａ ／ ｉ ａ 高表达 目的基 因 ， Ｉ ．ｔ ｅ ｅ Ｎ ４ Ｈｓ ｘ可 Ｍ 为利用其进行人 Ｈ Ｆ１ｔ 因的克隆与表 达及 其抗体 的制备研 究奠定 了基 Ｉ．ｅ基
础
【 关键词 】 缺氧诱导 因子 ； 载体 ； 质粒 【 中图分类 号】 Ｑ７ ５ 【 文献标识码 】 Ａ 【 文章编号 】 ０５ － ０ （０７ ０－ ８－ ２３ ３４ ２０ ）６０ ７０ ４ ７ ３
肠杆茵 Ｊ ０ ，Ｂ平板 培养基 筛选 茵落， Ｍ１９ Ｌ 提取 质粒 。测序正确后 双酶切先后克隆进入 ｐ Ｄ Ａ ／ ｉ ｘ ｃ Ｎ ４ Ｈ ｓ Ａ载体 。 Ｍａ 结果
Ｈ Ｆ１ｔ Ｉ ． 真核表达栽体质粒 ， Ｐ Ｒ扩增获得 的 目的基 因分子量与预计 的相 同， ｅ 经 Ｃ 插入 ｐ Ｄ Ａ ／ ｓ ｘ 栽体部位正确 。 ｃ Ｎ ４ Ｈｉ Ａ Ｍａ 结论
【ｂｔ ｃ Ｏ ｊ ｔｅ ｏ ｏｓｕ ｔ ｋ ｓｉｅ ｒｓｎ ｌｍｄ Ｄ Ａ－ ＨＦｌ ｃ ｂ ａ ｍ ｎ ｙｏａｎｕｉｅａｏ １． Ａ ｓａｔ ｂ ｃｖ Ｔ ｎｒ ｔｈ ｅ ａ ｏｅ ｘ ｅｉ ａ ｉＰ Ｎ ４ ｈ ／・ｔｆ ｏ ｉ ｎ ｈ ａ ｈ ￣ －ｄｃ ｆ ｔ－ ｒ 】 ｅｉ ｃ ｔｃ ｅ ｕ ￣ ｔ ｐ ｓｏ ｐｓ Ｏ ｒ ｅｏｒ ｍ ｎ ｔ ｕ ｐ ｉ ｂ ｃ ｒａ ｅ ｌ
hif1α-shrna表达载体的构建与鉴定
S c ie nc e &T e c hno lo g y V is io n 缺氧诱导因子-1（hypoxia -inducible factor -1,HIF -1）最初是从缺氧诱导的肝癌细胞Hep3B 的细胞核中发现的一个转录因子，由氧敏感的α亚基（HIF -1α）和持续稳定表达的β亚基（HIF -1β）以异源二聚体的形式组成，HIF -1α是调节亚单位，决定HIF -1的活性，HIF -1β则与稳定HIF -1及其二聚化有关[1]。
已经证实，HIF -1可介导肿瘤细胞产生一系列的缺氧适应反应，与肿瘤细胞的糖酵解途径密切相关，使肿瘤细胞在相对缺氧的状态下获得更多的能量供应，以维持存活、生长和分裂[2]。
本研究将构建HIF1α-shRNA 表达载体，为进一步研究其在肿瘤发生发展中的作用提供生物学基础。
1材料和方法1.1材料表达载体pG1.1（武汉巴菲尔），限制性内切酶BsaI 、SacI （美国NEB ），T4DNA 连接酶、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、质粒提取试剂盒、感受态细胞DH5α（北京天根），DNA 寡核苷酸由上海生工合成。
1.2方法1.2.1序列设计合成已验证有效干扰HIF1α表达的siRNA 正义链序列为5'-GCCTCTTTGACAA ACTTAA -3'，依据pG1.1载体的插入位点和接头结构，设计合成两条互补的摘要目的：构建HIF1α-shRNA 表达载体并鉴定，为进一步研究其在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。
方法：设计合成两条互补的编码HIF1α-shRNA 的DNA 寡核苷酸单链，退火形成互补双链，后将退火产物与酶切线性化的表达载体pG1.1连接后，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒并酶切鉴定，挑取克隆正确的重组质粒去测序鉴定插入序列。
结果：重组质粒酶切结果显示退火片段连接到pG1.1载体里，经测序分析重组质粒插入序列与合成的寡核苷酸序列一致。
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文章编号:100025404(2004)1821639204 论著人HIF1α基因重组逆转录病毒载体构建及鉴定段小军1,杨 柳1,董世武2,周 跃3,唐康来1,胡 鸢1 (第三军医大学:1西南医院骨科,2基础医学部解剖学教研室,重庆市生物力学实验室,重庆400038,3新桥医院骨科,重庆400037) 提 要:目的 构建人缺氧诱导因子21α(HIF21α)基因重组逆转录病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞感染效率。
方法 采用基因工程技术,经过2次亚克隆将HIF21α基因片段克隆至含IRES2EG FP逆转录病毒载体上,鉴定后用脂质体法转染PT67细胞进行包装、扩增,最后用重组逆转录病毒感染NIH3T3细胞。
其中采用PCR方法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测。
结果 酶切鉴定及PCR结果与HIF21α基因重组逆转录病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达(114×106pfu/ml),并对NIH3T3细胞有强感染能力。
结论 应用基因工程技术,成功构建了含人HIF21α基因重组逆转录病毒载体,为应用于治疗性血管生成创造了条件。
关键词:逆转录病毒;缺氧诱导因子21;基因克隆 中图法分类号:R782;R394233;R394.3 文献标识码:AConstruction and identification of human hypoxia2inducible factor21αgene recombinant retrovirusDUAN X iao2jun1,Y ANGLiu1,DONG Shi2wu2,ZH OU Y ue3,T ANG K ang2lai1,H U Y uan1(1Department of Joint Surgery,S outh2 west H ospital,2Department of Anatomy,C ollege of Medicine,3Department of Orthopedics,X inqiao H ospital,Third Military Medical University, Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o construct the recombinant retrovirus of human hypoxia2inducible factor21α(HIF21α) gene and to observe its ability to in fect NIH3T3fibroblasts.Methods The full2length human HIF21αcDNA was cloned into the retroviral vector containing internal ribos omal entry site(IRES)and enhanced green fluorescent pro2 tein(EG FP)by the method of gene engineering.Then the retroviral vector with HIF21αwas trans fected into PT67 cells using the lipofectine DOT AP and NIH3T3cells was in fected by the recombinant retrovirus.The target gene was detected by polymerase chain reaction(PCR).The titer and its in fection rate were determined using the EG FP ex2 pression with a fluorescent microscope.Re sults Restriction endonuclease and PCR analyses con firmed that the hu2 man HIF21αcDNA was success fully inserted into the retroviral vector.The titer of recombinant retrovirus with HIF21αgene was114×106pfu/ml and the retrovirus had a strong effect on NIH3T3cells.Conclusion The recombinant retrovirus containing HIF21αgene has been success fully constructed by the method of gene engineering,which lays a foundation for the application in therapeutic angiogenesis. K ey w ords:retrovirus;hypoxia2inducible factor21;gene clone 缺氧诱导因子21(hypoxia2inducible factor21,HIF21)是近年来发现的一种核转录因子,对缺氧状态下的血管生成(Angiogenesis)起核心调控作用,同时还具有调节细胞能量代谢,增强机体氧供给等作用1。
HIF21是由α亚基和β亚基组成的异二聚体,属于bH LH2PAS 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270375) Supported by the National Natural Science F oundation of China(30270375) 作者简介:段小军(1972-),男,四川省渠县人,博士研究生,主治医师,主要从事组织工程学、血管生成方面的研究,发表论文11篇。
电话:(023)68754000273007,E2mail:dxj9@ 通信作者:杨 柳,电话:(023)68765280,E2mail:jointsurgery@ 收稿日期:2004201215;修回日期:2004206221家族成员,其中β亚基在细胞内稳定表达,α亚基在功能调控方面起主要作用2。
为此,本实验采用基因工程技术,体外构建表达人HIF21α基因重组逆转录病毒载体,旨在为进一步应用HIF21促进血管生成的研究创造条件。
1 材料和方法111 质粒和菌株 含人HIF21α质粒(215kb)pBSK hHIF1αT7由瑞士苏伊士大学G assmann教授惠赠。
逆转录病毒载体pLEG FP2N1、pIRES22 EG FP购自Clontech公司。
大肠杆菌DH5α菌株、病毒包装细胞PT67由创伤、烧伤与复合伤全军复合伤研究所国家重点实验室9361第26卷第18期2004年9月 第 三 军 医 大 学 学 报ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AEV ol.26,N o.18Sep.2004馈赠。
112 酶类和主要生化试剂 限制性内切酶、DNA平末端连接试剂盒、DNA胶回收试剂盒、PCR试剂盒等(T akara公司),T4DNA链接酶、质粒提取试剂盒(Promega公司),脂质体DOT AP(R oche公司),DME M培养基(Hyclone公司),PCR引物由上海生工公司合成。
113 质粒提取、酶切、连接及转化 参照文献3的方法进行。
114 带IRES2EG FP病毒表达载体(命名为pIRES3)的构建及鉴定1.4.1 IRES2EG FP片段的制备 采用PCR法扩增IRES2 EG FP片段,以pIRES22EG FP为模板,上游: 5′2CCGGG AT CCG CCCC2T CT CCCT CC23′含Bam HⅠ酶切位点,下游:5′2T ATG AT CT AG AG2T CG CGG23′含XbaⅠ酶切位点,引物浓度20μm ol/L。
反应条件:变性94℃×10min,然后94℃×60s,退火54℃×60s,延伸72℃×90s,共30个循环,最后72℃×10 min。
片段纯化回收后,用Bam HⅠ+XbaⅠ双酶切后琼脂糖电泳、胶回收,产物全长1326bp。
1.4.2 pIRES3表达载体的构建 用Bam HⅠ+XbaⅠ双酶切pLEG FP2N1载体16h,琼脂糖电泳、胶回收5778bp片段。
以1∶3分子数比例,混合pLEG FP2N1载体片段和IRES2EG FP片段,用T4DNA链接酶进行链接反应。
常规方法进行DH5α感受态转化、铺含氨苄青霉素琼脂粉平板、挑选数个菌落扩增后提取质粒。
1.4.3 pIRES3表达载体的鉴定 ①酶切鉴定,选用HindⅢ酶切构建的重组表达载体和pLEG FP2N1载体;②PCR法鉴定,条件同前IRES2EG FP片段的制备。
1.5 pIRES3/HIF21α载体的构建及鉴定1.5.1 pIRES3/HIF21α载体的构建 ①HIF21αcDNA基因片段的制备:用Eco RⅤ酶和DraⅠ酶从pBSK hHIF1αT7载体上切下HIF21α全长片段,胶回收217kb平滑末端DNA片段;②pIRES3载体处理:用Bam HⅠ酶切pIRES3载体16h,琼脂糖电泳、胶回收线性cDNA片段,利用试剂盒中T4DNA聚合酶平末端处理。
③链接转化过程:以1∶10分子数比例,混合pIRES3载体片段和HIF21αcDNA基因片段,用T4DNA链接酶进行连接反应24h(16℃)。
常规方法进行DH5α感受态转化、铺含氨苄青霉素琼脂粉平板、挑选数个菌落扩增后提取质粒。
1.5.2 pIRES3/HIF21α载体的鉴定 ①酶切鉴定:选用Xba Ⅰ+StuⅠ、XbaⅠ+HpaⅠ以及HindⅢ酶切构建的重组表达载体和pIRES3,挑选正确链接的载体进行后序实验。
②PCR法鉴定:以pIRES3/HIF21α载体为模板,pIRES3为对照组。
使用Primer Premier5.00程序,设计检测hHIF21α的特异性上游:5′2 AAACC ACCT ATG ACCTG C23′,下游引物:5′2G T CG TG CTG AA T AAT2 ACC ACT C23′,引物浓度20μm ol/L。
反应条件:变性94℃×10 min,然后94℃×60s,退火54℃×60s,延伸72℃×80s,共30个循环,然后72℃×10min。