逆转录病毒载体pOZ—KLF5的构建及鉴定

逆转录病毒载体pOZ—KLF5的构建及鉴定

摘要：为研究KLF5的相互作用蛋白从而深入探索其生物功能，构建了C端带有FLAG、HA、6xHis三标签的pOZ-KLF5真核表达逆转录病毒栽体。pOZ-KLF5栽体可通过一次转录得到双顺反子转录单位，即一个转录物能表达两种独立存在的蛋白质：三标签融合蛋白KLF5-3xTag和筛选标记——白细胞介素-2受体a （IL-2Ra）。通过偶联IL-2Ra抗体的磁珠成功筛选出KLF5-3xTag表达阳性的293T细胞，经Western-blot检测细胞内KLF5-3xTag表达情况及其对293T细胞增殖及周期的影响，发现KLF5-3xTag能够促进细胞克隆的形成并使S期细胞增多，且可被已知E3泛素连接酶WWP1降解，与已有报道一致。进一步通过免疫沉淀实验证明了与KLF5融合的标签的免疫反应性。该质粒的成功构建为研究KLF5相互作用蛋白及深入探索其生物功能奠定了基础。关键词：KLF5；双顺反子转录；真核表达；三标签融合蛋白中图分类号：Q812 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）02-0124-07Construction and Characterizations of pOZ-KLF5 Retroviral PlasmidZHAO Xin-yu，WANG Wei-xi，LU Ze-lan，HUANG Lei，ZHAO Ke-wen*（Department of Pathophysiology，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200025，China）Abstract：To analyze KLF5 interacting proteins and explore the biological functions of KLF5，the eukaryotic expression retroviral plasmid pOZ-KLF5，with the FLAG，HA，6xHis triple tags at C-terminal，was con?structed. Plasmid pOZ-KLF5 can get a bicistronic transcription unit after once transcription and express two independent proteins：triple-tagged fusion protein KLF5-3xTag and selection marker interleukin-2 receptor a （IL-2Ra）. 293T cells expressing KLF5-3xTag were successfully selected by the magnetic beads coupling IL-2Ra antibody，and the expression of KLF5-3xTag was detected by Western-blot. Then，the proliferation and cell cycle of 293T were tested，and the results indicated that KLF5-3xTag promotes the proliferation of cell colonies and the Gl/S transition.In addition，co-expression of WWP1，a known E3 ligase of KLF5，can decrease KLF5-3xTag protein level，which is consistent with previous reports. Furthermore，immunoprecipi- tation experiment was applied to prove the immunoreaction of the tags. The successful construction of pOZ- KLF5 provides a powerful tool to study the interacting proteins of KLF5 and to explore the biological func?tions of KLF5.Key words：KLF5；bicistronic transcription；eukaryotic expression；triple-tagged fusion protein（Life Science Research，2015，19（2）：124?130）KLF5蛋白是类KtlippeKKriippel-likefactors，KLF）转录因子家族的一员，属于基础转录因子。到冃前为止该家族巳经有17个成员被鉴定出来。KLF5又名BETB2（basictranscriptionelement-bindingprotein2）和IKLF （intestine-enrichedKriippel-likefactor），在胚胎发育、细胞周期、细胞生长与分化、维持细胞干性等生物过程中发挥作用。研究发现KLF5在人和小鼠的小肠、结肠、胃、胰腺、胎盘、睾丸、骨骼肌、肺、膀胱和子宫等组织中广泛表达[1-3]。KLF5能与多个基因的GCbox区域结合从而调控其转录。KLF5蛋白C端含有KLFs家族特征性的、可以结合基因组DNA的3个串联重复的锌指（zincfinger，ZF）结构域，在ZF结构域前含有富含脯氨酸的转录激活结构域。值得关注的是，KLF5在不同的细胞类型中发挥的作用不同，已有的研究提示这可能与KLF5的

翻译后修饰有关。KLF5蛋白有不同的翻译后修饰，包括磷酸化、乙酰化、泛素化和SUMO化修饰，经过翻译后修饰的KLF5可以与不同的蛋白相互作用从而发挥不同甚至完全相反的功能[4.5]。为了研究KLF5在真核生物不同生理及病理条件下的相互作用蛋A从而深入研究其生物学功能，我们构建了逆转录病毒真核表达载体P0Z-KLF5，通过磁珠筛选出阳性克隆，在检测KLF5生物功能的同时，验证了与目的蛋白KLF5融合的标签的免疫反应性。1材料与方法1.1材料大肠杆菌DH5a感受态（Invitrogen，美国），pOZ-C载体[6]（简称pOZ，C端带有FLAG和HA标签，Addgene，美国），质粒提取试剂盒（QIAGEN，美国），凝胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒（Tian-gen，中国），XhoⅠ、NotI核酸内切酶、T4DNA连接酶（Takara，日本），LB培养基（Oxoid，英国），X-tremeGENE9转染试剂（Roche，美国），MG132（Sig-ma，美国），抗FLAG-M2亲和凝胶、抗HA亲和凝胶（Sigma，美国），抗IL-2Ra抗体（Upstate，美国），Ni-NTA琼脂糖（QIAGEN，美国），DynabeadsM450（Invitrogen，美国），抗KLF5抗体（Protein-Tecli，美国）c1.2pOZ-KLF5表达载体的构建根据逆转录病毒载体pOZ 的多克隆位点，设计带有XhoI和NotI酶切位点（见斜体）的KLF5扩增引物，在C端PCR引物中引人了6xHis标签（见下划线）。引物序列Forward：5’（-GGGCrCGAGTGCCACCATGGCTACAAGGG-TGCTGAGC-3’，Reverse5’-CCCGCGGCGGCQI-GGTGGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGCCTCTTCA-TATG -3’。以人KLF5的CDNA为模板，PCR扩增C末端带有6xHis标签的KLF5基因’命名为ALF5-6xHis。PCR条件如下：94℃变性3min，94°C 30s，55℃30s，72℃1min，30个循环，72℃；延伸10min，4℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，然后分别用XhoI和I酶切PCR 产物和P0Z-C载体，用胶回收试剂盒回收酶切后的AXF5片段与载体，用T4DNA 连接酶将KLF5-6xHis与pOZ载体连接，转化感受态DH5a，挑选阳性克隆于3mL 的LB培养基小量扩增，并用质粒提取试剂盒提取所构建的质粒。经XhoI和Not Ⅰ酶切确定目的片段的插入，测序证实插入载体目的片段的正确性，质粒被命名为P0Z-KLF5。1.3稳定表达pOZ-KLF5质粒的细胞系筛选采用Roc.he公司的X-tremeGENE9试剂将逆转录病毒载体P0Z-KLF5连同病毒包装辅助质粒gag-Pol、VSV-g—起转染包装细胞，48h后收集具有感染能力的逆转录病毒感染293T细胞，由于P0Z-KLF5质粒可以同时转录并表达两种蛋白质：目的蛋白KLF5和筛选标记白细胞介素-2受体a（IL-2Ra），因此可以通过偶联IL-2Ra抗体的DynabeadsM450磁珠筛选pOZ-KI，F5病毒感染的293T细胞，从而得到稳定表达三标签融合的目的蛋白KLF5（简称KLF5-3xTag）的293T细胞系。1.4pOZ-KLF5质粒在真核细胞表达的鉴定收集1.3中获得的稳定表达KLF5-3xTag的293T细胞的总蛋白，WestemBlot方法检测目的蛋白KLF5-3xTag的表达情况。1.5细胞水平检测KLF5的生物学功能使用1.3中获得的稳定表达KLF5-3xTag的293T细胞进行克隆形成实验和细胞周期分析实验，检测KLF5-3xTag蛋白的表达对细胞增殖及细胞周期的影响。克隆形成实验分别将100个 1.3筛选的对照组和KLF5-3xTag表达组293T细胞接种到六孔板中培养10d，吸去上清液，用PBS 洗两遍，冰甲醇固定细胞后结晶紫染色，晾干后拍照，并对直径超过100μm的克隆进行统计分析。使用同样的对照组与KLF5-3xTag表达组293T细胞检测细胞周期：分别离心收集lxlO6个细胞，用PBS洗两遍后，加入预冷70%乙醇于-20°C 固定过夜，第二天用PBS洗两遍，加入PI染料和RNaseA于37℃避光孵育30min，最后用流式细胞仪检测周期。1.6Western-blot检测WWP1对KLF5-3xTag蛋白的