逆转录病毒载体pOZ—KLF5的构建及鉴定
293T逆转录病毒制备最终版
293T逆转录病毒制备（慢病毒包装）1.转染前一天，10%FBS DMEM不含双抗培养基种3*10^6细胞至10cm dish，培养24h（3盘 NC #3 #4）2. a.用OptiMEM 470ul稀释Fugene9 30ul(NC/Sh#3/Sh#4)，充分吹打混匀，RT5minb.Target plasmid：3.75ug (NC/Sh#3/Sh#4)Gag-pol：3.75ugVSVG：2.5ug（8/5ug pCDH 6/3.33ug psPAX2 2/1.67ug PMD）c. 将上述准备的质粒混合液滴加到optimem与Fugene9的混合液中，RT静置20min；转染混合物逐滴加至细胞中3. 转染24h之后，弃上清液，更换新鲜培养基，置37°细胞培养箱中继续培养病毒液的收集1.转染48h 后（此时293T长满），收集上清液于15ml 离心管中，3000rpm离心20min2.将上清液用0.45um滤头过滤,再向10cm dish 加10ml培液3.24h之后，再次收集上清液，0.45um滤头过滤，随后保存于-80°冰箱中。
慢病毒感染目的细胞1.需要提前一天铺板至8个10cm dish中（细胞接种个数是1*10^6），以保证感染时的密度为30-40%；（Control，NC，#3，#4 PLC和7405各四盘）2.贴壁后弃上清液，配置25ml+40ul （10mg/ml）polybrene混匀（24ml）培养基DMEM (10％FBS不含双抗) , 6个dish加3ml混匀液，然后加入3ml病毒2盘Control组只加3ml混匀液+3ml DMEM（10%FBS不含双抗）10cm dish置于细胞培养箱中再培养48h3.48h后，弃上清，更换各自新鲜培养液8ml，并加入puromycin筛选PLC/PRE/5 0.6ug/ml（4.8ul 1mg/ml puromycin）Bel-7405 0.5ug/ml（4ul 1mg/ml puromycin）4.筛选2-3天之后，观察dish中细胞生长的状况，判断筛选是否成功(比较Control和感染组生存情况)5.若筛选成功，继续加入相应浓度抗生素筛选（注意杀菌）6.WB验证。
首次应用反转录病毒仅感染分裂细胞特性构建hTERT驱动野生型p53基因反转录病毒载体质粒
首次应用反转录病毒仅感染分裂细胞特性构建hTERT驱动野生型p53基因反转录病毒载体质粒余新;洪葵;邓俊晖;刘天德;雷钧;张吉翔;邵江华【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2008(012)003【摘要】目的:选择只感染分裂细胞的鼠源性反转录病毒载体pLHCX作为载体,构建由hTERT启动子驱动目的基因表达的载体,实现靶向性表达.方法:实验于2005-09/2006-05在江西省分子医学重点实验室完成.①实验材料:含319 bp hTERT核心启动子的phTERT-luc质粒由军事科学院郑晓飞博士惠赠,反转录病毒载体质粒pLHCX由浙江大学朱永良教授惠赠,含1.8 kb wtp53基因的质粒pCMV-Neo-BamH-wtp53由第二军医大学朱明华教授惠赠,增强型绿色荧光蛋白报告质粒pEGFP-N2和pEGFP-C1由本室保存,对照反转录病毒质粒pLHCX-CMV-EGFP 前期构建完成;端粒酶阳性人大肠癌细胞SW620、HT-29,人宫颈癌细胞Hela,人肺癌细胞A549和端粒酶阴性人胚肺成纤维细胞MRC-5由本室保存.②实验方法:利用定向克隆的方法分别构建由hTERT启动子驱动EGFP的质粒pLHCX-hTERT-EGFP和驱动wtp53表达的质粒pLHCX-hTERT-wtp53.以质粒pLHCX-hTERT-EGFP和课题组前期构建的质粒pLHCX-CMV-EGFP转染端粒酶阳性的人大肠癌细胞株SW620和HT-29、人宫颈癌细胞株Hela和人肺癌细胞株A549以及端粒酶阴性的正常人肺胚成纤维细胞MRC-5.③实验评估:通过流式细胞仪测定分析转染效率,证实pLHCX-hTERT-EGFP在不同细胞中的表达特异性.运用RT-PCR和Western Blot分别检测p53 mRNA和p53蛋白在p53突变的大肠癌细胞株SW620中表达.利用MTT检测质粒pLHCX-hTERT-wtp53对不同细胞的增殖抑制情况和流式细胞术检测不同细胞的凋亡情况.结果:①通过酶切证实重组质粒pLHCX-hTERT-EGFP和pLHCX-hTERT-wtp53构建成功,并通过将pLHCX-hTERT-EGFP转染SW620细胞观察到绿色荧光蛋白的表达,测序证实构建质粒中包含完整的wtp53片段.②流式细胞术检测结果证实质粒pLHCX-hTERT-EGFP处理后端粒酶阳性的SW620、Hela和A549内增强型绿色荧光蛋白表达强度明显强于端粒酶阴性的MRC-5(P < 0.05),而pLHCX-CMV-EGFP在端粒阳性和阴性的上述细胞中表达无明显差异(P > 0.05).③RT-PCR和Western Blot分别证实了p53mRNA和p53蛋白表达.④MTT检测到重组质粒对端粒酶阳性的大肠癌细胞有明显的增殖抑制作用,而对端粒酶阴性的MRC-5细胞生长无明显影响(P <0.05).⑤流式细胞检测观察到重组质粒引起端粒酶阳性的大肠癌细胞凋亡要明显强于端粒酶阴性的MRC-5细胞(P < 0.05).结论:构建的反转录病毒载体质粒pLHCX-hTERT-EGFP在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性表达;重组反转录病毒载体质粒pLHCX-hTERT-wtp53转染后对端粒酶阳性的大肠癌细胞有特异性的影响作用.【总页数】5页(P493-497)【作者】余新;洪葵;邓俊晖;刘天德;雷钧;张吉翔;邵江华【作者单位】南昌大学第二附属医院江西省分子医学重点实验室,江西省南昌市,330006;南昌大学第二附属医院江西省分子医学重点实验室,江西省南昌市,330006;南昌大学第二附属医院江西省分子医学重点实验室,江西省南昌市,330006;南昌大学第二附属医院江西省分子医学重点实验室,江西省南昌市,330006;南昌大学第二附属医院江西省分子医学重点实验室,江西省南昌市,330006;南昌大学第二附属医院江西省分子医学重点实验室,江西省南昌市,330006;南昌大学第二附属医院普外科,江西省南昌市,330006【正文语种】中文【中图分类】R394.2【相关文献】1.卵巢癌的p53基因治疗实验研究——人野生型p53基因真核细胞表达质粒的构建 [J], 关婷;崔满华;李守柔2.小鼠microRNA-31反转录病毒载体重组质粒的构建及鉴定 [J], 张璐玢;谢梦晓;陈云鹏;徐晓昱;张彩云;冯晖晖;刘霞;周小明;夏圣3.抑制人喉癌细胞生长的p53基因反转录病毒重组体的构建 [J], 陈晓巍;曹克利;刘德培4.反转录病毒介导的野生型p53基因诱发人喉癌细胞凋亡的… [J], 陈晓巍;王直中5.由反转录病毒载体转移的马立克病毒糖蛋白D基因在感染细胞中的表达 [J], 段玉友;崔治中;秦爱建;殷震;杨冠珍;吴祥甫因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
TIEG特异的siRNA慢病毒载体的构建及鉴定
TIEG特异的siRNA慢病毒载体的构建及鉴定叶礼红;舒晓春;邬伟民;鲁红云;孟晓军;孙辽【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2009(19)17【摘要】目的构建TIEG基因siRNA慢病毒载体.方法针对已经筛选确定的TIEG 基因siRNA有效靶序列.合成靶序列的Oligo DNA退火形成双链DNA与经BamH Ⅰ和EcoRl酶切后的PshRNA-copGFP-lendvector慢病毒载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生psiRNA-TIEG慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆.测序鉴定,用psiRNA-TIEG和病毒包装系统共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度;用包装病毒颗粒注射大鼠,通过RealTime-PCK检测大鼠肾组织TIEG mRNA的表达水平.结果 PCR和测序证实,成功构建TIEG siRNA慢病毒栽体psiRNA-TIEG,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1×10<'5>ifu/μL;实验组大鼠TIEGmRNA的表达水平明显低于对照组(50.7%).结论成功构建大鼠TIEG基因siRNA慢病毒栽体psiRNA-TIEG.【总页数】5页(P2568-2572)【作者】叶礼红;舒晓春;邬伟民;鲁红云;孟晓军;孙辽【作者单位】中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000;中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000;中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000;中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000;中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000;中山大学附属第五医院内分泌科,广东,珠海,519000【正文语种】中文【中图分类】Q782【相关文献】1.表达HBsAg特异性siRNA的重组腺相关病毒载体的构建 [J], 胡斌;杨燕;刘嘉;马智勇;黄红平;余源;刘慎沛;杨东亮2.C-erbB-2特异性siRNA逆转录病毒载体的构建与鉴定 [J], 陈敏;冯定庆;祝怀平;凌斌;周颖;朱园园;高婷;程志祥;沈国栋;赵卫东3.SMO特异性siRNA慢病毒载体的筛选构建 [J], 杨波;陈卫华;温机灵;华咏;王跃闽4.ABCE1特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定 [J], 任翼;刘永煜;郭微;田大力5.大鼠NgR特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定 [J], 林如英;王玮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
轮状病毒NSP5真核表达载体的构建、鉴定及功能研究
轮状病毒NSP5真核表达载体的构建、鉴定及功能研究陈林林; 周艳; 林晓晨; 杜静; 刘洋; 汪艺; 李鸿钧【期刊名称】《《生物学杂志》》【年(卷),期】2019(036)006【总页数】5页(P12-16)【关键词】轮状病毒; NSP5; 真核表达载体; 病毒复制【作者】陈林林; 周艳; 林晓晨; 杜静; 刘洋; 汪艺; 李鸿钧【作者单位】中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118【正文语种】中文【中图分类】Q78; R373.2轮状病毒(Rotavirus，RV)是导致婴幼儿急性腹泻的重要病原体之一，于1973年在严重腹泻的婴幼儿十二指肠切片及粪便样本中首次被发现，且因其形似车轮，故被命名为轮状病毒[1-3]。
RV的流行和感染多发生在气温较低的秋冬季节，主要通过粪口途径传播。
感染后常导致婴幼儿患者产生腹泻、呕吐、发烧等症状，并伴随严重脱水、体内电解质代谢紊乱等并发症，在全球范围尤其是在南亚、中非等广大发展中国家和地区，严重威胁着当地婴幼儿的健康[4-5]。
RV属呼肠孤病毒科(Reoviridae)、轮状病毒属。
RV无包膜结构，其基因组由11段不连续的双链RNA组成，分别编码着6种结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7)和6种非结构蛋白(NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5、NSP6)，在RV宿主特异性、基因组的复制和翻译、宿主胞质内病毒池(viroplasms)的形成及病毒增殖和释放等环节中发挥重要作用[6-8]。
此外，依据结构蛋白VP6的抗原特异性，可将RV分成8组，且因结构蛋白VP4和VP7的差异，RV又被细分成37个P型与27个G型[9-13]。
非结构蛋白NSP5为重要的胞质磷蛋白，具有高度保守的氨基酸序列[14-15]。
在RV感染细胞后，NSP5在胞质内表达并参与形成病毒池结构，调控RV的复制和包装，但具体机制还不完全清楚[16]。
CRISPR操作-载体构建和细胞建系教程
CRISPR操作-载体构建和细胞建系教程汉恒生物提供CRISPR相关病毒包装服务设计完sgRNA之后，就可以选择性克隆到此目的载体了。
在这里我们选择lentiCRISPR v2载体作为例子说明。
lentiCRISPR v2是张锋实验室发布一个慢病毒载体系统，cas9和sgRNA表达框在同一载体上。
而且Cas9的C 端带有FLAG融合标签，载体包含Puromycin抗性基因，适合建稳转系（图21）。
验证sgRNA活性的时候也适合顺转；包装成慢病毒适合常规细胞系的建系。
构建非常方便。
该载体具体特征如下：图21克隆gDNA使用BsmBI位点，载体可以切出一个~1.9 kb的filler片段，便于确认酶切成功并利于载体回收（图22）；图22虚拟酶切示意图。
Lane1是BsmBI酶切的虚拟结果；lane3是对照。
☐BsmBI的位点是CGTCTC(1/5)^，别序列和切割序列分离，酶切之后不需要CIP脱磷也不会自连！☐Cas9的COOH 端带有FLAG tag,可以WB或者Immunostaining；☐EFS promoter被优化的小而强，极大提高了慢病毒包装的效率；☐载体带有Puromycin抗性，可以富集转染/感染成功的细胞。
具体克隆步骤如下：1.克隆到lentiCRISPR v2载体的sgRNA格式如下（图23）：图23 lentiCRISPR v2载体兼容的sgRNA格式。
举个实例说明（图24）：我们锁定NGG之后，只需跟前上游20 bp的序列设计如图所示的oligo即可。
图24 lentiCRISPR v2载体兼容的sgRNA格式实例。
最上面是对应的基因组双链，我们确定NGG之后只需要在前面找到20bp序列即可。
2.然后合成如下两条引物（oligo）即可(注意方向)：Oligo1: CACCG/CAGTCTGATCAGTTTTCCTTOligo2: AAACAAGGAAAACTGATCAGACTGC CGTCAGACTAGTCAAAAGGAACAAA3.然后按照如下步骤退火（图25）。
USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定
USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定目的构建并鉴定USP22基因ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用机制奠定基础。
方法针对USP22基因的编码序列设计并合成2条特异性干扰序列，序列两端含有限制性内切酶位点HpaⅠ和XhoⅠ。
寡核苷酸链退火生成寡核苷酸双链，5′端磷酸化后将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到pLL3.7慢病毒表达载体。
连接产物经转化、培养，提取其质粒，提取出来的质粒经HpaⅠ和XhoⅠ酶切电泳鉴定，鉴定正确的质粒进行测序。
构建成功的慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA與包装载体质粒混匀共转染于293T细胞。
通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）情况，对病毒滴度和感染效率进行检测。
结果成功构建慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA。
与包装载体质粒共转染293T细胞后测定慢病毒滴度为4×107 TU/ml。
结论本实验应用相关技术成功构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。
标签：USP22；慢病毒载体；构建；鉴定肿瘤细胞中基因表达具有组织特异性，USP22泛素水解酶属去泛素化酶DUB基因家族成员，其普遍表达表明其功能的保守性，因此，USP22被归类为肿瘤干细胞的标记基因而引起高度关注[1]。
国内外学者研究发现，USP22基因过表达与结直肠癌[2]、肺癌[3]、胃癌[4]、食管癌[5]、乳腺癌[6]等恶性肿瘤的浸润、转移和预后差高度相关。
沉默USP22基因表达，能显著抑制膀胱癌[7]、结直肠癌[8]细胞增殖，由此推测USP22基因可能成为肿瘤治疗的一个新靶点。
本研究通过基因工程技术构建USP22 ShRNA慢病毒载体，为进一步研究USP22基因在人鼻咽癌细胞中的作用机制提供实验基础。
1 材料与方法1.1 实验材料、试剂及仪器pLL3.7慢病毒表达载体及包装载体质粒购自广州永诺生物科技有限公司。
小鼠survivin基因慢病毒表达载体的构建及鉴定
小鼠survivin基因慢病毒表达载体的构建及鉴定杨平;苟欣;周青松;何卫阳;余昆【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2011(015)049【摘要】BACKGROUND: The limited viability of mesenohymal slim cells restricts its application in treatments vivo. Therefore.it is veryimportant to find in experiment method to prolong the viability of mesenchymjlstem cells so as to lay foundation for experimentvivo.OBJECT WE: To construct the lentiral vector encoding survin gene of mice with clone vectorpLV.Des3d.P/hygro.METHODS: Oligo nucleic acid software was used to design a couple of primers according to survivin gene sequence of micewhich is publicated on Genbark The attB recombination site was added to the two ends of the couple of primers, and mSurvinandIRES/EmGFP were amplified by PCR. The PCR product liter BP reaction ?as transferred to Stb13. And the correctpDomn-mSurvivin ind pTail-IRES/EmGFP were selected and sequenced. The mixture of pD own-mSuvition. pTail RESSWSFPand pLV.Des3d.Pmygro was used to do LR reaction. The lentiviral vector pLV.EX3d.P/hygro-EF1A>mSurvvin＞IRESEmGFP Wasamplified and sequenoed again.RESULTS AND CONCLUSION: The results of PCR ind sequencing showed that the lenfei.al vector encoding survivin gene ofmice mis constructed successfulty, which lays foundation tor the further study of survr?in anti-apoptosis inmesenchymalstemcells.%背景:间充质干细胞体内有限的存活能力严重制约其用于体内治疗方面的应用,因此寻找一种能延长存活能力的实验方法是间充质干细胞进行体内实验的重要前提.目的:应用pLV.Des3d.P/hygro构建小鼠survivin基因的慢病毒表达载体.方法:采用Oligo核酸软件对Genbank上所发表的小鼠survivin mRNA序列进行分析,设计一对survivin基因上下游引物,利用Gateway 克隆方法,分别在其两端添加attB重组位点,运用PCR扩增mSurvivin和IRES/EmGFP,将PCR产物进行BP反应然后转化到Stbl3感受态菌,通过卡那霉素抗性筛选、PCR鉴定,选取鉴定正确的pDown-mSurvivin和pTail-IRES/EmGFP 克隆测序.将pDown-mSurvivin和pTail-IRES/EmGFP与pLV.Des3d.P/hygro 混合进行LR反应,构建慢病毒载体pLV.EX3d.P/hygro-EF1A>mSurvivin>IRES/EmGFP,再次进行PCR、测序的鉴定.结果与结论:显示基因序列克隆正确,成功构建了含有小鼠survivin基因的重组慢病毒表达载体.说明慢病毒表达载体pLV.EX3d.P/hygro-EF1A>mSurvivin>IRES/EmGFP构建成功,为下一步研究survivin在间充质干细胞中抗凋亡作用奠定基础.【总页数】5页(P9244-9248)【作者】杨平;苟欣;周青松;何卫阳;余昆【作者单位】重庆医科大学附属第一医院泌尿外科,重庆市,400016;重庆医科大学附属第一医院泌尿外科,重庆市,400016;重庆医科大学附属第一医院泌尿外科,重庆市,400016;重庆医科大学附属第一医院泌尿外科,重庆市,400016;重庆医科大学附属第一医院泌尿外科,重庆市,400016【正文语种】中文【中图分类】R394.2【相关文献】1.小鼠Stra8基因慢病毒表达载体的构建与鉴定 [J], 郑哲;郑英2.Gateway技术构建小鼠血管生成素-1慢病毒表达载体及其病毒包装 [J], 李秋平;马新娜;张小英;许靖;章晟;王春枝;封志纯3.小鼠Smad4基因慢病毒表达载体构建及在293T细胞中的表达 [J], 孙毓晗;侯昭晖;肖玉丽4.小鼠S1PR3慢病毒表达载体的构建及表达 [J], 王航;蔡克银;黄浩5.小鼠survivin基因重组真核表达载体的构建及鉴定 [J], 余昆;苟欣;杨华安;周青松;夏阳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
靶向SynDIG1的shRNA慢病毒载体的构建及功能鉴定
动物医学进展,2021 ,2(1)69-74ProgressinVeterinary Medicine靶向SynDIG1的shRNA 慢病毒载体的构建及功能鉴定李亚琳，史秀超，权美平(渭南师范学院环境与生命科学学院,陕西渭南714099)摘 要：为了构建靶向突触分化诱导基因1(SynDIG1 )的shRNA 慢病毒表达载体，设计出SynDIG1的 siRNA 的靶点序列,并合成含干扰序列的双链DNA 发卡结构shRNA,合成的Oligo 经过退火分别与双酶切处理后的pLKO. 1-GFP 载体连接。
将构建的重组质粒pLKO. 1-GFP-SynDIG1 shRNA 转化到DH5a 感受态细菌中，过夜培养后挑选阳性克隆子，扩增后提取DNA 进行质粒测序，得到两个序列正确的重组质粒。
用这些重组质粒转染HEK293T 细胞以及大鼠海马神经元细胞，蛋白免疫印迹及细胞免疫荧光检测SynDIG1 shRNA 对外 源性和内源性SynDIG1表达的敲减作用。
进一步用重组质粒转染HEK293T 细胞产生慢病毒颗粒，用病毒颗粒 感染DIV2和DIV14的神经细胞,免疫印迹检测SynDIG1的表达。
结果表明这两个重组质粒均能够有效地抑制外源性和内源性SynDIG1的表达，对HEK293T 中瞬时表达的SynDIG1敲减率达到75%，其慢病毒颗粒感染对早期神经细胞中内源性SynDIG1的表达抑制也很明显。
用pLKO. 1-GFP 成功构建了能够有效抑制外源性 和内源性SynDIG1表达的重组质粒，为探讨RNA 干扰技术抑制神经细胞SynDIG1基因表达的相关研究奠定基础，为研究SynDIG1基因在神经传导和突触发育及其可塑性调节中的作用提供了有力工具。
关键词：SynDIG1 ；慢病毒；shRNA ；基因敲减技术中图分类号:S852. 615；Q789突触分化诱导基因(synapse differentiation in duced gene1,SynDIG1)是一种高度保守的跨膜蛋 白，在中枢神经系统的兴奋性突触传递和突触可塑性调节中起着重要的作用［1］。
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逆转录病毒载体pOZ—KLF5的构建及鉴定摘要：为研究KLF5的相互作用蛋白从而深入探索其生物功能，构建了C端带有FLAG、HA、6xHis三标签的pOZ-KLF5真核表达逆转录病毒栽体。
pOZ-KLF5栽体可通过一次转录得到双顺反子转录单位，即一个转录物能表达两种独立存在的蛋白质：三标签融合蛋白KLF5-3xTag和筛选标记——白细胞介素-2受体a （IL-2Ra）。
通过偶联IL-2Ra抗体的磁珠成功筛选出KLF5-3xTag表达阳性的293T细胞，经Western-blot检测细胞内KLF5-3xTag表达情况及其对293T细胞增殖及周期的影响，发现KLF5-3xTag能够促进细胞克隆的形成并使S期细胞增多，且可被已知E3泛素连接酶WWP1降解，与已有报道一致。
进一步通过免疫沉淀实验证明了与KLF5融合的标签的免疫反应性。
该质粒的成功构建为研究KLF5相互作用蛋白及深入探索其生物功能奠定了基础。
关键词：KLF5；双顺反子转录；真核表达；三标签融合蛋白中图分类号：Q812 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）02-0124-07Construction and Characterizations of pOZ-KLF5 Retroviral PlasmidZHAO Xin-yu，WANG Wei-xi，LU Ze-lan，HUANG Lei，ZHAO Ke-wen*（Department of Pathophysiology，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200025，China）Abstract：To analyze KLF5 interacting proteins and explore the biological functions of KLF5，the eukaryotic expression retroviral plasmid pOZ-KLF5，with the FLAG，HA，6xHis triple tags at C-terminal，was con?structed. Plasmid pOZ-KLF5 can get a bicistronic transcription unit after once transcription and express two independent proteins：triple-tagged fusion protein KLF5-3xTag and selection marker interleukin-2 receptor a （IL-2Ra）. 293T cells expressing KLF5-3xTag were successfully selected by the magnetic beads coupling IL-2Ra antibody，and the expression of KLF5-3xTag was detected by Western-blot. Then，the proliferation and cell cycle of 293T were tested，and the results indicated that KLF5-3xTag promotes the proliferation of cell colonies and the Gl/S transition.In addition，co-expression of WWP1，a known E3 ligase of KLF5，can decrease KLF5-3xTag protein level，which is consistent with previous reports. Furthermore，immunoprecipi- tation experiment was applied to prove the immunoreaction of the tags. The successful construction of pOZ- KLF5 provides a powerful tool to study the interacting proteins of KLF5 and to explore the biological func?tions of KLF5.Key words：KLF5；bicistronic transcription；eukaryotic expression；triple-tagged fusion protein（Life Science Research，2015，19（2）：124?130）KLF5蛋白是类KtlippeKKriippel-likefactors，KLF）转录因子家族的一员，属于基础转录因子。
到冃前为止该家族巳经有17个成员被鉴定出来。
KLF5又名BETB2（basictranscriptionelement-bindingprotein2）和IKLF （intestine-enrichedKriippel-likefactor），在胚胎发育、细胞周期、细胞生长与分化、维持细胞干性等生物过程中发挥作用。
研究发现KLF5在人和小鼠的小肠、结肠、胃、胰腺、胎盘、睾丸、骨骼肌、肺、膀胱和子宫等组织中广泛表达[1-3]。
KLF5能与多个基因的GCbox区域结合从而调控其转录。
KLF5蛋白C端含有KLFs家族特征性的、可以结合基因组DNA的3个串联重复的锌指（zincfinger，ZF）结构域，在ZF结构域前含有富含脯氨酸的转录激活结构域。
值得关注的是，KLF5在不同的细胞类型中发挥的作用不同，已有的研究提示这可能与KLF5的翻译后修饰有关。
KLF5蛋白有不同的翻译后修饰，包括磷酸化、乙酰化、泛素化和SUMO化修饰，经过翻译后修饰的KLF5可以与不同的蛋白相互作用从而发挥不同甚至完全相反的功能[4.5]。
为了研究KLF5在真核生物不同生理及病理条件下的相互作用蛋A从而深入研究其生物学功能，我们构建了逆转录病毒真核表达载体P0Z-KLF5，通过磁珠筛选出阳性克隆，在检测KLF5生物功能的同时，验证了与目的蛋白KLF5融合的标签的免疫反应性。
1材料与方法1.1材料大肠杆菌DH5a感受态（Invitrogen，美国），pOZ-C载体[6]（简称pOZ，C端带有FLAG和HA标签，Addgene，美国），质粒提取试剂盒（QIAGEN，美国），凝胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒（Tian-gen，中国），XhoⅠ、NotI核酸内切酶、T4DNA连接酶（Takara，日本），LB培养基（Oxoid，英国），X-tremeGENE9转染试剂（Roche，美国），MG132（Sig-ma，美国），抗FLAG-M2亲和凝胶、抗HA亲和凝胶（Sigma，美国），抗IL-2Ra抗体（Upstate，美国），Ni-NTA琼脂糖（QIAGEN，美国），DynabeadsM450（Invitrogen，美国），抗KLF5抗体（Protein-Tecli，美国）c1.2pOZ-KLF5表达载体的构建根据逆转录病毒载体pOZ 的多克隆位点，设计带有XhoI和NotI酶切位点（见斜体）的KLF5扩增引物，在C端PCR引物中引人了6xHis标签（见下划线）。
引物序列Forward：5’（-GGGCrCGAGTGCCACCATGGCTACAAGGG-TGCTGAGC-3’，Reverse5’-CCCGCGGCGGCQI-GGTGGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGCCTCTTCA-TATG -3’。
以人KLF5的CDNA为模板，PCR扩增C末端带有6xHis标签的KLF5基因’命名为ALF5-6xHis。
PCR条件如下：94℃变性3min，94°C 30s，55℃30s，72℃1min，30个循环，72℃；延伸10min，4℃保存。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，然后分别用XhoI和I酶切PCR 产物和P0Z-C载体，用胶回收试剂盒回收酶切后的AXF5片段与载体，用T4DNA 连接酶将KLF5-6xHis与pOZ载体连接，转化感受态DH5a，挑选阳性克隆于3mL 的LB培养基小量扩增，并用质粒提取试剂盒提取所构建的质粒。
经XhoI和Not Ⅰ酶切确定目的片段的插入，测序证实插入载体目的片段的正确性，质粒被命名为P0Z-KLF5。
1.3稳定表达pOZ-KLF5质粒的细胞系筛选采用Roc.he公司的X-tremeGENE9试剂将逆转录病毒载体P0Z-KLF5连同病毒包装辅助质粒gag-Pol、VSV-g—起转染包装细胞，48h后收集具有感染能力的逆转录病毒感染293T细胞，由于P0Z-KLF5质粒可以同时转录并表达两种蛋白质：目的蛋白KLF5和筛选标记白细胞介素-2受体a（IL-2Ra），因此可以通过偶联IL-2Ra抗体的DynabeadsM450磁珠筛选pOZ-KI，F5病毒感染的293T细胞，从而得到稳定表达三标签融合的目的蛋白KLF5（简称KLF5-3xTag）的293T细胞系。
1.4pOZ-KLF5质粒在真核细胞表达的鉴定收集1.3中获得的稳定表达KLF5-3xTag的293T细胞的总蛋白，WestemBlot方法检测目的蛋白KLF5-3xTag的表达情况。
1.5细胞水平检测KLF5的生物学功能使用1.3中获得的稳定表达KLF5-3xTag的293T细胞进行克隆形成实验和细胞周期分析实验，检测KLF5-3xTag蛋白的表达对细胞增殖及细胞周期的影响。
克隆形成实验分别将100个 1.3筛选的对照组和KLF5-3xTag表达组293T细胞接种到六孔板中培养10d，吸去上清液，用PBS 洗两遍，冰甲醇固定细胞后结晶紫染色，晾干后拍照，并对直径超过100μm的克隆进行统计分析。
使用同样的对照组与KLF5-3xTag表达组293T细胞检测细胞周期：分别离心收集lxlO6个细胞，用PBS洗两遍后，加入预冷70%乙醇于-20°C 固定过夜，第二天用PBS洗两遍，加入PI染料和RNaseA于37℃避光孵育30min，最后用流式细胞仪检测周期。
1.6Western-blot检测WWP1对KLF5-3xTag蛋白的降解在1.3中获得的稳定表达KLF5-3xTag的293T细胞内共转染WWP1质粒（美国Emory大学DrnigJT教授惠赠）或者对照载体，收集细胞前4h加入20μmol/LMG132处理，收集细胞总蛋白Westem-blot检测细胞中KLF5蛋白的含量变化，β-actin作为内参。