逆转录病毒载体介导DNA转染
AP转染实验步骤
AP转染实验步骤转染是指将外源基因导入细胞内的一种生物学技术。
转染可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。
物理介导方法有电穿孔法、显微注射和基因枪法,化学介导方法很多,如磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导技术,生物介导方法,有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
病毒载体是以病毒为基础进行改造而获得的载体,已经成为目前最常用的转染方式之一。
通过对病毒基因组进行改造,能够使其携带外源的目的基因。
将其包装成病毒颗粒后,通过侵染宿主细胞,能够将外源目的基因一并带入宿主细胞中。
与传统方法相比,病毒转染在真核细胞中的效率更高,尤其是在传统方法难以发挥作用的哺乳动物实验中,病毒转染法发挥着重要的作用。
病毒转染系统的分类:目前常用的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体。
慢病毒载体:慢病毒载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。
和普通逆转录病毒载体不同的是,它对分裂细胞和非分裂细胞均都具有感染能力。
慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。
腺病毒载体:腺病毒载体是以腺病毒发展出的一类载体。
和慢病毒载体不同的是,腺病毒载体不会将外源目的基因或自身的病毒基因整合到宿主细胞的基因组中,而是游离在宿主基因组外独立的表达。
基于这一特性,腺病毒载体能够实现外源基因的瞬时表达,同样也由于不对宿主基因组进行整合而避免了潜在的基因突变,具有更好的可控性。
逆转录病毒表达载体:逆转录病毒是一种单链RNA病毒,它是能够在逆转录酶的作用下将RNA转变成cDNA,再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。
根据逆转录病毒的一些特性设计出的一种复制缺陷性病毒,使其成为能够携带某种特异目的基因的表达载体,即逆转录病毒载体。
病毒转染细胞的方法(以慢病毒为例):慢病毒转染贴壁细胞实验方法1、慢病毒转染前18-24小时,将贴壁细胞以1×105/孔铺到24孔板中。
质粒转化、细胞转染步骤
转化：将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性。
转染（transfection）:将含有目的gene的载体转到真核cell内
转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程。
有时也指在真核cell之间通过逆转录病毒转移和获得cellDNA的过程。
1.质粒转染（transfection）
6-well-plate 每well 60-70%时transfection
接种时×105个/ml/well
质粒DNA 转染液优化培养基opti-MEM
步骤：质粒DNA + 200ul opti-MEM + 6ul转染液混匀室温静置15min 待转染cell换优化培养基，切记要轻轻加培养基，勿冲起cell 把transfection complex(200ul)轻轻均匀滴入cell培养基中，十字形摇晃plate,混匀
37℃，CO2培养箱培养
2.
转化：外源DNA(质粒作为载体)导入受体细胞（大肠杆菌感受态cell）步骤：
50ul感受态cell（一管）加入12ul质粒DNA→轻柔混合
↓
冰浴30min
↓
42℃热激90s
↓
迅速冰浴2min
↓
向管中加入培养基，混匀后37℃震荡培养（﹤225rpm）1h,使细菌恢复正常生长状态
↓
涂板正培1h后，倒培过夜。
转基因和基因敲除技术介绍
文献：
Construction of pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and their Applications in Poly(hydroxyalkanoate) Production
1． 利用基因同源重组进行基因敲除
应用最为广泛 其具体的原理和应用将在后 ——基因捕获法
利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因 载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携 带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获 得相应的基因敲除细胞。
普遍性转导 局限性转导
噬菌体可以转导给体染色体的任何部分到 受体细胞中的转导过程
在转导过程中,如所转导的只限于供体菌 染色体上特定的基因,则称为局限性或特 异性转导.
转染：通过感染方式将外来DNA引入宿主 细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过 程称为转染(transfection)。转染是转化的一 种特殊形式。
在聚乙二醇存在下，使两个细胞原生质融合， 融合后的细胞形成二倍体细胞，具有两套 染色体，表现两者的特征。常用作生物工 程的研究
补充资料
“基因敲除小鼠”： 他们利用“基因敲除”的方法创造了一套完整的“基因敲除小鼠”的
方式，把任意改变小鼠基因变为现实，不仅可以研究单个基因在动物 体内的功能，而且为人类攻克某些遗传因素引发的疾病，提供了药物 试验的动物模型。 所谓“基因敲除小鼠”，就是先在小鼠的胚胎干细胞上通过基因重 组的办法进行基因修饰──就是将胚胎干细胞中的靶向基因改掉，然 后将“修饰”后的胚胎干细胞植入小鼠的早期胚胎，生成嵌合体小鼠。 这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被“修饰”过的基因和未被 “修饰”的基因。如果某些小鼠的生殖细胞恰巧被“修饰”过了，则 它们就会生出基因完全被“修饰”过的小鼠
转化和转染
转染和转化的区别转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。
其中，核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA），反义寡核苷酸及RNAi（RNA interference）。
基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控，基因功能，信号转导和药物筛选研究）和基因治疗研究。
基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。
早期的磷酸钙转染法转染效率很低，且对很多细胞株无效，因此不能满足很多科研工作的需要。
目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们在克服细胞屏障方面跟病毒有很相象的特征，容易透过细胞膜。
其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。
由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。
转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。
噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。
通过感染方式将外来DNA 引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。
转染是转化的一种特殊形式。
基因工程:有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。
载体:能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。
生物制药
生物技术制药1.大分子和小分子药物的区别大分子：多肽蛋白，来源于生物体，不容易提纯；小分子：为化学小分子，来源于化学合成，容易提纯。
2.有哪些方法合成第二链cDNA。
1）selfpriming；2）Replacementsynthesis。
3.有哪些引物用来合成cDNA第一链1）oligodT(n=12~18)，它引导的cDNA合成必须从3’开始；2）随机引物（n=6），随机合成6~10寡核苷酸片段作为引物；3）基因特异性引物（n=18~25），当RNA序列或部分序列已知时。
4.与RT—PCR相比，建立的cDNA文库有什么好处。
1）cDNA文库是以mRNA为材料，排除了真核基因组内含子的干扰，而且对于一些RNA 病毒来说，cDNA文库是研究它们的唯一可行的方法；2）cDNA基因文库的筛选简单易行；3）由于每一个cDNA克隆都代表一种mRNA序列，这样在选择中出现假阳性的几率比较低；4）cDNA是双链可以克隆到载体上，能无限扩增，可以随时满足需要，RT—PCR的产物第一链cDNA为单链，不能扩增，一旦用完就没有了。
5.在哺乳动物细胞中表达常用的启动子。
SV40、CMV、MLP6.逆转录病毒载体的主要结构。
1）2个LTR（长末端重复序列）（其插入宿主基因组作用，5’还有启动子作用）；2）φ（装配信号，指导结构蛋白表达）；3）MCS（多克隆位点）；4）backbone（大肠杆菌中增殖必备部分）。
7.哺乳动物细胞表达载体的主要表达元件。
启动子、载体的转录终止信号和高效多聚腺苷酸（ploy(A)）加尾信号、选择标记基因。
8.什么是转染？在完成基因克隆之后，大多数的研究人员希望重新把这个基因的自然体和突变体导入到各种细胞来分析它的功能特点，这个过程称之为转染。
9.有哪些转染哺乳动物细胞的方法？（一)非病毒介导转染法：1）钙转染法（沉淀）；2）脂质体转染法（形成双层质膜包埋DNA）；3）DEAE—葡聚糖转染技术促进哺乳动物细胞捕获外源DNA）；4）电转染（在高压电脉冲作用下使细胞膜上出现微小孔洞，促使细胞吸收）；5）压缩DNA转染法（将DNA压缩成为小颗粒）；6）利用细胞周期转染法（利用G2/M周期细胞分裂时细胞膜的空隙增大）；7）显微注射法（直接将目的基因通过注射器注入受体细胞中）；8）提高转染率（提高细胞内的激酶的pH）；（二）病毒介导转染法：逆转录病毒介导法，病毒介导法（通过感染宿主细胞将外源基因整合到染色体中）。
各种转染方法比较
各种转染方法比较不同的实验室转染方法选择会依赖于多个相关因素，如目标细胞类型、转染效率、细胞毒性、需求的表达时间、实验的规模和预算等。
以下是一些常见的转染方法的比较：1. 离子交换法（Calcium phosphate transfection）离子交换法是最早开发和使用的转染方法之一、它使用磷酸钙和DNA或RNA的复合物在细胞表面形成凝析沉淀物。
该方法简单、经济且较为普遍，适用于许多细胞类型。
然而，它的转染效率较低，存在较多的细胞毒性。
2. 迷走转染法（Lipofection）迷走转染法是当前最常用的转染技术之一，通过磷脂体（例如Lipofectamine）与质粒DNA形成复合物。
该方法转染效率高，而且适用于许多类型的细胞，包括哺乳动物和非哺乳动物。
然而，迷走转染法存在一些限制，如细胞毒性、稳定性较差，和细胞特异性。
3. 电穿孔法（Electroporation）电穿孔法是通过应用电场使细胞膜暂时性孔化来实现转染效果。
它可以用于转染各种类型的细胞，包括哺乳动物、鸟类和植物。
电穿孔法的转染效率高，但存在一定的细胞毒性和细胞损伤风险。
此外，电穿孔设备的成本较高，需要专门训练的技术人员来操作。
4. 病毒载体转染法（Viral vector transfection）病毒载体转染法使用经修饰的病毒作为转染载体，可实现高效的基因传递和表达。
常用的病毒载体包括腺病毒、衣壳病毒和逆转录病毒。
这些病毒对于不同类型的细胞具有不同的亲和力和转染效率。
然而，病毒载体转染法的主要限制是细胞对病毒的感染能力，以及在临床应用中可能引发的安全性问题。
5. 直接注射法（Direct microinjection）直接注射法是一种机械刺伤细胞膜直接将DNA注入细胞的方法。
这种方法对于特定的细胞类型具有高效转染的能力，如哺乳动物受精卵和干细胞。
它可以实现精确控制和单细胞水平的转染，但需要昂贵的设备和专业技能。
总结起来，转染方法的选择应根据实验的具体需求来进行。
逆转录病毒介导系统感染原代培养人皮肤成纤维细胞
逆转录病毒介导系统感染原代培养人皮肤成纤维细胞张清华艾民1蒋知新沙杭高毅2卢海2（中国人民解放军三零五医院，北京100017）〔摘要〕目的利用包装生产逆转录病毒感染原代培养人皮肤成纤维细胞，为细胞重编程提供技术保证。
方法利用组织块贴壁法体外原代培养人皮肤成纤维细胞。
包装生产携带绿色荧光蛋白GFP 基因的逆转录病毒上清液。
收集逆转录病毒上清液感染原代培养人皮肤成纤维细胞，利用荧光显微镜观察逆转录病毒感染成纤维细胞。
结果体外成功原代培养出人皮肤成纤维细胞。
293T 细胞包装生产携带GFP 基因的逆转录病毒上清液。
包装生产后逆转录病毒成功地感染原代培养人皮肤成纤维细胞。
结论逆转录病毒介导系统是人皮肤成纤维细胞重编程的有效基因转移载体。
〔关键词〕逆转录病毒；人皮肤成纤维细胞；细胞重编程；诱导多潜能干细胞〔中图分类号〕R34〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）11-2297-02；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.11.039基金项目：全军医药卫生科研基金项目（No.08Z017）；科学技术部867计划项目（No.2006AA02A141）1南方医科大学研究生院2南方医科大学再生医学研究所通讯作者：蒋知新（1963-），男，副主任医师，硕士，硕士生导师，主要从事心血管病研究。
第一作者：张清华（1950-），男，主任医师，教授，博士生导师，主要从事冠心病干细胞治疗研究。
胚胎干细胞（ESCs ）是具有无限增殖，自我更新和多向分化潜能的一种未分化细胞，在体外可被诱导分化为神经细胞〔1〕、平滑肌细胞、心肌细胞〔2〕、造血细胞〔3〕而用于多种疾病的治疗，具有广阔的研究和临床应用前景。
目前，ESCs 研究也存在着一些问题，如免疫排斥反应和伦理学问题的争论。
诱导多潜能干细胞技术是将多能性基因转染到已分化的体细胞，将其重编程为类似于ESCs 的多潜能干细胞，并被命名为“诱导多潜能干细胞”（iPSCs ），简称“iPS 细胞”〔4〕。
基因治疗(gene therapy)
近年来，更多采用体内方案。重组 逆转录病毒直接注射的途径主要有： 1）采用静脉注射等途径，将重组病 毒直接注射到机体内，通过重组病毒 的感染作用实现基因转移；2）直接 将产生重组逆转录病毒载体的包装细 胞注射到组织或肿瘤中，由包装细胞 释放再感染靶细胞；
3）直接将表达载体，可以是非 病毒性表达质粒，注射到人体内， 如将HIV-1病毒载体注射到肌肉 内，使其表达相应的env基因蛋 白，引起相应的细胞免疫。
定义 把基因转移到患者体内，使其发
挥作用，以达到治疗疾病目的的技 术称为基因治疗(Gene Therapy)。
基因治疗自Anderson于1990年进行 了第一例应用腺苷脱氨酶基因（ADA）， 经反转录病毒导入人体自身T淋巴细胞， 经扩增后输回患儿体内，获得了成功。 患儿5年后体内10%造血细胞ADA基因呈阳 性，除了还需应用部分剂量的ADA蛋白外， 其他体征正常。这一成功标记着基因治 疗的时代已经开始。
3.腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）:AAV属于微小病毒家族成 员，是一类小的单链DNA病毒（基因组 约4.7kb），非常稳定。本身无致病性， 需辅助病毒（常为AV）存在时才能复 制。AAV可感染人的细胞，并能整合至 非分裂相细胞。
大部分AAV基因组可去除，从而可 使外源基因得以大量补足。AAV可以 整合进入宿主细胞基因组，但不如 RV的整合效率高。有趣的是，在感 染细胞中，野生型AAV基因组可高效 定点整合于人类第19号染色体长臂 的特定位置上，这种整合可导致染 色体基因重排，
5.调控性基因治疗 通过导入编码调控蛋白的
基因以治疗基因表达异常的疾 病。如：以野生型P53基因治疗 肺癌或急性白血病。
6.应用“自杀基因”的基因治疗 也称活化前体药物性基因治疗。
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逆转录病毒载体介导DNA转染
关键词：逆转录病毒载体DNA转染2012-10-09 00:00 来源：丁香园点击次数：164
逆转录病毒载体属RNA病毒，但可在受染细胞内反转录产生DNA互补链，此DNA单链可作为模板合成第二条DNA链，第二条DNA链可掺入细胞基因组DNA中。
此病毒可利用宿主细胞的酶自行转录与复制，RNA可合成蛋白，再包装病毒，RNA从胞内释放，成为感染性病毒，该载体可经不同方式改变。
介导过程可使病毒单拷贝基因组稳定地进入细胞。
首先，逆转录病毒的繁殖必须要有适当的包装细胞系，以利于产生高滴度的病毒，同时还具有适当的结构。
如：ψ2(第一代包装细胞)，PA317(第二代包装细胞)，ψ1-CRIP、PG13、DA、CFA(第三代包装细胞)，包装细胞可提供逆转录病毒gag、pol和env蛋白才能使带有包装信号及目的基因的病毒载体RNA进行包装，包装细胞只提供gag、pol和env蛋白而不产生具有复制能力的野生型病毒(RCR)，而第一代包装细胞可产生RCR，安全性较差；第二代包装细胞，临床上已广泛应用，也未发现产生RCR，安全性好；第三代包装细胞更加安全，第三代包装细胞中主要区别是病毒结构基因中env不同。
反转录病毒作为基因转移的载体有如下特点：①反转录病毒感染细胞的效率高，基因转移率在10%-100%；
②病毒基因转移能将外源基因整合到宿主细胞基因组中外源基因能稳定存在而不丢失；③外源基因整合的拷贝数一般只有一个；④反转录病毒只选择感染分裂细胞；⑤病毒可容纳外源基因的DNA长度为<8Kb。
反转录病毒载体的结构：已切除了病毒的结构基因gag，大部分pol和env，包括两侧的LTR，被选择(标记)基因和目的基因插入的多聚位点所取代，同时还带有包装信号ψ。
(一)可产生特异性逆转录病毒细胞系的建立
1、逆转录病毒载体进入包装细胞系
从细胞质粒中产生感染性病毒包括将质粒导入包装细胞系，可从稳定感染细胞中选择病毒产生细胞或用一个包装细胞系暂时产生的病毒感染另一种有不同包装的细胞系，从中选择病毒的产生细胞。
1.1准备工作（用品）：
(1)适当的包装细胞系及培养液
(2)大多数包装细胞系为鼠源的，含有鼠“Helpe病毒”，此病毒可帮助被去除某些功能结构基因的逆转录病毒复制，并包装于蛋白衣壳中。
(3)逆转录病毒质粒DNA常构建成含有抗药基因neo新霉素基因的载体。
(4)Hepes-缓冲液(HeBs)
(5)2mol/L CaCL2
(6)含血清及不含血清培养液
(7)HeBs 15%甘油（HeBs/甘油）
(8)800mg/L(100×聚凝胺)(肝素对抗物)
(9)10%～15%DMSO
(10)10cm、6cm培养皿
(11)24孔、6孔培养板
(12)克隆环
1.2操作步骤：
(1)转染前，10cm培养皿中接种大约10%～20%皿底面积的包装细胞。
(2)将10μg含抗药基因的逆转录病毒质粒DNA加入0.5mL HeBs中，加入32μL 2mol/L CaCL2,轻振动，加盖30分钟，室温下培养45分钟，直到小的、模糊的兰色沉淀产生。
(3)从包装细胞中弃去旧液，轻轻滴入HeBs-DNA沉淀于细胞培养皿中心，使细胞接触DNA20分钟，每10分钟轻轻摇动培养皿，使溶液均匀，加入10mL培养液，并于37℃放置4小时。
(4)完全吸出培养液，逐滴加入2.5mL的HeBs/甘油，放回培养箱继续培养，如果使用的是ψ2/YCRE/YCRIP/PA317包装细胞系，需培养3.5分钟，若为Q2bn包装细胞系，需培养1.5分钟，或根据不同包装细胞选用不同时间。
迅速弃去HeBs/甘油，用10mL培养液洗2次，加入含有血清的5ml培养液培养18～24小时。
(5)取出培养液用0.45μm过滤，可获得含有短期产生病毒的培养上清，-70℃或-80℃贮存，或立即用于其它包装细胞系的感染。
(6)加入10ml培养液于上述已感染的细胞，继续培养2～3天，继续步骤10。
(7)另一包装细胞受感染前1:10或1:20传代。
(8)倒去包装细胞的培养液，加入步骤5获得的病毒。
方法如下：
对于10cm培养皿，将0.1至1.0mL病毒贮存液稀释至3～5mL的终体积，加入800mg/L聚凝胺至终浓度为8 mg/L，培养1小时以上。
(9)若10cm培养皿加入10mL培养液，6mL培养皿中应加入4mL培养液，培养2～3天。
(10)步骤6或步骤9得到的感染细胞，2～3天后按1:10或1:20传代，接种于选择培养液培养3天，更换培养液，继续培养3～4天，直至克隆出现。
(11)用克隆环挑出分离的克隆，每个克隆接种24孔板或6孔板中的二个孔，生长至50～90%底部面积。
(12)倒去培养液，换入1倍体积的培养液，继续培养1～3天，收取培养液，马上滴定，或者贮存于-70℃或-80℃。
(13)继续传代克隆细胞直到能被冷冻或被鉴定，若病毒产生克隆被鉴定，10%～15%DMSO保护剂液氮冻存细胞。
即产生病毒细胞系建立。
2、病毒滴度鉴定
在分离产生病毒的克隆后，需进行病毒滴度的测定，常用的方法是用病毒感染目的细胞，可根据载体RNA 或蛋白的出现粗略定量分析。
2.1准备工作：
(1)病毒贮存液（步骤5所得）
(2)目的细胞系(NIH3T3成纤维细胞)
(3)G418或其它选择性药物
2.2操作步骤：
(1)目的细胞系NIH3T3细胞在感染前一天按1:10至1:20接种6cm培养皿。
(2)感染当日，弃去目的细胞培养旧液，加入含病毒的贮存液(步骤5所得)，用1～2ml含0.01～0.1病毒贮存液感染6cm培养皿目的细胞(或者3～5ml用于10cm培养皿中的细胞)，加入800 mg/L聚凝胺至终浓度为8 mg/L，培养1～3小时，37℃。
(3)加入培养液，稀释聚凝胺至2 mg/L，再继续培养2～3个细胞周期(NIH3T3细胞周期为2～3天)。
(4)-a，如果病毒带有组化标记基因，如LacZ,用X-gal染色感染细胞。
按步骤6计算蓝色克隆的数量以得到病毒的滴度。
(4)-b，如果病毒携带抗药基因，传代细胞应选择培养条件。
如果抗药基因为neo，细胞按1:10至1:20传代，接种含有G418的两个10cm(或6cm)培养皿中，培养3天。
(5)更换培养液(含选择性G418药物)共培养7-10天，此时克隆应该非常明显，计算克隆数。
(6)滴度计算公式：
G418-RCFU(集落形成单位)/m=克隆数/病毒体积(mL)×复制因子X接种率
若为(4)-a中所叙，病毒携带LacZ,用X-gal染色细胞根据显示的克隆数，计算病毒的滴度，其公式为：
X-gal CFU/mL=X-gal阴性克隆数/病毒体积(mL)
(7)其它方法再鉴定产生病毒的克隆，细胞所产生的病毒基因无重新排列或缺失。
2.3 X-gal对感染细胞的染色方法（此方法可使该病毒感染细胞着色，可用于直接测量病毒滴度）。
（1）准备工作
除以上各种实验用品外，尚需：
①带有LacZ编码病毒的转染(或感染)的细胞；
②固定液：0.05%戊二醛或2%多聚甲醛；
③X-gal染液。
（2）操作步骤
①倒去培养液，向感染细胞的皿中加入固定液(6cm皿加2mL，10cm皿加5mL)，加2%多聚甲醛室温固定60分钟，或0.05%戊二醛固定5～15分钟。
②去除固定液，用PBS洗3次，第二次洗涤时放置10分钟，首次和末次洗涤时则快速。
③加入最小体积的X-gal溶液，盖住细胞37℃1小时或过夜，阳性细胞（病毒感染细胞）则成兰色。
(二)原代培养正常上皮细胞的逆转录病毒转染
通过将病毒基因转染到上皮细胞中，使细胞可在体外无限生长，保持正常上皮细胞的特点。
1、准备工作：
(1)产生病毒的细胞系，方法见上。
(2)DMEM培养液谷氨酰胺0.02μg/mL
胰岛素0.25μg/mL
转铁蛋白0.12μg/mL
葡萄糖67.5μg/mL
10%小牛血清
聚凝胺1μg/mL
氢化考的松0.02μg/mL
(3)丝裂霉素C、胰酶、6cm培养皿
2、操作步骤：
(1)病毒产生细胞系暴露于丝裂霉素C(4 mg/L)2小时，洗干净后，胰酶消化，按5×106接种6cm培养皿，培养液为DMEM。
(2)待转染的原代培养正常上皮细胞接种于铺有以上细胞的培养皿中，培养3天。
(3)更换培养液，继续培养24小时。
(4)取50μL培养上清，进行病毒滴度检测，方法同前，9×103～7×104集落形成单位/mL可用于转染。
(5)正常上皮原代培养10天后，取贴在饲养层细胞的上皮细胞，保留至上皮细胞数生长量足够选择。
(6)在上皮细胞生长2～4周内，成活的克隆用克隆环挑出，再继续使用三轮有限稀释法建立单个细胞系克隆。
3、鉴定：
按病毒所带有的抗药基因进行选择培养筛选，或其它方法鉴定转染细胞，方法见后。
4、注意事项：
无论用什么方法将DNA导入细胞，暂时或稳定的转染率很大程度取决于细胞的类型。
不同的细胞系对获取外源性DNA以及表达的能力相差几个数量级。
此外，一种方法对一种培养细胞有效，但对另一种培养细胞可能无效。