(慢病毒-腺病毒-逆转录病毒)三种病毒表达系统的异同点
逆转录病毒
逆转录病毒（Retroviruses）归类于逆转录病毒科（Retroviridae），包括一大类含有逆转录酶（reversetranscriptase）的RNA病毒，分为肿瘤病毒亚科、泡沫病毒亚科和慢病毒亚科，每一亚科又有若干个属（表33-1）。肿瘤病毒亚科（oncovirinae）大多引起禽类、猫、鼠、猴等动物肿瘤，与人类疾病相关者有人类嗜T细胞病毒（humanT-celllymphotropicvirus,HTLV）；泡沫病毒亚科（spumavirinae）的致病作用尚不清楚；慢病毒亚科（lentivirinae）中的人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）则是艾滋病的病原体，正受到人类的广泛关注。三个亚科病毒的生物演化和亲缘关系见图33-1。
第一节 人类免疫缺陷病毒
人类免疫缺陷病毒（HIV），是获得性免疫缺陷综合征（acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS）的病原体。AIDS首次报道于1981年，1984年证实其病原为HIV。因病毒最初分离于淋巴腺综合征的同性恋患者血清，曾称之为淋巴腺病相关病毒（lymphadenopathy-associatedvirus,LAV），此后分别又有人类嗜T细胞病毒Ⅲ型（HTLV-Ⅲ）、AIDS相关病毒（AIDS-relatedvirus,ARV）之称。1986年经国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV）建议，将LAV、HTLV-Ⅲ和ARV统一命名为人类免疫缺陷病毒，俗称艾滋病病毒。HIV分HIV-1型和HIV-2型，前者引起全球AIDS流行，后者主要分离自西部非洲的艾滋病患者。HIV感染的范围在逐步扩大，我国自1985年发现首例AIDS以来，感染人数逐年快速增长，严重威胁着人类的身心健康，受到人们的广泛关注。
慢病毒相关知识问答
慢病毒载体相关知识问答
Q:什么是慢病毒？
A: 慢病毒载体(Lenti vector)是用于感染细胞以实现稳定导入基因
或siRNA的病毒载体系统，其感染效率可以达到100%。慢病毒和细
胞结合后通过包装蛋白将含有目的基因或者干扰序列释放到细胞
内。慢病毒RNA通过逆转录酶转录为DNA。DNA整合前复合体进入
细胞核并整合到靶细胞的染色体DNA。由于靶基因或基因干扰序列
整合到染色体上并且伴随着细胞分裂时DNA的复制一起复制，基因
的导入能够获得稳定的表达。慢病毒的显著优势在于其可以整合到
非分裂细胞，而其他载体（如非病毒载体、腺病毒载体、腺相关病
毒载体）不具备整合到靶细胞染色体的特性，或者只能整合到分裂
细胞的染色体（如常规的逆转录病毒）。目前我们使用的慢病毒载
体是基于HIV-1改造而来，该载体使用最为广泛，经过科学家的多次
改造在包装滴度和使用安全性等方面都非常理想。在实际的使用中
我们可以用来表达目的基因或目的基因加上报告基因，近年来随着
RNAi研究的深入，越来越多的科学家用慢病毒载体来表达干扰序列.
Q:慢病毒用于RNAi研究
A:目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型
细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成
siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大
的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细
胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而
且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达
载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建
的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成
的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的
RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1
慢病毒载体在基因治疗关节软骨损伤中的实验应用
・７６・ 中华关节外科杂志（电子版）２０１３年４月第７卷第２期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏ１．７，Ｎｏ．２
慢病毒载体在基因治疗关节软骨损伤中的实验应用
杨自权梁大川
【摘要】 基因治疗关节软骨损伤是传送目的基因至预定靶细胞，并且直接表达该基因的性质，
达到修复治疗软骨损伤的目的。基因载体是传递目的基因进入靶细胞的介导工具。但大部分基因
载体由于转染效率低、表达时间短、免疫反应大等诸多问题而运用新型的慢病毒载体使其介导目的
基因获得持续表达，从而使关节软骨损伤修复顺利进行。慢病毒载体在多用性和安全性上展示了令
人满意的特点，在基因工程中的运用更加安全，因此慢病毒载体成了最有潜力的基因工程工具。它
不仅能应用于实验室操作，还能应用于疾病的诊断和治疗方面。本文按慢病毒载体的发展简介、慢
病毒载体的生物安全性、在基因治疗软骨损伤中的应用以及展望四个方面对其予以综述。
【关键词】基因工程；关节软骨；慢病毒载体
在关节软骨损伤的治疗中研究者尝试用多种载体支架
结合骨髓间充质干细胞来修复软骨缺损，如脱细胞骨软骨支
架、聚乳酸一聚乙醇酸共聚物（ｐｏｌｙ ｌａｃｔｉｃ—ＣＯ．ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ，
ＰＬＧＡ）双层支架等，但由于因素单一缺乏环境因子的刺激，
研究者将目光投入到基因工程，利用能介导相关基因并结合
干细胞的基因载体，通过运载目的基因进入宿主细胞内使其
表达来完成对软骨损伤的修复”Ｉ２ Ｊ。目前基因载体的种类
有很多，包括非病毒载体（脂质体）、病毒载体（逆转录病毒
载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体）等，
慢病毒载体属于一种新型的逆转录病毒载体与其他载体相
比，其最大的优势在于可以同时感染处于分裂期和非分裂期
的细胞，而且转染效率较高，免疫原性低，不易诱发宿主免疫
反应，可以容纳较大的外源性基因，目的基因可以整合到宿
哺乳动物表达系统
哺乳动物细胞表达系统
按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。本文主要从表达系统及其两个组成部分——表达载体和宿主细胞等方面，简要介绍哺乳动物细胞表达系统和相关的研究进展。
研究现状
①部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段。
②已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。有些产品已投入临床应用或试用。
③虽然经过多年努力，哺乳动物细胞表达系统的表达水平有大幅度增高，但从整个水平上看仍偏低，一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/l08细胞/24小时。有人认为其限速步骤可嚣是在工程细胞中(对于重组蛋白来讲，常是异源的)，重组蛋白的分泌效率较低。
1
表达载体
1．1
表达栽体的类型
哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。
根据进入宿主细胞的方式，可将表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。另外，杆状病毒载体应用于哺乳动物细胞的表达在近几年颇受重视，这是因为它与其它病毒载体相比有特有优势，如可通过昆虫细胞大量制备病毒颗粒；可感染多种哺乳动物细胞，但在细胞内无复制能力，生物安全度高；可插入高达38 kb的外源基因等。
慢病毒包装体系的建立与体外表达
慢病毒包装体系的建立与体外表达
王雪晗;贾俊龙;王维;朱玉博;许诺;白文林;罗光彬
【摘 要】In order to select the best processing time of lentivirus
transfection, to study the optimum concentration of three plasmids about
lentiviral packaging, as well as transfected rate and titer of the 293T cells,
this experiment was conducted. Liposome mixes with Fugw plasmid were
transfected into 293T cell line, morphology and fluorescence expression of
293T cell were observed. The results showed that cell morphology after 6h
transfection was slightly better than that 8h transfection. The rates of 8h
transfection and 6h transfection were significantly higher than that of 10h
transfection (p﹤0.01), but there was no significant difference between 8h
and 6h after transfection (p>0.05). The ratio of plasmid of 4:3:2 showed
that lentivirus obtained the highest titer, up to 3.795×107 TU•mL-1, titer
转录过程中慢病毒,腺病毒,逆转录病毒三种病毒表达系统的区别
慢病毒，腺病毒，逆转录病毒三种病毒表达系统的区别
慢病毒表达系统
一种很常用的哺乳动物病毒表达系统；慢病毒感染宿主细胞时，可将携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，实现目的基因稳定、长期的表达，非常适合于基因过表达稳定细胞株的建立和RNAi研究。
腺病毒表达系统
一种很常用的哺乳动物病毒表达系统；但与慢病毒不同的是，腺病毒基因组及其携带的外源基因不会整合入宿主细胞的基因组中，而是游离于宿主基因组外独立表达，因此可实现目的基因瞬时、高丰度的表达，同时还避免了因整合而引发的潜在的基因突变和随机效应，安全性和可控性高。
逆转录病毒表达系统
逆转录病毒将自身基因组及其携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，可实现目的基因稳定、长期的表达逆转录病毒表达系统根据不同的包装细胞系可分为单嗜性、双嗜性和泛嗜性，不同包装细胞产生的逆转录病毒能够特异性地感染某一个或某一类宿主细胞。辉骏生物采用的病毒包装细胞系为plat E细胞系，该细胞系包含gag、pol和env基因，因此转染单一表达质粒就可以包装出逆转录病毒，但是该病毒具有很强的针对性，只适用于大鼠、小鼠细胞稳定株的建立。
三种病毒表达系统的特点
慢病毒表达系统 腺病毒表达系统 逆转录病毒表达系统
病毒基因组 RNA DNA RNA
病毒原型 人类免疫缺陷I型病毒
(HIV) 人5型腺病毒
(Ad5) 莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)
载体系统 1个表达质粒和3个包装质粒 1个穿梭质粒和1个辅助质粒 1个表达质粒
包装细胞 293T细胞 293细胞 plat E细胞
包装方式 表达质粒与辅助质粒共转染包装细胞获得重组慢病毒颗粒；包装细胞不裂解，病毒被分泌至上清中 表达质粒与辅助质粒共转染包装细胞获得重组腺病毒颗粒；病毒感染后包装细胞发生裂解。 表达质粒转染含所有必需蛋白的包装细胞即可获得重组病毒颗粒；包装细胞不裂解，病毒被分泌至上清中
慢病毒包装
慢病毒包装．
慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，它需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。它包括人免疫缺陷病毒（HIV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）、猿免疫缺陷病毒（SIV）、牛免疫缺陷病毒等。其中研究最多的是HIV-1慢病毒。
慢病毒载体（Lentivirus vector）是以慢病毒基因组为基础，由所需的目的基
因取代部分基因构建而成。目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。与一般的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而实现持久表达。在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。
随着人们对慢病毒载体的深入研究，为了提高慢病毒在临床上使用的安全性，慢病毒载体的优化也在不断的探讨中。慢病毒载体的发展经历了三个阶段，第一代慢病毒载体系统是以三质粒系统为代表，在构建时把HIV-1基因组中进行包装、逆转录和整合所需的顺式作用原件与编码反式作用蛋白的序列分离，分别构建在三个质粒表达系统上，即包装质粒、包膜质粒和载体质粒。包装质粒在巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）启动子的作用下，控制除env以外所有病毒结构基因的表达；包膜质粒编码水泡口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）G糖蛋白；载体质粒中含有目的基因。用这三种质粒共转染包装细胞如人胚胎肾293T细胞，在细胞上清中即可收获只有一次感染能力、而无复制能力的慢病毒颗粒。第一代慢病毒载体系统的特点是在构建三种包装质粒时，为了降低产生有复制能力的病毒的可能性，尽可能减少三种质粒之间的同源序列，但包装质粒中仍然保留HIV的附属基因。第二代慢病毒载体系统是在第一代的基础上进行改进，在包装质粒中删除了HIV的所有附属基因。这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和感染能力，同时增加了载体的安全性。第三代慢病毒载体系统又增加了两个安全特性：一是构建自身失活的慢病毒载体，即删除了U3区的3′LTR, 使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；二是去除了tat基因，用异源启动子序列代替，这样原始的HIV基因组中的9个慢病毒载体中只保留了3个（gag、pol和rev）。因此第三代慢病毒载体系统更加安全。
慢病毒载体,稳定表达
慢病毒载体，稳定表达
一、慢病毒
逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA， 再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。
慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。
最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。
慢病毒结构：
2个调节基因：
（1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。
（2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。
4个辅助蛋白（附属）基因：
（1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生；
（2）vpr和nef参与疾病的表现。
慢病毒的优势：
1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因；
2.可感染分裂和非分裂细胞；
3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验；
4.可以更换特异性启动子；
5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb； 二、慢病毒载体
慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。
慢病毒包装过程：
慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。
慢病毒,腺病毒,逆转录病毒三种病毒表达系统的区别
慢病毒，腺病毒，逆转录病毒三种病毒表达系统的区别
慢病毒表达系统
一种很常用的哺乳动物病毒表达系统；慢病毒感染宿主细胞时，可将携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，实现目的基因稳定、长期的表达，非常适合于基因过表达稳定细胞株的建立和RNAi研究。
腺病毒表达系统
一种很常用的哺乳动物病毒表达系统；但与慢病毒不同的是，腺病毒基因组及其携带的外源基因不会整合入宿主细胞的基因组中，而是游离于宿主基因组外独立表达，因此可实现目的基因瞬时、高丰度的表达，同时还避免了因整合而引发的潜在的基因突变和随机效应，安全性和可控性高。
逆转录病毒表达系统
逆转录病毒将自身基因组及其携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，可实现目的基因稳定、长期的表达逆转录病毒表达系统根据不同的包装细胞系可分为单嗜性、双嗜性和泛嗜性，不同包装细胞产生的逆转录病毒能够特异性地感染某一个或某一类宿主细胞。辉骏生物采用的病毒包装细胞系为plat E细胞系，该细胞系包含gag、pol和env基因，因此转染单一表达质粒就可以包装出逆转录病毒，但是该病毒具有很强的针对性，只适用于大鼠、小鼠细胞稳定株的建立。
三种病毒表达系统的特点
慢病毒表达系统 腺病毒表达系统 逆转录病毒表达系统
病毒基因组 RNA DNA RNA
病毒原型 人类免疫缺陷I型病毒
(HIV) 人5型腺病毒
(Ad5) 莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)
载体系统 1个表达质粒和3个包装质粒 1个穿梭质粒和1个辅助质粒 1个表达质粒
包装细胞 293T细胞 293细胞 plat E细胞
包装方式 表达质粒与辅助质粒共转染包装细胞获得重组慢病毒颗粒；包装细胞不裂解，病毒被分泌至上清中 表达质粒与辅助质粒共转染包装细胞获得重组腺病毒颗粒；病毒感染后包装细胞发生裂解。 表达质粒转染含所有必需蛋白的包装细胞即可获得重组病毒颗粒；包装细胞不裂解，病毒被分泌至上清中
病毒包装实验整体流程及原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理
目的基因不能直接整合到大多数真核细胞， 常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染
细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类
病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒
1.1慢病毒
1.1.1原理
慢病毒(Lentivirus )是逆转录病毒的一种。构建的 siRNA / miRNA慢病毒载体，与化
学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA载体相比，一方面可以扩增替代
瞬时表达载体使用，另一方面， Len tivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于
感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞， 并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
1.1.2特点
1) 直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi研究和体
内实验中难以转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞 )。
2) 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3) 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4) 无需任何转染试剂，操作简便。
5) 可以根据客户需要制备多种标记。
1.1.3慢病毒包装简要流程：
1) 含有目的基因的慢病毒 RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2) 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞 293T等。
3) 培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4) 病毒的纯化和浓缩。
5) 分装、-80 C保存。
6) 滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
1.2、腺病毒
1)
2)
3)
4)
5) 1.2.1原理
腺病毒(Adenovirus , Ad)是一种无包膜的线状双链 DNA病毒，其复制不依赖于宿主细
胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型 2和5,通过转基因的方式取 代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达 E1和E3基因的细