ADA缺乏症的基因治疗

ADA缺乏症的基因治疗ADA缺乏症是SCID的主要病种，约占25％。

ADA缺乏症是人类基因治疗研究得较为成熟的一种常染色体隐性遗传性疾病。

由于ADA基因的克隆化早已完成，对其表达的调控认识得也比较清楚，ADA编码基因属于持家基因的范畴，因此人类历史上第一种以基因治疗的疾病就是：ADA缺乏症。

一、ADA缺乏症发病机制ADA有数种同功酶，在电泳上有二个带，分子量各带相异。

ADA广泛存在于各种组织与细胞中,在细胞中有三种同功酶，在组织中有四种同功酶。

除红细胞外，ADA在脾脏、皋丸、甲状腺、肺脏、肾脏次之；在心脏、肝脏、胃粘膜和肌肉中也存在。

其中以脾脏中的酶活性最高。

ADA在核酸代谢中具有重要作用。

它可催化腺苷变为次黄嘌呤核苷，后者再在嘌呤核苷磷酸化酶的作用下变为次黄嘌呤，又在黄嘌呤氧化酶作用下经黄嘌呤变为核酸代谢的最终产物一尿酸。

脾脏是重要的免疫器官，在人体免疫系统的发育中占有极为重要的地位。

当ADA缺乏时，细胞内腺苷及嘌呤核苷酸的水平增高，使乳清酸向乳清酸苷的转变被封闭，以致影响B淋巴细胞及免疫系统的发育，引起严重的体液、细胞免疫联合缺陷。

除此之外，ADA缺乏引起免疫缺陷的另一种可能的机制是存在一种抑制免疫的血清因子。

ADA基因异常时常可累及多种细胞，如红细胞等，但T、B淋巴细胞对腺苷及嘌呤核苷酸的敏感性远较其它种类的细胞敏感，因此这些核苷酸代谢产物的累积，对淋巴细胞的毒性和危害最大，因此导致T、B淋巴细胞的成熟过程及功能障碍，造成SCID的免疫病理状态。

二、ADA基因异常1983年人ADA的cDNA克隆化三家同时成功。

编码区有1089个核昔酸组成，编码的ADA 由363个氨基酸残基组成。

ADA基因组DNA的全长为3204个碱基对，由23个内含子和12个外显子序列组成。

ADA缺乏症是一种常染色体隐性遗传疾病，其基因的异常又分为纯合子型和杂合子型两种。

根据对多地区、多个ADA缺乏症ADA基因的序列的测定以及与正常人ADA序列的比较结果，目前认为ADA基因序列点突变至少发生在8个位点上。

如表19一l表示。

碱基部位1.外显子1区2.IVS3一3，接合区3．外显子4(297)4．外显子4(302)5．外显子4(301)6．外显子7(632）·7．外显子10(911)8．外显子11(986)ADA基因上述8个位点上的突变中，2种情况下导致无ADAmRNA的产生，另外6种情况下，有3种是造成精氨酸残基(Arg）突变的结果。

说明ADA基因中有关Arg之密码子的突变较为常见。

三、ADA基因转移的靶．细胞正常情况下，ADA可由多种不同的组织细胞类型来表达。

说明ADA的表达其组织细胞的特异性不强。

为ADA缺乏症基因治疗靶细胞的选择提供了较广的范围。

到目前为止，以各种基因转移方法将ADA基因导入的细胞种类至少有7种。

包括淋巴细胞、血管内皮细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管垂滑肌细胞、骨髓造血干细胞、二倍体皮肤成纤维细胞等。

外周血淋巴细胞是ADA缺乏症影响和危害最大的细胞，来源较为丰富，取出和回输较为容易，体外在重组白细胞介素的作用下可进行一定时间的培养，对逆转录病毒载体等的感染具有一定的敏感性，因此，淋巴细胞是ADA缺乏症基因治疗的靶细胞较为常用的种类。

但淋巴细胞的寿命一般较短，一个月到数个月不等。

随着转导淋巴细胞的死亡，ADA的表达量势必逐渐下降，到一定程度，ADA的分泌量不足以发挥其治疗作用，同样的基因治疗操作程序必须熏新进行。

因此，人们同时也想到了寿命较长的靶细胞种类。

最为常用的就是骨髓造血干细胞，在小鼠等动物和人体上，以逆转录病毒载体转导都有成功的报导。

只是骨髓干细胞在骨髓整个细胞群中都是难以分离培养，因为占的比例太少，不足0.05％。

虽然如此，骨髓干细胞依然是人价梦寐以求的靶细胞种类，希望通过骨髓干细胞的转导和回输，达到持久的基因治疗效果，起码是可以减少重复基因治疗的次数。

除了外周血淋巴细胞、骨髓干细胞作为ADA缺乏症基因治疗的靶细胞以外，血管内皮细胞和血管平滑肌细胞也由于其来源丰富，且易于操作，近邻血流等特点经常被选为靶细胞。

其次肝细胞，皮肤成纤维细胞也是ADA缺乏症基因治疗中靶细胞种类潜在的候选者。

四、ADA基因转移方法ADA缺乏症的基因治疗，首先是如何将正常人的ADA基因导入到体外培养的或在体的靶细胞中去，这是人DA缺乏症基因治疗的关键所在。

过去的十几年中，尽管人们相继建立了基因转移的物理法、化学法、融合法等，在基因工程和蛋白质工程研究中发挥了重要作用，但终因其基因转移的效率太低，仅达1/1,000一1/100,00。

，在基因治疗有限的操作时间内，难以取得治疗意义上所需足够数量的转导细胞，不能满足基因治疗对基因转移效率的要求，这也是早期的基因治疗研究难以取得成功的一个重要原因。

1983年，逆转录病毒载体基因转移技术的出现和不断发展，可以说是在基因治疗的基因转移技术中发生了革命性的变化。

逆转录病毒载体一包装细胞系基因转移系统，由于重组逆转录病毒载体在包装细胞中的大量复制而得到放大，借助病毒颗粒上包膜蛋白及其靶细胞膜上该蛋白的受体介导重组逆转录病毒载体包装成的假病毒颗粒对靶细胞的高度感染力，重组逆转录病毒载体本身表达的整合酶（integrase）催化重组逆转录病毒载体DNA与靶细胞染色体DNA的高效整合，因此，逆转录病毒载体一包装细胞系基因转移系统具有无与伦比的高效率和稳定表达获得的高比率，成为基因治疗中占有最重要地位的基因转移方法。

ADA 缺乏症基因治疗的ADA基因转移也广泛采用了逆转录病毒载体基因转移途径。

据不完全统计，自1985年以来，应用各种类型的逆转录病毒载体一包装细胞系进行了ADA基因转移的研究。

其中最为常用的逆转录病毒载体是pNZ及其衍生系列。

构建一株逆转录病毒载体必须考虑如下这些因素：.1．病毒载体可以在其包装细胞中大量复制，以产生高滴度的病毒颗粒，以满足感染靶细胞的需要。

2．病毒载体可以指导外源基因，包括目的基因和标记基因在靶细胞中的表达。

3．病毒载体在靶细胞中以整合方式存在，以便进行长期、稳定、高效表达。

目前应用的逆转录病毒载体都是由MoLV前病毒形成的DNA构建而成。

经过包装细胞，一般都能产生10℃Fu／毫升的假病毒滴度，完全可以满足ADA基因转移的要求。

五、ADA缺乏症基因治疗实验研究ADA缺乏症基因治疗实验研究包括体外培养的离体细胞ADA基因的转移，低等动物，如小鼠等淋巴细胞．ADA基因转移、回输，以及较高等的动物，如猴的淋巴细胞ADA基因转移、回输。

所有这些实验，一方面证明了人ADA基因转移技术纠正ADA缺乏症的有效性，另一方面也证明了实验系统中所应用的逆转录病毒载体一包装细胞系，以及靶细胞的转导与回输这一整套程序是切实可行的。

而且也是安全无害的。

为把基因治疗推向临床应用，提供了可靠而宝贵的实验资料。

Culver及其合作者（1991）应用逆转录病毒载体LASN，包装细胞系PA317系统，将ADA基因及SV4。

病毒序列中的启动子序列一起导入小鼠及人的体外培养的淋巴细胞中，．结果证明人及小鼠的淋巴细胞都能获得外源性的ADA基因稳定整合和高效表达，持续数月之久。

人ADA基因转入肿瘤浸润的淋巴细胞，也获得了表达。

证明逆转录病毒载体导入ADA基因，可以纠正体外培养的淋巴细胞的ADA表达缺陷。

Ferrari等（1991）应用双表达逆转录病毒载体PDC，以及包装细胞系PA317基因转移系统，将人ADA基因导入体外培养的小鼠外周血淋巴细胞（PBL）中，获得转导的细胞再回输入ADA缺陷小鼠的血流中，可使此免疫缺陷小鼠的免疫系统得以重建，血中出现免疫球蛋白及抗原特异性T淋巴细胞．这一ADA缺馅动物模型体外培养的外周血淋巴细胞，以逆转录病毒载体一包装细胞系基因转移系统将ADA基因导入，再回输到血循环中，转导的PBL表达ADA以纠正ADA缺陷引起的免疫缺陷基因治疗经典途径，为人ADA缺乏症基因治疗提供了丰富的体内实验依据。

在体外培养的细胞以及小鼠体内ADA基因转移与表达的实验都获得了令人满意的结果以后，Kantoff等应用较高等的动物一猴进行同样的实验，也得到了令人鼓舞的结果，他们应用逆转录病毒载体PS^x及包装细胞系基因转移方法，将人ADA基因导入了猴的骨髓造血干细胞，然后回输到致死剂量放射照射的供体猴内，所实验的猴都能重建自己的造血系流，并且有一定水平人ADA的基因表达，且存活期都在9个月以上。

在整个实验过程中，未发现逆转录病毒血症，骨髓功能抑制，造血干细胞瘤，实体瘤及其它病理改变。

六、ADA缺乏症基因治疗人体实验早在1987年，美国国立卫生研究院（NIH）的三位科学家就着手人类基因治疗方案的制订和论证。

由于当时基因治疗所涉及的技术问题以及可能带来的社会伦理问题，而迟达。

没有得到批准。

1989年1月19旧，美国NIH，重组DNA咨询委员会（RAC)，食物与药物管理局FDA）等五家医政单位经过十余次的正式评审和论证，终于批准了一个由R6senberg 领导小组的基因转移人体实验计划，即以逆转录病毒载体，将一个野生型的细菌抗性基因，以逆转录病毒载体LNL6和包装细胞系基因转移方法，导入体外培养的黑色素瘤（melanoma）肿瘤浸润的淋巴细胞（TIL)中，在G418这种新霉素类似物的筛选作用下，得到成功转导的细胞，以重组白细胞介素一2刺激作用下进行扩增，再进行体内回输，以多聚酶链反应（PCR）等敏感的检测技术对ncoR基因进行超微量检测，以跟踪转导的TIL回输以后游走路径、·分布以及其寿命。

这是人类历史上第一次以逆转录病毒载体基因转移系统导入一种人体内不存在的基因的人体实验，获得了全部预期的结果。

对受试黑色素瘤病人进行了非常严密的监测和观察，未发现由于逆转录病毒载体或野生型基因的导入引起的不良反应．在这样的背景下，NIH等单位又批准了1990年的ADA缺乏症基因治疗人体实验方案，至此，人类基因治疗的临床研究宣告正式开始。

所以选择ADA缺乏症作为人类基因治疗临床试验的第一个病种，除了ADA缺乏症病因明确，病机清楚，以及研究人鼻对之有较为深而广的认识以外，主要还取决于ADA缺乏症的以下几个特点。

1．以骨髓移植可以治疗ADA缺乏症。

2．如不进行人淋巴细胞抗原配型，这种病便不能以骨髓移植方法治愈。

3.ADA缺乏是一种常染色体隐性遗传性疾病，而且酶的缺陷只限于单一基因的异常。

4．人ADA基因1983年就得到克隆化，而且已实现与逆转录病毒载体的重组。

5.ADA基因的表达不需要进行精确调控，ADA基因的表达水平即使低于正常人水平，也足以治愈；而且高于正常水平的表达也不至于给患者带来危害。

6．遗传缺陷得到纠正的淋巴细胞，在体内可以形成选择性生长优势。