黑曲霉鉴定操作规程
一株产酸黑曲霉的分离鉴定及其在盐碱土改良中的应用
一株产酸黑曲霉的分离鉴定及其在盐碱土改良中的应用产酸黑曲霉（Aspergillus niger）是一种常见的真菌，广泛分布于自然界中，生长在温暖潮湿的环境中，如土壤、水体、食物等。
该真菌具有很高的适应性和生物活性，在农业生产中具有重要的应用价值。
本文将介绍一种分离鉴定产酸黑曲霉的方法，并探讨其在盐碱土改良方面的应用。
一、分离鉴定产酸黑曲霉的方法1. 样品采集：选择土壤、水体、食物等环境中的样品作为分离产酸黑曲霉的原料。
在采集样品时应注意避免污染和气候条件。
样品应当尽快送到实验室进行处理。
2. 样品处理：将样品进行湿热处理，即将样品置于70℃的恒温水浴中加热30分钟，杀灭潜在的竞争菌。
3. 分离培养：将处理后的样品取少量接种于含有培养基的培养皿中，使其在恒温条件下孵育。
常用的培养基包括片状琼脂和液体培养基。
4. 筛选菌株：经过一段时间的培养后，将培养皿中生长出的真菌进行筛选。
产酸黑曲霉的特征为菌落呈黑色，有明显的酸性反应，可用酸碘溶液进行初步检测。
5. 培养条件优化：筛选出的产酸黑曲霉菌株进行后续培养、鉴定和分离，同时优化培养条件，如温度、湿度、pH值的控制，以获得最佳的生长效果。
6. 分离纯菌株：通过菌落摘取法分离得到纯菌株，并进行鉴定。
鉴定方法可通过形态学特征、生理生化特性和分子生物学等方法进行。
盐碱土壤是指土壤中盐分和碱分含量较高，pH值偏碱性的土壤。
盐碱土壤的存在会严重制约农作物的生长和发展，降低土壤肥力，影响农业生产。
而产酸黑曲霉具有分解有机物的能力和耐盐碱的特性，因此可以在盐碱土改良中发挥重要作用。
1. 有机物分解：产酸黑曲霉具有分解有机物的能力，可以促进盐碱土壤有机物的分解，提高土壤肥力和透气性。
通过将产酸黑曲霉添加到盐碱土中，分解土壤中的有机物，释放大量的二氧化碳和其他生物活性物质，改善土壤结构，提高土壤肥力。
2. 产酸黑曲霉促进矿质释放：产酸黑曲霉具有分解矿质的能力，能够分解土壤中的矿物质，释放出有益元素。
黑曲霉β-甘露聚糖酶的纯化和活力测定试验指导
黑曲霉β-甘露聚糖酶的纯化和活力测定实验指导（综设实验）一．实验目的及要求1、掌握黑曲霉ASP.Niger的固体发酵工艺2、掌握粗酶浸提、硫酸铵分级沉淀的原理和操作3、掌握透析原理、脱盐及透析袋的处理方法和使用4、掌握β-甘露聚糖水解各种甘露聚糖之间β-糖苷键的机制和理论5、掌握以魔芋精粉为底物DNS光度法（3,5－二硝基水杨酸法）测定发酵制品中β-甘露聚糖酶活力的操作方法二．实验原理1、微生物的β-甘露聚糖酶都是诱导酶，只有在培养基中含有β-甘露聚糖时才进行β-甘露聚糖酶的合成，产酶最适培养基除需要一定的碳氮源，还加入一定诱导物魔芋粉。
2、硫酸铵分级沉淀（盐析）原理中性盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化层逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。
3、透析原理、脱盐：酸性β-甘露聚糖酶相对分子质量为39000和40000，选择MWCO（切割分子量或截留分子量）14000的透析袋，透过掉分子量小于10000的蛋白质；并借助分子扩散脱盐。
4、DNS光度法测定还原糖：β-甘露聚糖酶能水解含β-1，4甘露糖苷键的甘露多糖（包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等），以魔芋精粉为底物主要得到含还原性端基的甘露寡糖，还原性端基与DNS试剂共热后被还原生成氨基化合物。
在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈棕（桔）红色，在520nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量，由此测定出酶的活力。
三．实验试剂和器材菌种：黑曲霉(Aspergillus niger)JXW12-1，生物工程发酵实验室保藏。
斜面培养基:马铃薯20.0%，蔗糖2.0%，琼脂 2.0%，pH自然，此培养基用于菌种保藏、斜面种子和平板分离。
二级种子培养基：250 mL三角瓶装麸皮10g，水12mL，121℃灭菌30 min；接种一菌耳斜面种子，32±1℃静置培养96h，其间翻曲2～3次。
黑曲霉
从富含淀粉质的土壤中筛选到1株耐酸性α-淀粉酶的产生菌株ZY8，经初步鉴定为黑曲霉。
并对其液态发酵条件进行了研究，产酶适宜培养基为可溶性淀粉50g/L，柠檬酸氢二铵20g/L，KH2PO43g/L，CaCl20.1g/L，FeSO·47H2O0.01g/L，MgSO·47H2O 1g/L。
以2%的接种量在30℃、120r/min、初始pH4.0的条件下培养72h，酶活力达到19.86U/mL。
1材料与方法1.1材料1.1.1分离样品富含淀粉质的土壤。
1.1.2培养基富集培养基：可溶性淀粉20g/L，KNO3 2g/L，MgSO4·7H2O1.2g/L，KH2PO42.7g/L，青霉素5×104单位，链霉素5×104单位，pH3.0。
分离培养基：可溶性淀粉20g/L，KNO3 2g/L，MgSO4·7H2O1.2g/L，KH2PO42.7g/L，琼脂15g/L~20，pH3.0。
鉴定培养基：采用察氏培养基。
产孢子培养基：马铃薯200g/L，蔗糖（或葡萄糖）20g/L，琼脂15g/L~20g/L，pH 值自然。
产酶基础培养基：可溶性淀粉40g/L，柠檬酸铵10g/L，KH2PO4 3g/L，CaCl20.1g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MgSO·47H2O1g/L。
1.2实验方法1.2.1耐酸性α-淀粉酶产生菌的筛选初筛：称5g采集的土样加入盛有50mL 无菌水的三角瓶中，振荡均匀后，取1mL 悬浮液加入100mL富集培养基中，30℃、120r/min振荡培养5d后，转入新鲜培养基，重复操作数次。
将培养好的1mL富集培养液经适当稀释后涂布在分离培养基平板上，30℃恒温箱中培养。
选择生长快、透明圈直径（H）与菌落直径（C）之比大于1者为初选菌株。
复筛：将初筛菌种接入产酶基础培养基中，30℃、120r/min摇床发酵72h，离心取上清液测酶活。
产柠檬酸黑曲霉的筛选
产柠檬酸黑曲霉的筛选组长：高鸿飞组员：刘光明，何笑军，董慧，王志昆，胡明慧（西南大学药学院，重庆 400716）【摘要】：以从西南大学各处土壤中分离得到的黑曲霉作为出发菌株，并对其进行了初步分离。
利用酸分离法和变色圈法进行初步筛选，以产酸能力的强弱作为复筛指标，筛选到了一株稳定，高产柠檬酸的优势菌株。
并利用正交实验法优选柠檬酸产生菌的最佳发酵培养基，紫外诱变育种法探究高产菌诱变的较佳时间。
【关键词】：黑曲霉；酸分离法；变色圈法；筛选；正交试验；诱变柠檬酸又名枸橼酸，是目前以微生物发酵生产的重要有机酸之一。
产柠檬酸的微生物包括真菌、细菌和酵母，黑曲霉是迄今为止产柠檬酸最佳的微生物之一。
本次实验的目的是从土壤中筛选柠檬酸的黑曲霉高产菌株，并对其培养基的配置及最佳产酸条件进行探索，为今后进一步完善和优化其筛选工艺提供一定理论依据。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 出发菌种从西南大学食堂周围，山顶，试验田土壤中分离获得。
1.1.2 培养基察氏培养基成分硝酸钠3g磷酸氢二钾1g硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g氯化钾0.5g硫酸亚铁0.01g蔗糖30g琼脂20g蒸馏水1000mL制法：加热溶解，分装后121℃灭菌20min。
1.1.3其他柠檬酸，可溶性淀，Deniges试剂，蔗糖 NH4NO3，KH2PO4，MgSO4·7H2O ，溴甲酚绿指示剂，氢氧化钠溶液，KMn044溶液1.2 实验方法1.2.1黑曲霉筛选的流程土壤→稀释分离→变色圈平板→挑菌→纯化→摇瓶初筛→产物鉴定→复筛→正交实验→最优组合→诱变育种1.2.2 黑曲霉的分离与鉴定采集表层以下 5-10cm 处土壤，称 1.0g 土壤迅速倒入装有玻璃珠的无菌水三角瓶中，配成 10-2的土壤菌悬液，然后用移液管将其稀释到10-3、10-4、10-5倍。
分别吸取10-3、10-4、10-5倍稀释液注入到酸分离培养基上以及涂布到察氏琼脂培养基上，静置 5min 后倒置于恒温培养箱内 35℃培养 3-4d，观察菌落形态特征，挑选出黑曲霉疑似菌株。
一株产酸黑曲霉的分离鉴定及其在盐碱土改良中的应用
一株产酸黑曲霉的分离鉴定及其在盐碱土改良中的应用盐碱土是指土壤中含有高浓度盐分和碱性物质的土壤，这种土壤对植物的生长和发展有很大的影响。
为了解决盐碱土的问题，许多研究人员开始探索使用微生物方法改良盐碱土。
近年来，发现了一株产酸黑曲霉的菌株，在盐碱土改良中具有较好的应用前景。
本文将对该菌株的分离鉴定方法进行介绍，并探讨其在盐碱土改良中的应用。
我们需要进行对产酸黑曲霉的分离和鉴定。
分离该菌株可以通过土壤样品的采集和处理来进行。
我们需要在盐碱土中选择一个合适的样品，保证其代表性。
然后，将土壤样品放置在适宜的培养基上进行培养，以便菌株的生长。
接着，通过菌落形态和结构特征的观察来初步鉴定该菌株是否为产酸黑曲霉。
进一步，可以通过分子生物学方法如PCR扩增和测序来确认其物种归属。
通过以上的步骤，我们可以得到一株纯培养的产酸黑曲霉菌株，为后续的应用研究提供基础。
然后，我们来探讨该菌株在盐碱土改良中的应用。
产酸黑曲霉具有多种菌体代谢产物，如有机酸和抗盐碱物质，这些物质对盐碱土的改良具有一定的作用。
产酸黑曲霉可以分解有机物质，生成有机酸，降低土壤的pH值，减少土壤的碱性。
产酸黑曲霉还可以分泌多种抗盐碱物质，如胞外聚合物和鞘脂类物质，提高土壤的抗盐碱能力。
这些物质的作用可以促进盐碱土中有益微生物的生长繁殖，改善土壤的物理结构和水分保持能力，从而提高植物对盐碱环境的适应性。
盐碱土改良中的应用不仅限于利用产酸黑曲霉的菌体代谢产物，还可以利用其降解盐碱土中的有害物质。
一些盐碱土中富含盐分和毒性物质，对植物的生长造成威胁。
产酸黑曲霉可以通过分泌多种酶类物质，降解这些有害物质，减轻对植物的毒性影响，增加植物的养分吸收能力。
产酸黑曲霉在盐碱土改良中具有良好的应用前景。
通过对其分离鉴定的研究，可以得到一株纯培养的菌株，为应用研究提供基础。
通过利用其菌体代谢产物和降解能力，可以改善盐碱土的物理和化学性质，提高植物对盐碱环境的适应性。
黑曲霉菌实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握黑曲霉菌的分离与鉴定方法；2. 了解黑曲霉菌的形态特征和生长习性；3. 掌握微生物实验的基本操作技能。
二、实验原理黑曲霉菌（Aspergillus niger）是一种广泛分布于自然界中的真菌，具有较强的发酵能力和酶活性。
本实验通过分离纯化黑曲霉菌，对其进行形态特征观察和生长条件研究，以了解其生物学特性。
三、实验材料1. 实验试剂：改良马丁培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基、无菌水、无菌棉塞、无菌吸管、无菌培养皿等；2. 实验仪器：恒温培养箱、显微镜、酒精灯、接种环等；3. 实验样品：土壤、谷物、植物性产品等。
四、实验方法1. 样品处理（1）取适量样品（如土壤、谷物等）置于无菌培养皿中，加入适量无菌水，用玻璃棒充分搅拌，制成悬浮液；（2）取适量悬浮液，用无菌吸管吸取一定量的样品，涂布于改良马丁培养基上；（3）将涂布好的培养基置于恒温培养箱中，37℃培养24小时。
2. 分离纯化（1）观察培养基上生长的菌落，选取典型的黑曲霉菌菌落；（2）用接种环挑取菌落，分别接种于葡萄糖酵母膏琼脂培养基上；（3）将接种好的培养基置于恒温培养箱中，37℃培养24小时，观察菌落特征。
3. 形态观察（1）用显微镜观察菌落形态特征，包括菌丝、分生孢子梗、分生孢子等；（2）记录菌落颜色、形状、大小、菌丝特征等。
4. 生长条件研究（1）将分离得到的黑曲霉菌接种于葡萄糖酵母膏琼脂培养基上；（2）在不同温度、pH值、营养物质条件下，观察菌落生长情况；（3）记录菌落生长情况，分析生长条件对黑曲霉菌的影响。
五、实验结果与分析1. 分离纯化结果经过涂布培养和分离纯化，成功分离出黑曲霉菌。
菌落呈黑色，表面光滑，边缘整齐，具有明显的放射状沟纹。
2. 形态观察结果显微镜下观察，黑曲霉菌菌丝呈白色，具有分隔，分生孢子梗自菌丝顶端生出，呈直角或锐角，分生孢子球形，褐色。
3. 生长条件研究结果（1）温度：黑曲霉菌在25-37℃范围内生长良好，最适温度为37℃；（2）pH值：黑曲霉菌在pH值4.0-7.0范围内生长良好，最适pH值为6.0；（3）营养物质：黑曲霉菌在葡萄糖酵母膏琼脂培养基上生长良好，适宜的营养物质为葡萄糖、酵母膏。
黑曲霉的分离
黑曲霉的分离筛选一、实验简介黑曲霉广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。
黑曲霉的最适温度为37℃，黑曲霉对营养要求较低,只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好，实验中采用察氏培养基进行培养。
黑曲霉的菌落蔓延迅速，但生长稍局限，菌丝初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。
顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗双层褐色，梗基较短，上长有成串褐黑色的球状分生孢子。
孢子直径2.5～4.0μm。
分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。
黑曲霉的个体形态和菌落形态都比较特殊，容易分辨，可利用平板划线法或稀释涂布法，得到单菌落，并结合显微镜检测，多步鉴定、纯化，得到的纯的菌种。
二、实验试剂与材料1、材料：黑曲霉孢子悬浮液2、溶液和试剂：硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、蔗糖、琼脂、1mol/L氢氧化钠溶液、1mol/L氯化氢溶液、75%乙醇、乙醇乙醚混合液、溴甲酚绿、水。
3、器材和其他用品：三角瓶、试管、搪瓷杯、培养皿、接种环、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、试管架、载玻片、盖玻片、光学显微镜、恒温培养箱、纱布、牛皮纸、滤纸、pH试纸、擦镜纸。
三、实验步骤和过程1、无菌器材及无菌水的准备1.1 培养皿：洗净的培养皿烘干后，每组将5套培养皿叠在一起，用报纸卷成一筒，然后进行灭菌。
注意，一定要卷紧。
1.2 试管：做合适的棉塞，每组捆扎5支试管，用报纸包在一起后，用线绳扎紧，扎成活结，另一头再用皮筋扎好，然后进行灭菌。
1.3 三角瓶：在三角瓶瓶口塞一八层纱布，盖上牛皮纸，用线绳扎成活结，然后进行灭菌。
注意，装入的培养基不超过三角瓶的1/2。
上述物品均要用记号笔注明班级、组别、日期。
1.4 高压蒸汽灭菌2、查氏培养基的配制称量→熔化→定容→调pH→分装→加塞→包扎标记→灭菌→搁置斜面与倒平板→无菌检查培养基配方：硝酸钠3g 磷酸氢二钾1g 硫酸镁（MgSO4·H2O）0.5g 氯化钾0.5g硫酸亚铁0.01g 蔗糖30g 琼脂20g 蒸馏水1000ml pH5.0-6.0 2.1 称量：按照培养基配方，依次准确地称取药品，放入搪瓷杯中。
黑曲霉使用说明
储存温度：-‐80℃
基 因 组 ：
黑曲霉
简 介 ：
黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的
菌落进行后续操作。
冷 冻 管 开 封 ：
用浸过 75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
菌 株 复 溶 ：
无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取 1ml 左右复溶液，加入到冷冻
管中。轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。
菌株复壮：
用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培
一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。是重要
的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄
糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。有的菌株还可将羟基孕甾酮转
化为雄烯。生长适温 37℃，最低相对湿度为 88%，能引致水分较高的粮
食 霉 变 和 其 他 工 业 器 材 霉 变 。
操 作 说 明 ：
1，本品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表
面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数
的增加，细菌的活力会逐渐下降。
2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆
养。细菌在 30-‐35℃培养箱中培养 24-‐48h，真菌在 23-‐28℃培养箱中培养 24-‐72h
（必要时，可适当延长培养时间）。
菌 株 传 代 ：
将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量
增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl 新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓
黑曲霉
编号 名称 ຫໍສະໝຸດ 北京华越洋生物 NRR00430
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黑曲霉鉴定操作规程
黑曲霉（Aspergillus niger）是一种广泛存在于自然环境中的真菌，常见于土壤、植物和食物中。
它具有强大的分解能力，可以分解有机物质并产生许多有用的代谢产物。
然而，黑曲霉也是一种致病菌，特别是在患有免疫系统抑制的人群中。
因此，快速准确地进行黑曲霉的鉴定非常重要。
下面是黑曲霉鉴定的操作规程。
1. 样品准备
- 从疑似受污染的土壤、食物或其他材料中采集样品，将样品放入密封的容器中。
注意避免任何可能的交叉污染。
- 将样品送至实验室进行进一步处理。
2. 样品处理
- 将样品进行适当的粉碎或稀释。
对于固体样品，可以使用食品搅拌器或研钵进行粉碎。
对于液体样品，可以直接使用适当的稀释液进行稀释。
- 将样品制备成适当的稀释液，以便于后续的实验操作。
3. 培养基选择
- 选择适当的培养基来培养黑曲霉。
黑曲霉常见于一般的富含碳水化合物和氮源的培养基，如马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）或麦芽提取物琼脂（MEA）。
也可以使用含有
指示剂的培养基，如酚红琼脂葡萄糖培养基，以便于观察黑曲霉的生长情况。
4. 接种
- 使用无菌技术将样品接种至培养基上。
可以使用无菌的棉签或针头，将样品均匀地涂抹在培养基表面上。
- 根据需要，可以在培养基上划出不同的区域，以便于对不同样品进行观察和比较。
5. 培养条件
- 将培养皿或培养瓶密封并放置在适当的温度下培养。
黑曲霉通常在25-30摄氏度下生长最佳，但可以进行不同温度的培养来筛选黑曲霉菌株。
- 在培养过程中，注意观察并记录菌落形态、颜色和生长速度等特征。
6. 鉴定
- 观察在培养基上生长的菌落形态，黑曲霉的菌落通常呈黑色，有时也可以呈灰色、绿色或棕色。
- 进一步进行显微镜观察，观察菌丝及分生孢子的形态和结构特征。
黑曲霉的菌丝通常呈无色，分生孢子呈黑色，形状多样，有时具有规律的排列方式。
7. 鉴定结果确认
- 根据观察到的菌落特征和显微镜观察结果，结合已知的黑曲霉的形态特征进行鉴定。
- 可以进一步进行分子生物学方法的确认，如PCR 扩增和测序分析，以确保鉴定的准确性。
注意事项：
- 在整个操作过程中，要保持严格的无菌操作，避免任何可能的交叉污染。
- 注意观察培养基上的其他微生物的生长情况，以便区分黑曲霉与其他菌种的区别。
- 合理选择培养条件和培养时间，以获得较好的黑曲霉生长和观察效果。
通过以上操作规程，可以对黑曲霉进行准确的鉴定。
这有助于及时识别和控制黑曲霉的污染，并采取相应的防范和处理措施，以保护人们的健康和环境安全。