临床生化常用的色原及检测波长
常见的生化检测方法
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------常见的生化检测方法Western-blot 法 Western Blot 印迹法是把通过电泳分离的蛋白质组分从凝胶转移至一种固相支持物，通过抗体与附着于固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生特异性反应进行检测。
Western Blot 既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定靶蛋白表达的最方便也是最通用的方法。
1、试剂耗材的准备：⑴、转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl， 39 mM 甘氨酸， 0. 037% SDS， 20%甲醇）：⑵、 10丽春红染液：⑶、 TBS 缓冲液：⑷、 TBST 缓冲液（含 20%Tween20 的 TBS 缓冲液）：⑸、封闭液（含 5%脱脂奶粉的 TBST 缓冲液）：⑹、一抗、二抗及抗体稀释液：参照说明书，以封闭液或 TBST 进行稀释。
⑺、底物显色液 ECL，4℃ 避光保存，现用现配。
⑻、显影液和定影液。
用水稀释 10-20 倍于铝盒中，可多次使用。
室温避光存放。
2、实验步骤：⑴、蛋白样品制备：1 / 15用细胞裂解液抽提蛋白，并测蛋白浓度。
⑵、取 1mg 蛋白进行 SDS-PAGE。
⑶、转膜：（转膜缓冲液4℃预冷备用，冷却装置于-80℃冰箱冷冻备用）。
⑷、将 2 张海绵垫、 2 张滤纸、转膜夹子及玻棒浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。
⑸、戴上手套，剪一张与凝胶尺寸相近的 PVDF 膜（83 mm75 mm），左上角剪一缺口作为标记，浸泡在盛有 20mL 甲醇的平皿中约 15 sec，直到膜变半透明。
用纯水冲洗膜2 次。
浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。
⑹、 SDS-PAGE 结束后，小心地剥下两块凝胶，一块用于考马斯亮兰染色观察电泳情况，另一块浸泡在转膜缓冲液中预平衡。
生物化学检验常用技术
5.标准溶液设置的浓度范围足够大。
2．比较法
己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测定 标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品浓度，可直接计 算出标本的浓度，计算公式为：
CR=(AR ×Cs)/As
13
二、发射光谱分析法
处于激发态的待测元素，原子回到基态 时以辐射的形式释放出能量，由此而产生的 光谱称为发射光谱，对元素进行定性与定量 分析的方法。
2、试剂空白：用不加样品，而显色剂和其他试剂都相同的溶液作参比溶液。 选择原则：当显色剂本身有颜色或其它试剂有颜色，被测试样中又无其他有色离子时，选用试剂参比。
3、样品空白：用不加显色剂的样品溶液作参比溶液。 选择原则：当试样溶液有颜色，而试剂、显色剂均无颜色时，选用样品空白。
4、平行操作空白：按样品分析完全相同的操作步骤，用不含待测元素的样品进行平行操作， 以消除操作过程中引入干扰杂质所带来的误差。
可用电极测定的气体
CO2 + H2O === HCO3- + H+ NH3 + H2O === NH4+ + OHSO2 + H2O === HSO3- + H+ 2NO2 + H2O === NO3- + NO2- + H+ H2S + H2O === HS- + H3O+ HCN + H2O === H3O+ + CNHF + H2O === H3O+ + F-
第二节 电化学分析技术
一、电位分析法― ISE
电位分析法 利用电极电位与浓度的关系测定物质含量的电化学分析方法。
离子选择电极 ISE
常用生化检测项目分析方法及参数设置
常用生化检测项目分析方法及参数设置一、常用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法)、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法)、葡萄糖(葡萄糖氧化酶法）、尿酸(尿酸酶法)、总胆固醇(胆固醇氧化酶法)、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇(直接测定法）、钙(偶氮砷Ⅲ法)、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等.以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法,包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用.2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。
3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。
一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等,也可用连续监测法。
4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗”O”、类风湿因子,以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法.二、分析参数设置分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等,其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改.各种测定项目的分析参数（analysis paramete）大部分也已设计好,存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。
生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。
因此必须理解各参数的确切意义。
一、分析参数介绍（一）必选分析参数这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测.1．试验名称试验名称(test code）是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来表示。
2．方法类型（也称反应模式) 方法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型。
临床生化检验
光谱分析技术：在一定条件下，相同物质的发射和吸收光谱与该物质呈正比，因此可对该物质进行定性、定量分析。
透射比浊法）、散射光谱（散射比浊法）比色杯：由无色透明，耐腐蚀，耐酸碱的玻璃或石英组成玻璃杯：可见光；石英杯：紫外光光径：0.1cm--10cm, 常用为：1.0cm分光光度计的光源：可见光：钨灯波长360-1000nm；紫外光：氘灯，波长200-340nm常用抗凝剂：草酸钾—氟化钠：是血糖测定标本常用的抗凝剂，25℃可稳定24小时，4℃可稳定48小时肝素：常用于血气分析和部分生化项目的测定1g/L的肝素溶液0.5ml可抗凝5ml血液EDTA：适用于一般血液学检测枸橼酸钠：浅蓝（浓度3.2%-3.8%比例1:9适用于凝血）黑色（浓度3.2%比例1:4适用于血沉）防腐剂：浓盐酸：0.5-1ml浓盐酸/100ml尿液，适用于24小时儿茶酚胺、秀草扁桃酸、17-羟皮质类固醇、17-酮类固醇等检测甲苯：尿液表面形成薄膜，防止细菌繁殖。
1-2ml/100ml尿液，适用于肌酐、尿糖、蛋白质、丙酮等生化项目测定冰醋酸：5-10ml/24小时尿，适用于尿醛固酮测定麝香草酚：抑制细菌生长，适用于钾、钠、氯、钙、氨基酸、糖、尿胆原、胆红素的测定特殊标本采集：临床医生采3个于无菌试管中，第一个做细菌检查，第二个做生化检查，第三个做细胞计数恒定系统误差：与被测物质浓度无关，与干扰物浓度相关；比例系统误差的绝对量与被测物浓度呈正比影响检验结果的生物学因素：婴儿CK、GGT、AST升高，胆红素生理升高但不很少高于85umol/L，血脂低，血钾可达7mmol/L,碱性磷酸酶活性高。
新生儿血糖浓度低老年人肾浓缩能力、肌酐清除率、肾糖阈下降，血尿素升高干燥剂：CaCl2吸收水和酒精；CaO吸收水和酸；硅胶只吸收水（蓝色有效，粉红色无效）玻璃仪器清洁剂配置：重铬酸钾50g，浓硫酸900ml，水100ml 红棕色有效，变绿效力降低，黑色不可使用实验室方法评估指标和实验：指标包括：精密度、准确度、检测能力评估试验：重复性试验、回收实验、干扰试验，方法比较试验实验室全面质控的内容：1有专人负责全面质控工作；2对工作人员进行医德医风教育和业务培训，普及质控知识；3 科学的管理和严格的规章制度是质控方案可以试试的保证；4有标准化的操作规程；5 有分析前和分析后的质量控制程序；6仪器量器的定期鉴定，校正和正确使用；7实验用水、试剂、质控品及校准品的质量符合要求；8采用的各种测定方法的准确度，精密度等技术性能良好；9 选择合适的室内质控方法，常规开展室内质控，对失控结果及时采取相应的处理措施；10参加实验室室间的质量评价活动或能力比对检验，认真分析回报结果，对失控的项目及时检查原因，采取相应的改正措施CILA88的PT方案主要内容要求：每年至少进行3次PT调查，每次调查至少包括5个不同的指控标本，即在一年的时间内对任意一项目至少可得15个测定，对某个特定的分析结果如落于规定限内则判断为接受结果，对某一个接受结果，不再进行优略分级，S1和S2均应＞80，否则判断为不满意，如果在S1或S2连续2次不满意或有2次以上不满意，判断为失败。
酶底物等色原
N-(2- 82692 羟基 -88-4 -3-磺 丙 基)-3 5-二甲 氧基苯 胺钠盐
1066 HDC 3,5-Dichlorophenol Sulfonic Acid, Di-Na 7536 BS
3,5-二 95041 氯苯磺 -38-6 酸.2N a
1832 HTBA 2,4,6-Triiodo-3-hydroxybenzoic acid 58
87 S
line sodium salt monohydrate
-N-(2- -97-5
羟基
-3-磺
丙
基)-3,
5-二甲
基苯胺
钠盐.1
水
1605 Nitro 2-(5-Nitro-2-pyridylazo)-5-(N-propyl-3-sulfopropyla 2-(5- 14320
38 -Paps mino) phenol disodium salt dihydrate
um Chloride.
氯化四 8-9 检测各
Iodonitrotetrazolium chloride
氮唑蓝
种脱氢 酶的电
子受体
1806 MTT 10
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2h-tetrazol 溴化噻 2348-
iumbromide
唑蓝四 71-2
偶氮胂 1668-
Ⅲ
00-4
1044 4-AA 4-Aminoantipyrine 21
4-氨基 83-07- 用于过
安替吡 8
氧化氢
啉
检测,和
TOOS 联用作
为 HRP 的底物
1475 INT 70
2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoli 碘硝基 146-6 色度法
各种生化指标测定方法
2.3 各项指标的测定方法2.3.1 生物学指标的测定于芥蓝菜薹采收期，每处理随机抽取6株，测定芥蓝生物学性状指标，包括株高，薹粗，节数，单株产量和叶面积。
2.3.1.1 株高测定菜薹长度为第一片真叶基部至生长点的距离，取平均值。
2.3.1.2 薹粗测定用游标卡尺测量第5与第6片叶之间的粗度，取平均值。
2.3.1.3节数和节间长度测定节数为第一片真叶基部起至生长点的节数，节间长度=株高/节数2.3.1.4 单株产量测定取第4节位以上植株进行测定，求单株鲜重。
2.3.1.5 蜡粉含量的测定参照Kumar.S方法测定（Kumar S，1987）。
将芥蓝叶片剪成条状，称取1.0g，放于培养皿中，用10ml氯仿浸泡30秒，取出叶片立即烘干。
将培养皿在室温下蒸发干燥，蜡粉含量为培养皿增重（mg/g）。
重复三次。
2.3.2 光和系统指标的测定2.3.2.1 叶面积的测定取第5片及以上共6片叶进行测定，求单株总叶面积。
采用Li-COR 公司生产的Li-3000A 型叶面积仪测量叶面积。
用直尺测量芥蓝叶片的长度（L，叶柄基部到叶尖的距离）和宽度（W，与主脉垂直的最大宽度），用Li- COR公司的Li- 3000A型叶面积仪测量实际叶面积（LA）。
用回归的方法建立实际叶面积与芥蓝叶片长乘以宽面积之间的回归方程，找出最佳回归系数。
2.3.2.2 比叶重测定于各处理中随机取10片叶子，用0.8mm打孔器，在叶片最宽处离主脉两侧的中心位置打孔，将10个小圆片放在烘样盒后在105℃杀青10min，再80℃烘至恒重。
比叶重=总叶干重/总叶面积(g/m2)2.3.2.3 叶绿素含量测定采用95%乙醇浸泡法（李合生，2000），称取剪碎的新鲜样品0.1g放入试管，用95%的乙醇15ml，在黑暗条件下浸泡24h，至叶片表皮变白，取上清夜在波长665nm、649nm、470nm下测定吸光度。
计算公式：叶绿素a（mg/L）=13.95A665－6.88A649 （1）叶绿素b（mg/L）=24.96 A649－7.32A665 （2）类胡萝卜素（mg/L）=（1000A470-2.05C a－114.8C b）/245(1)、(2)相加即得叶绿素总浓度，在按照下式计算叶绿素和类胡萝卜素的含量。
生化试验
实验一 分光光度计线性分辨范围测定一. 目的1.学习分光光度计的工作原理，掌握比色测定的基本操作方法。
2.掌握标准曲线的制作及分光光度计最佳测试浓度范围的确定。
二. 原理比色法是常用的生化分析方法。
利用分光光度计可以很方便地完成多种生物物质的定量分析。
比色法的理论基础是朗伯-比尔定律，其测定浓度范围要求在分光光度计线性分辨范围内。
光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。
肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400～750nm ；小于400nm 的光线称为紫外光；大于750nm 的光线称为红外光。
当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过，因此光线射出溶液之后，部分光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分析。
图1 Lambert-Beer 定律示意图分光光度法依据Lambert-Beer 定律：II 0lg = KCL令A = II 0lg，T =0I I，则A = KCL ，A = -lgT其中：T ：透光率A ：吸光度（有时用光密度OD 表示）I ： 透射光强度 I 0：入射光强度 K ：吸收系数 L ：溶液的光径长度 C ：溶液的浓度从上式可以看出，一束单色光通过溶液后，光波被吸收一部分，其吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比，当入射光、吸收系数K 和溶液的光径长度L 不变时，吸光度A 与溶液的浓度C 成正比。
用标准曲线法，即可对未知样品做定量分析。
三. 实验材料及设备1. 仪器UV5200型分光光度计。
2．器材I 0IC L刻度试管：25mL×21；移液器：1mL×1；吸头几支；烧杯：250mL×2，50mL×1；洗耳球：2；滴管：2；移液管（白线）：1 mL×1，2 mL×1，5 mL×1；洗瓶、试管架、移液管架：各1。
四. 试剂的配制0.01mol/L硫氰化铁（Fe (SCN)3）溶液：称取30.000g （过量）KSCN和27.05g FeCl3·6H2O，加入2.5mol/L HCl 100mL,用蒸馏水溶解后定容至10000mL（经验提示：保质期1星期）。
常用生化检测项目分析方法与参数设置
常用生化检测项目分析方法及参数设置一、常用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。
以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。
2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。
3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。
一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。
4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。
二、分析参数设置分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。
各种测定项目的分析参数（analysisparamete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。
生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。
因此必须理解各参数的确切意义。
一、分析参数介绍（一）必选分析参数这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测。
1．试验名称试验名称（testcode）是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来表示。
2．方法类型（也称反应模式）方法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型。
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临床生化常用的色原及检测波长Toos 545nm苯酚（对氯苯酚）505nmNAD（P）H指示系统，波长340nm，项目：ALT、AST、GLUC己糖激酶法、C K、UREA、LDH等。
苯衍生物类，波长400-410nm，如ALP、GGT、CHE等。
过氧化物酶指示系统，项目：TG、TCH、HDL-C、LDL-C、UA等。
可见光波长及其互补色：可见光波长及其相应被吸收的颜色依次为：红色（630～700nm）、橙色（600～630nm）、黄色（570～600nm）、绿色（500～570nm）、蓝色（435～500nm）、紫色（400～435nm）。
★540nm：1. 双缩脲测蛋白：所有蛋白质分子都含有肽键。
在碱性溶液中，肽键与铜离子结合，生成蓝紫色化合物，在540nm处吸光度与肽键的数量呈正比关系，可以计算蛋白质含量。
2. 染料结合法测脑脊液蛋白：在柠檬酸存在的酸性条件下，伊红Y燃料离解成阴离子型，染料的黄色消退，使试剂空白吸光度降低；另外，蛋白质多肽链中的精氨酸、组氨酸、赖氨酸和色氨酸残基，离解生成带－NH3+基团，与染料阴离子的羧基和酚基借静电吸引而结合成红色蛋白燃料复合物，其540nm处吸光度大小与蛋白质浓度呈比例。
★628nm：1. 溴甲酚绿法测血清白蛋白：在PH4.2的缓冲液中，白蛋白分子带正电荷，与带负电荷的溴甲酚绿（BCG）生成蓝绿色复合物，在波长628nm处有吸收峰。
复合物的吸光度与白蛋白浓度成正比。
★603nm：1. 溴甲酚紫法（BCP）测血清白蛋白：BCP溶于PH5.2的醋酸缓冲液中，呈黄色。
当它与白蛋白结合后转变为绿色的符合物，在波长603出有最大吸收峰。
★650nm：1. 磷钨酸法测黏蛋白：以0.6mol/L过氯酸沉淀血清中蛋白质时，黏蛋白不被沉淀，仍存留在滤液中，再加磷钨酸使黏蛋白沉淀，然后以酚试剂测定沉淀物中蛋白质的含量。
2. 米吐尔直接显色法测血清无机磷：利用无机磷在酸性溶液中与钼酸铵反应生成磷钼酸铵复合物，用还原剂对甲氨基酚硫酸盐（米吐尔）还原生成钼蓝。
在试剂中加入吐温－80以抑制蛋白质的干扰。
★604nm：1. 邻苯三酚红钼络合显色法测脑脊液总蛋白：邻苯三酚红与钼酸络合形成红色复合物（吸收峰475nm）。
该复合物在酸性条件下与蛋白质形成复合体，其吸收峰移至604nm。
用比色法求蛋白质含量。
★530nm：1. 比浊法测脑脊液蛋白：脑脊液中蛋白质与磺基水杨酸－硫酸钠试剂作用产生沉淀，所形成的浊度在530nm处进行吸光度测定，与同样处理的标准液比较测得蛋白含量。
★415nm：1.亲和层析法测HbA1c：用于分离糖化与非糖化Hb的亲和层析凝胶柱，是交联间－氨基苯硼酸的琼脂糖珠。
硼酸与结合在Hb分子上葡萄糖的顺位二醇基反应，形成可逆的五环化合物，致使样品中的糖化Hb选择性地结合在柱上，而非糖化Hb则被洗脱。
然后用山梨醇解离五环化合物以洗脱糖化Hb，在415nm分别测定解析液的吸光度，计算糖化Hb的百分率。
★550nm：1. 糖化血清蛋白测定：血清葡萄糖能与白蛋白及其他血清蛋白分子N末端的氨基发生非酶促糖化反应，形成高分子酮胺结构。
此酮胺结构能在碱性环境中与硝基四氮唑蓝（NBT）发生还原反应，生成甲？，以1－脱氧－1－吗啉果糖（DMF）为标准参照物，在550nm处进行比色。
★340nm：1. 血清前白蛋白测定：血清中的PA与抗PA抗体在液相中反应生成抗原抗体复合物，使反应液呈现浊度。
当一定量抗体存在时，浊度与血清中PA的含量呈正比，利用340nm处的散射比浊或投射比浊技术，与同样处理的PA标准比较，求得样品种PA含量。
2. 尿微量白蛋白测定：尿液中的白蛋白与抗人白蛋白特异性抗体在缓冲液中反应生成抗原－抗体复合物，产生浊度，与尿中白蛋白浓度呈正比，利用透射比浊法测定340nm处吸光度，与同样处理的标准品制备的标准曲线比较，求得尿液中的白蛋白浓度。
3. 己糖激酶法测血清葡萄糖：在己糖激酶（HK）催化下，Glu和ATP发生磷酸化反应，生成葡萄糖－6－磷酸（G-6-P）与ADP。
前者在葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G－6－PD）催化下脱氢，生成6－磷酸葡萄糖醛酸（6－PG），同时使NADP 还原成NADPH。
反应式如下：葡萄糖+ATP —HK—> G6P+ ADPG6P + NADP —G6PD—> 6PG + NADPH + H+NADPH的生成速率与葡萄糖浓度呈正比。
NADPH在波长340nm有吸收峰，检测吸光度升高速率，计算血清葡萄糖浓度。
4. 葡萄糖脱氢酶法测血清葡萄糖：葡萄糖脱氢酶（GDH）催化葡萄糖脱氢，氧化生成葡萄糖酸（D－葡萄糖酸－&－内酯）。
B－D－葡萄糖+NAD+—GDH—>D－葡萄糖酸内酯+NADH向反应液中加入变旋酶可缩短反应达平衡时间，反应过程中NADH生成量与葡萄糖浓度成正比关系。
5. 血浆乳酸测定：在NAD存在下，乳酸脱氢酶催化乳酸氧化成丙酮酸，同时生成NADH：L－乳酸+ NAD+ —LDH—> 丙酮酸+ NADH + H+在PH9.8时，平衡偏向乳酸氧化成丙酮酸。
加入肼或氨基脲与丙酮酸生成复合物，使丙酮酸不断从反应体系中移去，进一步促进反应向右移动，从而驱动反应的完成。
分光光度计波长340nm，监测吸光度的升高速率，计算乳酸含量。
6. 全血乳酸测定：在NAD+存在下，LDH催化乳酸，氧化成丙酮酸。
加入硫酸肼捕获产物丙酮酸，并促进反应完成。
反应完成后生成的NADH与乳酸为等摩尔关系，在340nm下测定NADH的生成量，计算乳酸的含量。
7. 血浆丙酮酸测定：乳酸脱氢酶催化丙酮酸还原成乳酸，反应如下。
丙酮酸+ NADH + H+—LDH—> L－乳酸+ NAD+分光光度计波长340nm，监测NADH吸光度下降速率，计算样品中丙酮酸浓度。
本法适用于各种任选式自动分析仪。
8. 全血丙酮酸测定：原理同血浆丙酮酸测定，PH7.5条件下利于上述反应（生成乳酸方向）9. 血清（B－羟丁酸）B－HB测定：在有NAD存在时，B－羟丁酸在B－羟丁酸脱氢酶（B－HBDH）催化下，生成乙酰乙酸（AcAc）和NADH。
在波长340nm 处，监测反应中吸光度的上升速率，可以计算血清中B－羟丁酸的浓度。
B－HB + NAD —B-HBDH—> AcAc + NADH + H+10. 钾的酶法测定：磷酸烯醇丙酮酸（PEP）与二磷酸腺苷（ADP）在钾依赖性丙酮酸激酶（PK）催化下，生成丙酮酸和三磷酸腺苷（ATP）。
再在乳酸脱氢酶催化下，所生成的丙酮酸和NADH反应，生成乳酸和NAD。
反应中NADH的消耗量与样品种钾离子浓度呈正比。
因此，在340nm处监测吸光度下降速率，可以计算钾离子含量。
反应式如下：PEP + ADP —K+, PK—> 丙酮酸+ ATP丙酮酸+ NADH + H+ —LDH—> 乳酸+ NAD+11. 酶法测定血浆（血清）碳酸氢根及总二氧化碳：血浆（清）中的碳酸氢根在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）催化下和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）反应，生成草酰乙酸和磷酸；草酰乙酸在苹果酸脱氢酶（MDH）催化下，生成苹果酸，同时NADH被氧化成NAD+。
在分光光度计340nm处，吸光度下降速率与样品中HCO3-含量成正比。
反应式如下。
磷酸烯醇式丙酮酸+ HCO3- —PEPC—> 草酰乙酸+ 磷酸草酰乙酸+ NADH + H+ —MDH—> 苹果酸+ NAD+12.紫外分光光度法测血清无机磷：血清中无机磷在酸性溶液中与钼酸铵反应生成的磷钼酸铵复合物，直接在340nm或325nm波长处测定吸光度。
13. 速率法测定血清ALT：在ALT速率法测定中，酶偶联反应式为：L-丙氨酸+a-酮戊二酸—ALT—> 丙酮酸+L-谷氨酸丙酮酸+NADH+H+—LDH—> L-乳酸+NAD+上述偶联反应中，NADH的氧化速率与标本中酶活性成正比，可在340nm波长处检测吸光度下降速率（-△A/min），计算出ALT的活力单位。
★600nm：1. 染料结合法测尿微量白蛋白：将尿标本实现用Sephadex G-50凝胶过滤，除去尿中色素及其他干扰成分。
将流出物加BPB染料，使之与白蛋白结合显色，经与同样显色的白蛋白标准液比较，可求得尿中白蛋白含量。
2. 甲基麝香草酚兰比色法测血清镁：血清中镁、钙离子在碱性溶液中能与甲基麝香草酚兰染料结合，生成蓝紫色的复合物，加入EGTA（乙二醇双-N,N,N,N-四乙酸，简称EGTA）可掩盖钙离子的干扰。
★505nm：1. 葡萄糖氧化酶法测血清葡萄糖：葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸（D－葡萄糖酸&内酯），并产生过氧化氢：Glu + 2H2O + O2 —GOD—> 葡萄糖酸+ 2H2O2在色原性氧受体（如联大茴香胺、4－氨基安替比林偶氮酚）的存在下，过氧化物酶催化过氧化氢，氧化色原物质，生成有色化合物。
于505nm处比色即可测的葡萄糖浓度。
★405nm：1. 钠的酶法测定：邻硝基酚-B-D-半乳糖苷（ONPG）在钠依赖性B-半乳糖苷酶催化下生成邻－硝基酚和半乳糖。
邻－硝基酚的生成量和样品中钠离子浓度呈正比。
邻－硝基酚在碱性环境中呈黄色，可在405nm波长处监测吸光度的升高速度，计算钠的浓度。
★460nm：1. 硫氰酸汞比色法测血清氯化物：标本中的氯离子与硫氰酸汞反应，生成极难解离的氯化汞，并释放出相应当量的硫氰酸离子。
后者与试剂中铁离子结合生成色泽很深的橙红色硫氰酸铁，吸收峰在460nm，色泽强度与氯化物的含量成正比。
Hg（SCN）2 2Cl - ——> HgCl2 + 2SCN-3CN- + Fe3+ ——> Fe（SCN）3 （橙红色）★610nm甲基麝香草酚兰比色法测血清总钙：血清中钙离子在碱性溶液中与甲基麝香草酚兰结合，声称蓝色的络合物。
加入适量的8-羟基喹啉，可消除镁离子对测定的干扰，与同样处理的钙标准液进行比较，以求得血清总钙的含量。
★575nm邻－甲酚酞络合酮比色法测血清总钙：邻－甲酚络合酮是金属络合指示剂，同时也是酸碱指示剂，在碱性溶液中与钙及镁螯合，声称紫红色螯合物。
作钙测定时，在试剂中加入8-羟基喹啉以消除标本中镁离子的干扰。
★640nm硫酸亚铁磷钼蓝比色法：用三氯醋酸沉淀蛋白，向无蛋白滤液中加入钼酸铵试剂，与无机磷结合生成磷钼酸铵，在以硫酸亚铁为还原剂，还原成蓝色化合物（钼蓝），进行比色测定。
★510nmCalmagite染料比色法测定血清镁：血清中镁在碱性条件下与Calmagite染料生成紫红色络合物，颜色的深浅与镁的浓度成正比。
溶液中的EGTA可消除钙的干扰，使用表面活性剂可使蛋白胶体稳定，不必去除血清中蛋白质而直接测定镁。