药典无菌检查方法验证及操作要点
无菌检验方法验证
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无菌检验阳性结果调查
实验室调查：一个合适的调查程序和记录是必要的
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无菌检验阳性结果调查
若产品不合格，必须通过该批生产过程回顾找出污染 原因和污染源 –人 – 物料 – 环境 – 设备 – 方法和工艺
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方法二：用实验确定是否具有抑菌性的方法 在规定量的供试液中加入实验用微生物10~100个，
如微生物生长良好，即说明供试品对该种微生物无抑 菌活性。如已用药典规定的各试验菌试验，结果均能 生长良好，说明供试品无抑菌性，可用常规方法检验 之。将这些试验记录在案——就是证明该供试品无抑 菌性的验证试验部分；如加入的微生物不生长或生长 缓慢，说明供试品有抑菌性，将这些试验记录在案— —就是证明该供试品有抑菌性的验证试验部分；如加 入的微生物中有某一种菌最不能生长或生长最缓慢， 这一种菌就是该样品的敏感菌。
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验证试验和对验证结果技术评价的判断为：如平行3 次的试验中，各管微生物均生长良好，说明供试品 已消除了抑菌活性。可以确定按该方法进行该品种 的无菌检查；如有供试品管的微生物生长微弱、缓 慢或不生长，说明供试品仍有抑菌活性，应考虑进 一步增加冲洗量或中和剂的用量以消除抑菌活性， 并重新验证，直至验证证明已充分消除或有效降低 抑菌活性。
条件 无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净 度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行， 其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污 染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物 的检出。
无菌检验方法验证
无菌检验方法验证无菌检查方法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法！至于无菌检查具体有哪些验证方法呢？下面就随店铺一起来了解下吧！无菌检验方法验证无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。
前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。
如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。
再验证，指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。
通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。
前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。
供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点，尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。
(一)具体的验证方法如下：1. 菌种的选择无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌 [CMCC(B)64 941]代表厌氧菌、大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌 [CMCC(F)98 003]代表霉菌。
2. 菌液的制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35 ℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23~28℃培养24~48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
中国药典(2015年版)无菌检查法
中国药典(2015年版)无菌检查法是用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
如果供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。
只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。
薄膜过滤法一般应采用封闭式薄膜过滤器，无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45微米，直径约为50mm。
根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质，使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。
无菌检查法-2022版中国药典-电子版
无菌检查法-2022版中国药典-电子版无菌检查应在环境洁净度B级背景下的局部A级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度确认。
隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
日常检验还需对试验环境进行监控。
无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
培养基硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需气菌培养；胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。
培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在2〜25°C、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。
1.硫乙醇酸盐流体培养基酪胨（胰酶水解）15.0g酵母浸出粉5.0g葡萄糖5.0g氯化钠2.5gL-胱氨酸0.5g新配制的0.1%刃天青溶液1.0ml硫乙醇酸钠0.5g琼脂0.75g（或硫乙醇酸）（0.3ml）纯化水1000ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培2养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。
灭菌在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100°C水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。
除另有规定外，硫乙醇酸盐流体培养基置30〜35C培养。
2.胰酪大豆胨液体培养基胰酪胨17.0g氯化钠5.0g大豆木瓜蛋白酶消化物3.0g磷酸氢二钾2.5g葡萄糖（一水合/无水）2.5g（2.3g）纯化水1000mL除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，调节pH值使灭菌后在25C的pH值为7.3土0.2，加入葡萄糖，分装，灭菌。
无菌检查方法验证
无菌检查方法验证：取本品，分别加灭菌注射用水 1ml 溶解，采用薄膜过滤法依法检查(中国药典 2022 年版二部附录Ⅺ H )，应符合规定。
菌液制备： 10 倍稀释法培养基 营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基硫乙醇酸盐培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂斜面 培养基菌悬液制备计数结果菌种 代数 稀释级 菌落数(cfu/ml )枯草芽孢杆菌 4 10-6 61金黄色葡萄球菌 4 10-7 89大肠埃希菌 4 10-6 78生孢梭菌 4 10-6 67白色念珠菌 4 10-7 83黑曲霉菌 4 10-4 401、供试品处理将供试品去掉铝塑盖，外表面用75%酒精全面消毒，然后向每支样品中注 入 1.0ml0.1%的蛋白胨灭菌溶液，备用。
2、检查阳性对照： 将等量的试验菌直接加入到液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液 体培养基管中，在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在 30-35℃下培菌种枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 大肠埃希菌 CMCC(B)44102生孢梭菌 CMCC(B)64941白色念珠菌 CMCC(F)98001黑曲霉菌 CMCC(F)98003菌悬液制备用 0.9% 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌少于 100cfu (菌落行程单 位)的菌悬液加入 5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将 孢子洗脱，再同上制成每 ml 含菌 小于 100cfu 的菌悬液养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
阴性对照：将灭菌的液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液体培养基管直接放在相应的温度下培养。
液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。
观察记录。
样品 (薄膜过滤法)：每种实验菌取10 支处理好的供试品溶液，将溶液合并后加入制备好的菌悬液1ml，用0.1%的蛋白胨灭菌溶液稀释至100ml，按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，将其分为3 等份，分别置于含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作为阳性对照用。
中国药典检验操作规程
• （1）干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。
• （2）大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不 能过挤。
• （1）检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。
• （2）检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察 是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。
耐胆盐革兰阴性菌 紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基
培养基或试剂等,应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态,未达到者应废弃。
1第一天：准备用具、培养基、稀释剂，灭菌
需氧菌总数
103cfu（≤2000） 102cfu（≤200）
霉菌和酵母菌总数 沙氏葡萄糖琼脂培养基
霉菌和酵母菌总数 5×100cfu（≤1000） 100 cfu（≤200）
（3）物品取出,
控制菌 • 随即胰检酪大查豆包胨装液体的培完养整基性,若有破坏或棉塞脱掉、包装有明显的水浸者,不可作为无菌物
若木糖赖氨酸品脱使氧胆用酸。盐培琼脂养培基养或基平试板剂上等有疑,应似检菌落查生是长否，且符三合糖达铁琼到脂灭培菌养基后的的斜色面为泽红或色状、底态层,未为黄达色到，者或斜应面废黄弃色、底层黄
点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
（2）装培养基的三角瓶，内容物不应超过总体积的2/3（例如500mL的三角瓶最好装300～350mL培养基，以防再次加热融化时爆沸）
。
若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以上。
大肠埃希菌
不得检出
色或黑色，应。进取一步出进的行物适宜品的掉鉴落定试在验地，或确证误是放否不为沙洁门处菌,。或沾有水液,均视为受到污染,不可作为无菌物品 取（大出2肠）预 埃大培希型养氏高后菌使属压的蒸用 合控气胰制。 格锅酪菌取 物：大供放出 品豆试置胨液的,灭应液，合菌标体置物格培于有品养工灭分灭基作菌别菌台包物上日扎；品期好,，及应直有存接效放放入期于消限贮毒。藏筒内室，或物防品之尘间柜不内能过,严挤。禁与未灭菌物品混放。凡
中国药典2020无菌检查法
中国药典2020无菌检查法《中国药典2020》是中国药典委员会颁布的一部关于药物质量和药品标准的权威性指南。
其中，无菌检查法是一项重要的内容。
本文将从无菌检查法的定义、目的、步骤、设备和评价标准等方面进行详细阐述，以使读者对该法有更深入的了解。
一、无菌检查法的定义无菌检查法是指对药品或其他生物制品是否存在微生物污染的一种检查方法。
通过对样品进行无菌条件下的培养和观察，判断样品中是否有病原微生物或其他有害的微生物存在。
二、无菌检查法的目的无菌检查法的目的是确保药品在生产和使用过程中的无菌状态，保证药品的质量和安全性。
通过检查药品是否受到任何微生物污染，能有效预防细菌感染、交叉感染和其他相关疾病的发生。
三、无菌检查法的步骤1.准备工作：无菌检查需要准备一批无菌培养基、试管、平板和其他无菌实验器具。
2.取样：按照规定的取样方法，从待检测样品中取相应的样品量。
3.培养：将样品转入无菌培养基中，放入培养箱或孵化器中进行培养。
4.观察：培养一定时间后，对培养基进行观察。
根据培养基上是否有生长的微生物形态，判断样品是否存在微生物污染。
5.结果评价：根据无菌检查法所规定的评价标准，对观察结果进行判断，并作出相应的结论。
四、无菌检查法所需设备1.培养箱或孵化器：用于提供适宜的培养温度和湿度条件，以促进微生物的生长。
2.无菌工作台：提供无菌的工作环境，防止外界微生物的污染。
3.试管、平板、培养基：用于收集样品、培养微生物和观察微生物生长情况。
4.显微镜：用于观察培养基上的微生物形态。
五、无菌检查法的评价标准无菌检查法根据不同药品的要求，采用不同的评价标准来判断检查结果。
主要有以下几个方面：1.无菌：表示样品中不含有任何生长的微生物。
2.无菌状态：表示无菌状态有可能受到微生物污染，但在检查时没有检出任何微生物生长。
3.微生物计数：表示检查结果中存在一定数量的微生物，但其数量在可接受范围内，不会对药品的质量和安全产生影响。
中国药典2020无菌检查法
中国药典2020无菌检查法【原创版】目录1.概述2.检查法内容3.实施方法4.注意事项5.结论正文1.概述《中国药典 2020》是我国药品行业的权威标准，对药品的研发、生产、质量控制以及药品的审批上市等环节具有重要的指导意义。
其中，无菌检查法是药品质量控制中至关重要的一环，它关乎到药品的安全性和有效性。
本文将对《中国药典 2020》中的无菌检查法进行详细解读。
2.检查法内容无菌检查法主要包括以下内容：（1）检查原理：通过检测样品中微生物的数量，判断样品是否符合无菌要求。
（2）检查方法：包括直接涂片法、薄膜过滤法等。
（3）检查标准：根据药品的类型和用途，规定了不同的无菌标准。
例如，注射剂要求无菌，而口服制剂则要求微生物限度符合标准。
3.实施方法在实施无菌检查时，需要遵循以下步骤：（1）样品的采集和处理：采集样品，进行适当的处理，如灭菌、稀释等，以保证检查结果的准确性。
（2）检查操作：根据选定的检查方法，进行无菌检查。
例如，直接涂片法是将样品涂抹在培养基上，观察培养基上是否有微生物生长；薄膜过滤法是将样品通过薄膜过滤器，然后将滤膜在培养基上进行培养，观察培养基上是否有微生物生长。
（3）结果判定：根据检查结果，判断样品是否符合无菌要求。
4.注意事项在进行无菌检查时，需要注意以下几点：（1）采样：采样应具有代表性，以保证检查结果的准确性。
（2）器具：检查过程中使用的器具应严格灭菌，防止外源性微生物的污染。
（3）环境：检查环境应符合无菌要求，避免环境中的微生物对检查结果的影响。
（4）结果判定：结果判定应严格按照标准进行，避免主观判断导致的误差。
5.结论无菌检查法是药品质量控制中至关重要的一环，对保证药品的安全性和有效性具有重要意义。
《中国药典 2020》对无菌检查法进行了详细的规定，为药品企业和研究机构提供了明确的指导。
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1.1 定义
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药
品、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方
法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明
了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
1.2 实验环境条件要求 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
无菌检查应在环境洁净度10 000级下的 局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔 离系统中进行，其全过程必须严格遵守无 菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、 工作台面及环境应定期按《医药工业洁净 室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方 法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔 离系统按相关的要求进行验证，其内部环 境的洁净度须符合无菌检查的要求。
2.3 培养温度 硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。
改良马丁培养基置23～28℃培养。 2.4 培养基的适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改 良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查 及灵敏度检查的要求。
2.4.1无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支(瓶)，培养14 天，应无菌生长。
2. 培养基
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2.1 培养基的灭菌 配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
2.2 培养基的保存 制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的
环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三 周内使用；若保存于密闭容器中一般可在一年内 使用。
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4.1 菌种
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1）金黄色葡萄球菌
(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26 003]
2）铜绿假单胞菌
(Pseudomonasaerugznosa)[CMCC(B)10 104]
3）枯草芽孢杆菌
(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63 501]
4）生孢梭菌
(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64 941]
5）白色念珠菌
(Candidaalbicans)[CMCC(F)98 001]
6）黑曲霉
(Aspergillusniger)[CMCC(F)98 003]
4.2 菌液制备
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制备的菌液，一般当日使用。
4. 方法验证试验
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目的: 1)证明所采用的方法适合于该药品的无 菌检查
2) 确认供试品在该实验条件下无抑菌 活性或其抑菌活性可以忽略不计。
3) 确保在实际检验条件下，该供试品 的无菌检查法的准确性、有效性和重现性。
验证时，按“供试品的无菌检查”的规定 及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进 行验证。
各试验菌及相应的培养基逐一进行验证。
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加
供
试
金 葡
铜 绿
白 念
品
枯
生
黑
草
孢
曲
霉
对
照
金
铜
白
葡
绿
念
管
枯
生
黑
草
孢
曲
霉
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4.4 直接接种法
取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙 醇酸盐流体培养基8管，分别接人小于 l00cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、 枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；
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金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、 枯草芽孢 杆菌、生孢梭菌接种至硫乙醇酸盐流体培养 基中30～35℃培养3天；
白色念珠菌、黑曲霉接种至改良马丁培养基 中23～28℃培养5天。
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3. 稀释液、冲洗液及其制备方法 0.1％蛋白胨水溶液 pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液
如含供试品的任一容器中微生物生长微 弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在 该检验条件下有抑菌作用，可采用1)增加冲 洗量，或增加培养基的用量，2)使用中和剂， 或更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌 作用，并重新进行方法验证。
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5. 供试品的无菌检查 5.1 无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种 法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤 法。进行供试品无菌检查时，所采用的检验 方法和检验条件应与验证的方法相同
取符合直接接种法培养基用量要求的改良 马丁培养基4管，分别接入小于l00cfu的白 色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接人规定 量的供试品，另1管作为对照，按规定的温度 培养3～5天。
4.5 结果判断 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
与对照管比较，如含供试品各容器中的 试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在 该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以 忽略不计，照此检查法和检验条件进行供试 品的无菌检查。
黑曲霉
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改良马丁琼脂斜面培养基上， 23～28℃培养5～7天，
加入3～5ml 0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗
脱
吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌
棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌
试管内
用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含孢
子数小于l00cfu的孢子悬液。
菌种
菌株传代次数 培养基接种结判断资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
2.4.2 灵敏度检查
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、 白色念珠菌、黑曲霉
不得超过5代
每种菌接种至2管相应的培养基， 另取一支不接种作空白对照，按 规定温度时间培养。
空白对照管应无菌生长，每种 菌接种后的2管培养基管均生长 良好，该培养基的灵敏度检查符 合规定。
4.3 薄膜过滤法
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲
洗，在最后一次的冲洗液中加入试验菌（小于
100cfu），过滤。取出滤膜接种至相应的培 养基中，或将培养基加至滤筒内。
另取一滤桶，不过滤供试品，其它操作同 上，作为对照.
将含培养基的容器按规定温度培养3～5天。
金黄色葡萄球菌（铜绿假单胞菌、枯草芽 孢杆菌) 营养肉汤（或营养琼脂培养基）
生孢梭菌 硫乙醇酸盐流体培养基
30～35℃培养18～24小时；
白色念珠菌 改良马丁培养基（或改良 马丁琼脂培养基）
23～28℃培养24～48小时
上述培养物 用0.9％无菌氯化钠溶液制成每 1ml含菌数小于l00cfu(菌落形成单位)的菌悬 液。