各突变检测方法比较
基因突变和基因重排的检测方法
基因突变和基因重排的检测方法基因突变和基因重排是影响生命过程的两个关键机制。
突变是指DNA序列发生了错误，而重排则是指基因组中的一段DNA序列被移动或复制到另一个位置。
这些变化会导致有害的影响，如导致癌症、自身免疫性疾病和遗传病等。
因此，检测这些变化变得极其重要，以便及早发现并防止这些疾病的发生。
在过去几十年里，科学家已经开发出了多种基因突变和基因重排的检测方法，其中一些方法在诊断遗传性疾病和癌症等方面证明了非常有效。
下面是一些常见的基因突变和基因重排检测方法。
1. Sanger测序Sanger测序是第一种可靠的DNA测序技术，通过分析DNA序列来检测突变和重排。
将DNA反复复制并添加特定的荧光标记，然后测量不同荧光信号的强度来确定DNA序列。
这种方法可以检测单个基因的突变以及一些基因的重排，并已广泛用于诊断遗传性疾病和癌症等。
2. PCRPCR是另一种常见的基因检测方法，它使用聚合酶链反应技术来扩增DNA片段。
通过扩增目标DNA片段，可以检测基因突变和重排。
PCR可以用于从血液、唾液和口腔黏膜等样本中提取DNA，并且已成为诊断基因突变和重排的主要工具。
3. FISHFISH是一种高度特异性的细胞遗传学方法，可用于检测基因重排。
通过将荧光标记的DNA探针与细胞的染色体配对，科学家可以识别染色体上的重排。
这种方法已被广泛用于癌症分析和遗传诊断等领域。
4. CGHCGH是一种用于检测基因重排的分子遗传学技术。
它可以检测整个基因组上的DNA重排，而不是单个基因。
CGH技术基于比较样品DNA和控制DNA之间的差异，以检测DNA重排的部位和类型。
这种方法已被广泛用于研究人类基因组的变异，并在癌症和遗传性疾病诊断中得到应用。
5. NGSNGS是一种DNA测序方法，可以快速、准确地测定DNA序列。
它通过将样品DNA纳入微型反应器中，然后生成数以百万计的DNA片段。
NGS技术可以同时检测多个基因的突变和重排，并已广泛用于快速检测基因变异。
四种基因检测技术比较
技术平台
双脱氧测序法 dideoxy (sanger) sequencing （属于直接测序法的一种） （如ABI测序仪）
技术特点
价格：便宜 检测灵敏度：25% 直接测序法是基因突变检测的金标准 检测全面，任何一种突变类型都可检测出来 是定性检测方法，即只能检测出有没有发生突变 有大量文献支持 价格：适中 检测灵敏度：5%（选择合适的检测灵敏度非常重要！太高或太低都不合适！） 直接测序法是基因突变检测的金标准 检测全面，任何一种突变类型都可检测出来，如可检测K-ras基因18种突变类型 是定量检测方法，即可检测出野生型与突变型各自的百分比 有大量文献支持 价格：很贵 检测灵敏度：1%（灵敏度太高，实验过程稍有些许污染就会出现假阳性结果） 定量PCR法不是基因突变检测的金标准 检测不全面，只检测几种突变类型，如只检测K-ras基因7种突变类型 不是定量检测方法，无法检测出野生型与突变型各自的比例 有少量文献支持 价格：很贵 检测灵敏度：0.1%（灵敏度太高，不可避免会出现很多假阳性结果） 液相芯片法不是基因突变检测的金标准 检测不全面，只检测几种突变类型，如只检测K-ras基因7种突变类型 不是定量检测方法，无法检测出野生型与突变型各自的比例 有少量文献支持
）有限公司是国内最早开展K-ras等肿瘤基因突变检测服务的公司，从2008年8月开始用焦磷酸测序法检测 天为止已检测超过10000多例K-ras样本了，GFR样本也已超过5000例。
焦磷酸测序法 Pyrosequencing （也属于直接测序法的一种） （如基因科技）
基因突变检测方法
基因突变检测方法
基因突变检测主要有三种检测方法，即FISH检测、Ventana-D5F3 IHC检测和NGS检测。
基因突变检测方法的特点主要体现在以下几方面：
1、FISH：也称为荧光原位杂交技术，其检测的特异性和敏感性都比较高，也是ALK融合基因检测的金标准，因为FISH检测的技术要求比较高，所以也存在有自身问题，如在检测过程中，如果标本固定时间较长、烤片温度较高、变异性温度差异、蛋白消化不当等，就会引起荧光信号的减弱，或者没有信号，容易出现基因突变的假阴性或假阳性；
2、IHC：是一种免疫组化的检测方法，此方法操作比较简单、检测比较快速、经济成本较低，灵敏度较高。
因为对标本需求量较低、IHC检测高灵敏度、高特异性等优点，ALK检测共识中已经推荐优先应用；
3、NGS：也称为二代测序、高通量测序技术，这项检测在ALK基因检测中的地位越来越高，NGS检测能区分ALK突变的所有亚型以及ALK基因本身可能存在的点突变，在临床上可以指导医生后续用药，但是检测费用较贵，临床上主要推荐用于ALK靶向药物耐药的患者检测。
基因突变的检测方法
基因突变的检测方法基因突变是指细胞中一些基因序列发生改变，影响了基因的正常功能。
这些突变可以是单个碱基的改变、插入或删除，也可以是基因内或基因间区域的结构改变。
基因突变可能是遗传的，也可能是后天的，是导致许多疾病的重要原因之一、因此，对基因突变进行准确的检测和分析对于预防、诊断和治疗疾病具有重要意义。
目前，常见的基因突变的检测方法主要有以下几种：1.直接测序法：直接测序法是一种最常用、最可靠的基因突变检测方法。
通过DNA测序技术，可以准确地检测出基因序列的每个碱基，从而发现可能存在的突变。
这种方法可以检测到单个碱基的点突变、小片段的插入或缺失等突变。
2.聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种常用于扩增基因片段的方法，可以将DNA样本中的目标基因片段扩增到足够的数量，以便进行突变的分析。
PCR可以用于检测点突变、大片段缺失和插入等突变。
此外，PCR还可以与其他技术（例如限制性酶切、序列特异性引物放大、测序等）结合使用，增加突变检测的灵敏性和准确性。
3.变性梅毒凝胶电泳（DGGE）：DGGE是一种分析DNA序列异质性的方法。
通过在电泳过程中使用梯度浓度的变性剂，可以将DNA样本中具有不同序列的片段分离开来。
通过比较样品与对照的DGGE图谱，可以检测到突变的存在和类型。
4.基因芯片技术：基因芯片技术是一种高通量基因突变检测方法。
基因芯片上携带了大量不同的探针，可以同时检测一系列基因的突变状态。
这种方法适用于筛查大规模的基因突变。
5.网络测序技术：网络测序技术是一种新兴的基因突变检测方法。
通过将DNA样本测序后上传至云端服务器，利用高效的计算机算法和庞大的数据库，可以分析和鉴定样本中的突变。
这种方法可以快速准确地检测大规模基因突变，适用于临床中的个性化医疗。
虽然以上列举了几种常见的基因突变检测方法，但需要注意的是，每种方法都有其优缺点，并且适用于不同类型的突变鉴定。
在实际应用中，常常需要结合多种方法进行综合分析和鉴定，以提高突变检测的准确性和可靠性。
基因组突变的检测方法
基因组突变的检测方法随着生物技术和医学研究的迅速发展，基因组突变相关的研究越来越受到关注，因为基因组突变在某些疾病的发生中起着关键作用。
然而，检测基因组突变的方法存在困难，因为基因组大小较大，所含基因比较复杂。
在本文中，我们将探讨几种基因组突变的检测方法。
一、PCR扩增法PCR扩增法是目前最常用的基因组突变检测方法之一。
PCR扩增利用DNA聚合酶复制目标DNA序列，从而扩增出足够数量的生成物进行检测。
PCR扩增法有高灵敏度，可检测极小浓度的突变。
但是，由于PCR扩增法基于模板DNA，这种方法不适合检测新突变或大规模基因组突变。
二、Southern blotting法Southern blotting法利用电泳将DNA分离到一个凝胶中，然后将DNA传输到一个固体支持的膜中。
随后，在膜上通过亲体结合，将DNA变成可以检测的形式。
Southern blotting法通常用来检测从基因组DNA中特别选出的单一基因的缺陷。
三、序列特异性引物扩增法序列特异性引物扩增法是一种基于PCR扩增法的方法。
不同的是，序列特异性引物扩增法使用特异性引物对目标突变进行扩增。
这种方法使用引物的特异性将其绑定到目标DNA的位置，再进行扩增检测。
这种方法可检测最常见的核苷酸突变和小片段的缺失和插入。
四、二代测序法二代测序法是一种先进的技术，可用于检测某个个体的全基因组、外显子组等。
有了二代测序技术，我们能够对个体的突变、多态性和复杂的基因组变异进行更彻底的检测，从而检测出更多的突变位点。
五、杂合性突变分析法杂合性突变分析法是一种特殊的PCR扩增技术，可用于检测无需基于模板DNA的新突变。
这种方法利用不同标签的突变位点DNA扩增，从而识别新突变。
杂合性突变分析法对杂合性突变和新位点突变的检测十分有效，但需要临床验证。
总结选择何种检测方法应取决于所需要检测的突变类型以及检测平台的可用性和成本。
我们对五种基因组突变的检测方法进行了介绍，这些方法都有一定的优缺点。
基因突变的检测
基因突变的检测基因突变是指基因序列发生变化的现象，它可以导致生物体在遗传信息传递过程中产生异常，进而影响其生长、发育和健康状况。
随着科技的进步，基因突变的检测方法也不断发展，为人类健康提供了更准确、可靠的诊断手段。
一、基因突变的检测方法及原理1. 水平梯度凝胶电泳法水平梯度凝胶电泳法是一种常用的基因突变检测技术。
它基于突变基因片段的长度，利用凝胶电泳的原理，通过电泳的迁移速度来判断基因是否发生突变。
2. 荧光定量PCR技术荧光定量PCR技术结合了PCR扩增和荧光探针技术，可用于检测基因的突变。
该方法通过特定的引物和探针，能够实现对特定基因片段的扩增和检测，并结合荧光信号的强度来判断基因是否突变。
3. Sanger测序技术Sanger测序技术是一种传统的基因测序方法。
通过引物与待测样品中的DNA片段结合，使DNA合成反应开始，经过一系列处理，最终可以获得DNA序列。
这种方法可用于检测基因序列是否存在突变。
4. 高通量测序技术高通量测序技术是近年来发展起来的一种先进的基因检测方法。
该技术基于平台设备，能够实现大规模的DNA测序，从而快速、高效地检测基因序列中的突变。
二、基因突变检测的应用领域1. 遗传性疾病的诊断与预防许多遗传性疾病与基因突变密切相关。
通过对患者基因进行检测，可以准确判断疾病是否与基因突变有关，并为患者提供个体化的治疗方案和预防措施。
2. 肿瘤基因突变的筛查肿瘤的发生与基因突变密切相关，因此对肿瘤基因突变的筛查对于早期诊断和治疗是非常重要的。
基因突变检测技术的快速发展，为肿瘤的防治提供了有力的支持。
3. 个体化药物治疗在临床应用中，个体化药物治疗已经成为一种趋势。
通过检测患者的基因突变，可以了解对不同药物的代谢情况，从而为患者量身定制药物治疗方案，提高治疗效果，减少副作用。
三、基因突变检测的挑战与展望1. 数据分析与解读基因突变检测过程产生的大量数据需要进行准确的分析和解读，这对于研究人员和临床医生具有挑战性。
检测基因突变的方法
检测基因突变的方法检测基因突变是遗传学和临床医学中的重要问题，因为基因突变是导致许多疾病的原因，包括癌症和遗传性疾病。
随着技术的发展，人们对基因突变的检测方法也日益关注。
本文将介绍一些常见的基因突变检测方法，包括PCR、测序、基因芯片等，以及它们的原理和应用。
PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的基因检测方法。
PCR可以扩增特定DNA片段，从而使得低浓度的DNA可以被检测到。
在基因突变的检测中，PCR通常会选择包含突变位点的基因片段作为模板进行扩增，然后通过电泳或其他方法检测扩增产物中的突变。
PCR技术简单易行，对于一些常见的单基因遗传病的检测已经得到了广泛的应用。
测序技术是一种直接检测DNA序列的方法。
Sanger测序是一种经典的测序技术，它通过测定DNA合成反应中的停止点来确定DNA序列。
在基因突变的检测中，可以将扩增得到的基因片段进行Sanger测序，通过比对突变位点的序列与正常序列的差异来确定是否存在突变。
随着高通量测序技术的发展，全基因组测序已经成为了一种常见的基因突变检测方法，它可以同时检测大量的基因，对于研究罕见遗传病和个体化治疗具有重要意义。
除了PCR和测序，基因芯片技术也是一种常见的基因突变检测方法。
基因芯片可以在一块玻璃片或芯片上固定成千上万个已知的DNA探针序列，用于检测样品中特定DNA序列的存在。
在基因突变的检测中，基因芯片可以用来检测数千个基因的突变情况，是一种高通量、高效率的技术。
还有一些新兴的基因突变检测技术，比如下一代测序（NGS）技术和CRISPR-Cas9基因编辑技术。
NGS技术是指一类高通量测序技术，能够在较短的时间内大规模测定DNA序列。
在基因突变的检测中，NGS技术可以识别几乎所有类型的基因突变，包括单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失突变等。
CRISPR-Cas9技术则是一种通过定向编辑基因来修复基因突变的方法，对于一些遗传性疾病的治疗具有潜在的作用。
基因突变的检测是目前遗传学和临床医学的重要研究领域，各种检测方法的发展为基因突变的诊断和治疗提供了有力的支持。
遗传突变的类型与检测方法
遗传突变的类型与检测方法随着生命科学的发展和研究的深入，人们越来越深刻地认识到遗传突变在人类健康中的重要性。
遗传突变指的是基因组序列发生改变所带来的影响，是遗传学研究的基础。
遗传突变有多种类型，它们的检测方法也有所不同。
本文将依次介绍遗传突变的类型和检测方法。
1. 点突变点突变也称作单核苷酸多态性（SNP），是指基因组中单个核苷酸的改变。
这种遗传突变在人类健康研究中占据着非常重要的位置，因为它对某些疾病的易感性有一定的影响。
点突变的检测方法可以使用单晶体和多晶体技术。
单晶体技术通过碎片分成较小的碎片，然后利用克隆技术来扩增片段。
多晶体技术则是在片段发生碎裂后，利用荧光染料和聚合酶链式反应技术进行检测。
2. 插入和缩小插入和缩小突变可导致某个核苷酸的消失或重复。
这种突变是遗传研究中罕见的突变途径。
它也是疾病易感性的重要因素之一。
插入和缩小突变的检测需要使用多种技术，包括聚合酶链式反应、电泳、基因芯片等。
其中，聚合酶链式反应技术是最常用的检测方法。
在此过程中，利用酶切和聚合酶链式反应技术可以有效地检测出这些突变。
3. 倍增倍增是指某个段的某个重复序列在一代之间发生增加。
精确的检测需要评估序列的长度和数量。
因此，倍增突变的检测和诊断非常重要，对基因性疾病的研究和诊断有很好的价值。
倍增突变的检测方法包括聚合酶链式反应、电泳、DNA测序等。
这些方法可以定量地检测出重复序列的长度和数量。
4. 染色体异常染色体异常是指染色体的某个类型和数量发生变化，包括重复、缺失、倒位等。
染色体异常是某些遗传性疾病的主要原因。
检测染色体异常需要使用多种技术，包括染色体钓鱼、荧光原位杂交、靶向药物和克隆等。
总之，遗传突变在人类健康研究中有着重要的作用。
了解遗传突变的类型和检测方法十分重要。
各种突变类型的检测方法和策略可以使医学家、科学家和研究人员更好地理解疾病的发生和发展机制，为制定相应的治疗方案和防止疾病传播提供依据。
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1、RNA酶A切割法（RNase A cleavage）在一定条件下，氨基源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的错配碱基可被RNaseA切割，切割产物可通过变性凝胶电泳分离。
当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，RNaseA在错配处的切割效率很低，甚至不切割，而当错配碱基为嘧啶时，则其切割效率较高。
故如果仅分析被检DNA的一个条链，突变检出率只有30％，如同时分析正义和反义二条链，检出率可达70％。
该法需要制备RNA探针，增加了操作的复杂性，但可用于1-2kb 的大片段进行检测，并能确定突变位点。
于这些优越性，它仍被作为一种经典方法用于对未知突变进行分析。
电泳法（不能确定突变位点，都要通过测序等解决）2、变性梯度凝胶电泳（DGGE）双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。
不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。
DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。
一个特定的DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(meltingdomain, MD)和解链行为(melting behavior) 。
一个几百个碱基对的DNA 片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。
当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区域浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。
当浓度度再升高依次达到各其他解链区域浓度时，这些区域也依次发生解链。
直到变性剂浓度达到最高的解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA 完全解链。
如果不同DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。
在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夹子，一般30-50 个碱基对）可以解决这个问题。
含有GC 夹子的DNA 片段最高的解链区域在GC 夹子这一段序列处，它的解链浓度很高，可以防止DNA 片段在DGGE 胶中完全解链。
当加了GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。
3、PCR-SSCP法单链构象多态性单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)是一种分离核酸的技术，可以分离相同长度但序列不同的核酸（性质类似于DGGE和TGGE，但方法不同）。
实验步骤利用PCR从提取出的DNA中扩增16S rRNA基因。
利用λ-外切核酸酶消化掉一条链（其中一个PCR引物被磷酸化，这条链将被去除）。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
应用：单链构象多态性可用于预筛选克隆文库。
可对其中的某一个条带进行测序，并与数据库中已知序列比对。
原理：单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使是一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构并引起在非变性电泳条件不同的电泳迁移率。
4、杂合双链分析法(HA)由突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一个凸起,在非变性胶中电泳时,会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率,从而使两者被分离开。
该方法原理与单链构象多态性(SSCP)相似,只不过SS-CP分离的是单链,而HA法分离的是双链。
HA法简单迅速,但只适用于200～300pb的片段,且不能确定突变位置,检出率只有80%左右,有人建议将HA法和SSCP法联合使用,可能将检出率提高到接近100%,也有科研工作者建议使用缺失的野生型等位基因来提高该方法的灵敏度。
5、化学切割错配(CCM)化学切割错配是在Maxam-Gilbert测序的基础上发展起来的一项突变检测技术,在DNA∶DNA或DNA∶RNA异源杂合双链核酸分子中,错配的C能被羟胺(hydroxylamine)和哌啶(piperidine)切割,错配的T能被四氧化锇(Osmiumtetroxide)所切割,切割产物跑变性胶电泳即可确定是否存在突变。
只要操作得当,不会发生非特异性切割,如果对正义链和反义链都进行分析,可使检出率达到100%;使用荧光检测系统将会大大增强该方法的灵敏度,从而可检测出十个细胞中的一个突变细胞。
该方法的最大优点是能对长至2kb的片段分析,并能确定突变位置,缺点是步骤多,费时,且需接触有毒的化学物质。
6、碳化二亚胺检测(Carbodiimide,CDI)与CCM法相似,CDI能够对错配的G和T进行修饰,当用标记的引物对CDI修饰过的双链DNA进行DNA合成时,延伸会在修饰过的碱基处终止下来,合成产物跑变性聚丙烯酰胺凝胶电泳即可检测出是否有突变。
该方法的最大优点也是能对1～2kb的片段进行分析,突变检出率达到100%,能确定突变位置,并且CDI是一种没有毒性的物质,有报道曾用该法检测出了7.2kbDNA片段中的一个点突变,但当一个DNA片段中存在多个突变时,该方法就不适用。
7、酶促切割错配(EnzymeMismatchCleavage,EMC)EMC是一种与RNaseA切割相类似的方法。
T4核酸内切酶是一种分解酶(resolvase),能够识别12种错配的碱基并在错配碱基的附近进行切割，酶切产物跑变性胶或中性胶即可检测出是否有突变，电泳产物的检测可用放射自显影，也可用银染。
由于该法能对DNA∶DNA异源杂合分子进行分析，因而省去了体外转录的步骤，其最长检测片段可达到1.5kb，该法的缺点是存在非特异性切割现象，并且对有些错配碱基的识别不是100%，因此在每次检测时都必须设有一个内对照。
8、限制性片断长度多态性（restriction fragment length polymorphism , RFLP)连琐分析技术RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。
RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。
RFLP技术主要包括以下基本步骤：DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。
其检测特点是：具有较高的特异性，可以确定突变的部位及性质，重复性好。
但不足之处是仅适合于多态性的检测：即突变频率大于1%才能被检测到；因此，RFLP分析对于检测突变的早期，尤其是在野生型远多于突变型时其敏感性就显得不足了。
发展：反向限制性位点突变分析（iRSM），进行低突变频率等位基因的检测。
其方法主要用于突变早期的检测，当某一野生型序列发生突变导致原有酶切位点（E1位点）的消失，产生一新的酶切位点（E2位点），称之为E1→E2突变，但突变频率较低常规RFLP无法检测。
此时，用一内切酶(E1)对其进行酶切，这样可选择性地移去大部分的野生型序列（>99%）。
无酶切位点的部分通过PCR扩增（引物被设计在E2位点的一侧），产物用另一内切酶（E2）进行RFLP分析，根据产物中是否存在E2位点即可判断有无突变发生。
由于该方法在RFLP分析之前用另一种内切酶对靶序列进行消化，减少了野生型序列的含量（一般消化率>99%），因而大大提高了突变序列的检出率。
值得注意的是：只要选择适当的限制性酶切位点，此项技术适应于任何基因、突变或生物体。
但是，由于聚合酶的关系，可能在PCR扩增后导致iRSM分析出现假阳性。
这可以通过使用高保真聚合酶进行修正；同时为了提高检出率，iRSM分析可于其它分析技术联合使用或增加目的基因的含量。
9、切割片段长度多态性(CleavageFrag-mentLengthPolymorphismCFLP)CFLP技术是在限制性酶切片段长度多态性(RELP)和SSCP基础上发展起来的一种基因突变检测技术，其原理是:双链DNA变性后形成的单链在中性条件下形成二级结构(包含多个折叠的发夹状结构),正如SSCP一样,这种二级结构取决于DNA的核苷酸组成和顺序,即使有一个碱基的差异,也会形成不同数目的折叠状发夹结构,而CleavaseI外切酶能识别这种发夹结构,并在该结构的附近进行切割,切割产物跑变性聚丙烯酰胺凝胶检测,突变的DNA将出现与正常对照不同的酶切图谱。
10、PCR-ELISA结合微测序检测点突变（PCR-ELISA & mini-sequencing）新近有报道称：使用PCR-ELISA结合微测序检测到无临床症状且未经抗病毒药物治疗的乙肝患者HBV基因的YMDD主题突变区存在天然Lamivudine耐药基因。
其检测原理如下：探针结合区野生型HBV基因序列：5-…739A TA CGG744 A…-3′, 针对突变区域设计的探针，Wild-Probe: 5-…A TA CGG-3′；Val-Probe: 5- …ATG TIG-（针对741～742位点突变，743位点设计摆动配对）；Ile-Probe: 5-…ATA TAG-3′、5-…ATA TCG-3′、5-…ATATCG-3′（针对743位点突变）。
变性的扩增产物与上述3种类型探针杂交后，再加入含生物素-7-dATP、Taq酶和Mg2+等的微测序缓冲液55℃温育。
如果Val或Ile探针与靶DNA 完全匹配，探针3′末端延伸一个带标记的腺嘌呤。
反之，不匹配时，探针Tm降低，3′末端游离而不延伸标记的腺嘌呤。
利用链酶亲和素酶标系统检测探针上标记的生物素，可判断样品中是否存在点突变。
而近期我们所进行的点突变检测是基于PCR-ELISA和杂交链稳定性的基础上发展起来的，主要是利用野生型和突变型序列与探针结合后在Tm值上的差异进行检测。
近年来随着新技术、新材料的不断涌现，已知基因单位点突变检测技术将会得到迅速的发展，从而距离理想的突变扫描方法（即：对大片段DNA进行突变扫描，100%的检出率，无假阳性或假阴性现象，不需复杂的设备、花费低、不需使用有害试剂和同位素、高效率、耗时短。
）越来越近。
11、变性高效液相色谱分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）优点：高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉等。
在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异，发现DNA突变。
异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。
DHPLC高度自动化，可以自动取样，检测每个样品只需要8分钟左右。