鸡白细胞介素3IL-3酶联免疫分析
家禽饲养中的免疫抗体检测技术
家禽饲养中的免疫抗体检测技术概述家禽养殖产业作为我国重要的农业产业之一，具有庞大的市场需求和经济潜力。
饲养过程中，免疫抗体检测技术的应用对保障家禽健康成长、防控疾病具有重要意义。
本文将从免疫抗体检测技术的基本原理、免疫抗体检测的方法以及技术在家禽饲养中的应用等方面进行阐述。
第一部分免疫抗体检测技术的基本原理免疫抗体检测的基本原理是通过检测目标抗原与免疫抗体之间的特异性结合反应，来确定目标抗体或抗原的存在与数量。
常用的免疫抗体检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光免疫分析法（FIA）和免疫电泳等。
第二部分免疫抗体检测的方法1. 酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验是一种常用的免疫抗体检测方法，其基本原理是利用酶标记物与抗原或抗体之间的特异性结合，通过酶的催化作用来检测目标物质的存在与数量。
ELISA方法具有高效、灵敏、快速的优点，广泛应用于家禽饲养中免疫抗体的检测。
2. 荧光免疫分析法（FIA）荧光免疫分析法是一种利用荧光染料与抗原或抗体结合，通过荧光信号的检测来确定目标物质的存在与数量的方法。
相比于传统的免疫抗体检测方法，FIA具有更高的灵敏度和特异性，能够实现快速、准确地检测家禽饲养中的免疫抗体。
3. 免疫电泳免疫电泳是一种基于电泳原理的免疫抗体检测方法，其特点是可以同时检测多种抗体或抗原。
通过将样品中的抗体或抗原与电泳进行结合，通过电泳过程中的分离来检测目标物质的存在与数量。
免疫电泳方法具有高效、可定量、可扩展等优点，在家禽饲养中的免疫抗体检测中得到了广泛应用。
第三部分免疫抗体检测技术在家禽饲养中的应用1. 疾病预防与控制通过免疫抗体检测技术，可以对家禽养殖过程中的常见病毒、细菌等疾病进行有效的预防与控制。
及时检测家禽体内的免疫抗体水平，有助于及早发现家禽的免疫状态，采取相应的预防措施，减少疾病的传播和发生。
2. 饲养管理与优化免疫抗体检测技术可以为家禽饲养提供科学的依据，通过检测家禽养殖环境中的免疫抗体情况，评估家禽的健康状况，指导饲养管理与优化。
鸡病常规抗体检测结果分析及运用
3
H5（禽流感）
1、蛋/种鸡群H5抗体正常检测离散范围应为4log2—10log2，鸡群感染后，抗体异常上升，且离散范围大。
2、肉鸡群：因该病感染和死亡涉及非常快，且病变典型，抗体对比意思不大。
4
IB（传支）
1、蛋/种鸡群：IB免疫效果评价（ELISA检测）：免后三周抗体较免前抗体有所上升（500—2000），并且变异系数缩小，说明免疫有效，一般认为免疫抗体阳性率＞80%为免疫成功。从大量的检测结果中发现免后阳性率基本都在100%。鸡群在产蛋期抗体滴度大于10000的鸡群在我们长时间检测中也有发现，鸡群无疾病表现，目前不能说明什么，有待进一步的认识。
2、肉鸡群：以琼脂扩散试验(AGP)方法检测免后三周抗体≥50%为免疫合格。
6
REO（病关）
REO免疫效果评价（ELISA检测）：免后三周抗体较免前抗体均有大幅度上升（5000—15000），并且变异系数缩小，说明免疫有效，一般认为免疫抗体阳性率＞80%为免疫成功。从大量的检测结果中发现免后阳性率基本都在100%。
2、肉鸡群：如在发病后检测MG抗体，在未对其项目进行接种有阳性抗体且变异系数大，提示鸡群可能受外界毒株感染所致。
7
MG（支原体）
1、肉种鸡群：MG免疫效果评价（ELISA检测）：我们种鸡常规MG抗体检测检测分两次，第一次为免前检测，如免前鸡群MG抗体阳性的话，就可以考虑不进行免疫接种，第二次为免后7周，因鸡群免过MG疫苗后21天到49天的血清转化，故在免后7周检测抗体转阳情况，一般正常情况下抗体阳性率应在80%以上。
序号
检测项目
检测结果分析
备注
1
ND（新城疫）
1、蛋/种鸡群：ND抗体在正常检测离散范围应为6log2—12log2，离散范围越小越能说明鸡群免疫应答反应好，如抗体滴度＞13log2，且离散范围大如：6log2—15log2，提示鸡群可能受外界毒株感染所致。
饲养密度对肉鸡生长性能和免疫指标的影响
饲养密度对肉鸡生长性能和免疫指标的影响作者：袁磊来源：《中国动物保健》2024年第06期摘要：为了探索饲养密度对肉鸡生长性能和免疫指标的影响。
本试验以100羽1～3日龄的白羽肉鸡作为研究对象，并采用随机数字表法将其均分成5组，每组20羽毛；试验处理中的不同的饲养密度分别为7 、9 、11 、13 和15 羽/m2；试验在计算白羽肉鸡的平均日采食量、平均日增重和料重比的同时，还对白羽肉鸡血清中的IL-10、IL-4和IL-1β的含量进行测定。
试验结果显示：饲养密度在11、13 和15 羽/m2时的白羽肉鸡的平均日采食量明显低于饲养密度在7 和9 羽/m2时的白羽肉鸡的平均日采食量，且差异显著（P＜0.05）；饲养密度在11、13和15 羽/m2时的白羽肉鸡血清中IL-4的含量明显高于饲养密度在7 羽/m2和9 羽/m2时的白羽肉鸡血清中IL-4的含量，且差异显著（P＜0.05）；饲养密度在13 和15 羽/m2时的白羽肉鸡血清中IL-1β的含量明显高于饲养密度在7 、9 和11 羽/m2时的白羽肉鸡血清中IL-1β的含量，且差异显著（P＜0.05）；饲养密度对白羽肉鸡血清中的IL-10的含量、平均日增重和料重比没有影响。
以上结果表明，饲养密度在7 和9 羽/m2时可以防止饲养密度对白羽肉鸡生长性能和免疫指标的负面影响。
关键词：饲养密度；肉鸡；生长性能；免疫指标随着人们生活水平的日渐提升，人们对畜禽的需求量和品质也有了更高的要求，而养殖场的规模化养殖面积也需要急速的扩张，因此畜禽养殖的饲养密度问题也越来越受到关注[1]。
虽然近年来前人对饲养密度进行的研究较多，但是前人的研究大多均以比较2～3个水平的饲养密度为主。
有研究表明，饲养密度会对肉鸡的生长性能造成影响，且饲养密度的过度提高会造成肉鸡的体重、采食和饲料转化率下降，使肉鸡的患病率升高[2]。
同时，饲养密度的过度提高还会威胁肉鸡的健康，使肉鸡出现应激和肠道问题[3]，此外，有研究表明，科学合理的饲养密度能够有效提升肉鸡的生长性能和免疫能力[4]。
鸡三联疫苗免疫期和保存期检测确定
７５、． 、． 、． ． ７４ ７４ ７２和 ７ ３ Ｉ ． ；Ｂ抗 体效 价分 别 为 ７ ３ ．、 ７４、． ． ７２和 ７ ０ ＩＤ抗体 阳性率分 别 为 ８ ％ 、０ 、 ．； Ｂ ０ ７％
表２ 鸡Ｎ Ｉ Ｄ— Ｂ—ＩＤ三联 弱毒 冻干疫 苗保存期测 定结果 Ｂ
—
胚成纤 维细 胞旋 转 立 体 培养 ＩＤ ８ ； 收获 的 含 毒 Ｂ Ｂ ７将
２ 试验结果
２ １ 疫 苗免疫 期测 定 结果 ．
鸡胚尿囊液和细胞毒液通过配制 比例筛选混合冻干， 制备成 鸡 Ｎ Ｉ ＩＤ三 联弱 毒冻 干疫 苗 。为 了了 Ｄ— Ｂ— Ｂ 解该疫苗的免疫保护期和保存期 ， 为推广应用提供依 据 ， 了本次测 定试验 。 进行
于免疫后第 １ 开始 ， ４ｄ 每间隔 １ 用 Ｂ一 ４ｄ 微量血凝 抑制 试 验 测 定 血 清 中 Ｎ Ｉ 的抗 体 滴 度 ， Ａ Ｐ Ｄ、Ｂ 用 Ｇ 法测定 ＩＤ抗体阳性率 ， Ｂ 直至血清抗体水平降至公 认 的保护 抗体 水平 。 １ ２ ２ 疫 苗 的保 存 期 测 定 试 制 的 鸡 Ｎ —Ｉ ．． Ｄ Ｂ—
用三 联弱 毒冻 干疫 苗免 疫 １ 日龄 小鸡 后 ，４～ ４ ｌ ２ 抗体效价逐渐升高 ，２ｄ 开始逐渐下降 ， ８ｄ ４ 后 至
１ 材料 与方法
１ １ 试 验材 料 ．
７ 时仍可检测到较高水平的的抗体 （ 阳性率 ） ０ｄ 或 。 表 明试 制 的鸡 Ｎ —Ｉ Ｄ Ｂ—ＩＤ三 联 弱毒 冻 干 疫 苗 的 Ｂ 免疫 期最 少 为 ６ （ 表 １ 。 ０ｄ 见 ）
Ｖｏ． ０ １３
Ｎｏ ４ ．
２ １ ０ １
１ 日龄 小 鸡 后 １ ４ ４ ｄ产 生 的 Ｎ 抗 体 效 价 分 别 为 Ｄ
细胞因子的检测方法
细胞因子的检测方法细胞因子(cytokine)是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称。
在免疫应答过程中，细胞因子在免疫调整、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。
细胞因子的检测不仅是基础免疫讨论的有较手段，同时在临床疾病诊断、病程观看、疗效推断及细胞因子治疗监测方面具有重要价值。
但是，由于细胞因子在体内的含量甚微，给细胞因子的检测带来困维，细胞因子的检测尚未在临床诊断上广泛开展，已知目前采纳的细胞因子检测方法均不完善，且不同的检测方法所得的结果差异较大，给临床诊断与治疗带来肯定的困难。
因此，有必要了解各种检测方法的特性及影响因素。
目前，细胞因子生物学活性检测和浓度测定方法主要有以下几类一.生物学检测法生物学检测又称生物活性检测，是依据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。
由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSFci 激造血细胞集落形成，IFN爱护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测。
生物活性检测法又可分为以下几类：1．细胞增殖法很多细胞因子具有细胞生 zhang 因子活性，特殊是白细胞介素，如IL-2 ci激t细胞生 zhang 、IL-3 ci 激肥大细胞生 zhang 、IL-6 ci 激浆细胞生 zhang 等。
利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依靠于某种因子的细胞系，即依靠细胞株(简称依靠株)。
这些依靠株在通常状况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。
例如IL-2依靠株ctll-2在不含IL-2的培育基中很快死亡，而加入IL-2后则可右体外 zhang 期培育。
在肯定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖状况(如使用3h-tdr掺入法、MTT法等)鉴定IL-2的含量。
除依靠株外，还有一些短期培育的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原ci 激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。
酶联免疫检测法
酶联免疫检测法一、概述酶联免疫检测法是一种常见的生物分子检测方法，它利用酶作为标记物来检测目标分子，具有高灵敏度、高特异性、易操作等优点，广泛应用于医学、生物学、化学等领域。
二、原理酶联免疫检测法基于抗原-抗体反应原理，包括直接酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等多种类型。
其中，最常见的是直接和间接ELISA。
1. 直接ELISA直接ELISA是将已知抗体固定在微孔板上，并加入待检样本中含有目标抗原的溶液，经过一定条件下的反应后，再加入与目标抗原结合的酶标记二抗，在适当条件下进行染色反应并测定吸光度值。
其优点是操作简单快捷，但缺点是灵敏度略低。
2. 间接ELISA间接ELISA是将已知抗体固定在微孔板上，并加入待检样本中含有目标抗原的溶液，在适当条件下进行反应后加入与目标抗原结合的一抗，再加入与一抗结合的酶标记二抗，在适当条件下进行染色反应并测定吸光度值。
其优点是灵敏度高，但操作稍复杂。
三、步骤酶联免疫检测法的基本步骤如下：1. 预处理样本：根据不同的样本类型和检测要求，可以进行不同的处理方法，如离心、洗涤、稀释等。
2. 固定抗原或抗体：将已知抗体或抗原固定在微孔板上。
3. 加入待检样本：加入含有目标分子的待检样本。
4. 洗涤：将未结合的物质洗去。
5. 加入酶标记二抗或一抗：根据实验设计需要选择适当的酶标记二抗或一抗，并加入微孔板中与目标分子结合。
6. 洗涤：将未结合的物质洗去。
7. 加入底物：加入适当底物后，在适当条件下进行染色反应。
8. 停止反应并测定吸光度值：在反应停止后，使用光谱仪等设备测定吸光度值，并根据标准曲线计算待检样本中目标分子的浓度。
四、应用酶联免疫检测法在医学、生物学、化学等领域有广泛的应用，常见的应用包括：1. 临床诊断：如肝炎病毒、艾滋病毒等感染的诊断。
2. 药物检测：如抗生素、激素等药物残留的检测。
3. 食品安全：如农药残留、食品添加剂等的检测。
禽白血病的检测与诊断
禽白血病的检测与诊断禽白血病（Avian Leukosis）是一种由禽白血病病毒引起的急性、亚急性或慢性传染病。
该病主要影响鸡、火鸡和鸽子等禽类动物，对禽类养殖业造成了严重的经济损失。
禽白血病病毒主要通过接触、垂直传播和水平传播途径传播，引起感染动物的免疫功能失调，导致机体出现贫血、免疫抑制和肿瘤形成等严重症状。
及早对禽类进行禽白血病的检测和诊断是非常重要的。
一、检测方法1. 血清学检测血清学检测是禽白血病检测的常用方法之一。
该方法通过采集禽类动物的血清样本，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）或凝集素试验等技术，检测血清中是否含有禽白血病病毒抗体。
若检测结果呈阳性，则说明动物已被感染禽白血病病毒。
2. 分子生物学检测分子生物学检测是目前禽白血病病毒检测的主流方法之一。
该方法利用聚合酶链式反应（PCR）技术，针对病毒DNA或RNA进行检测，具有高度的特异性和敏感性。
通过该技术可以直接检测病毒在禽类动物的血液、组织或分泌物中的存在情况，从而及时发现患病动物，防止病毒的传播。
病理学检测是通过病理学方法对禽类动物的组织标本进行检测，观察组织病变的形态学改变，以及病毒的存在情况。
通过病理学检测可以直观地判断动物是否感染了禽白血病病毒，对于疑难病例的诊断具有重要意义。
二、诊断方法1. 临床表现禽白血病的临床表现包括贫血、体重减轻、食欲不振、呼吸困难、腹部肿块、运动障碍等症状。
对于出现上述症状的禽类动物，应及时进行禽白血病的诊断。
2. 实验室检测利用上述的检测方法对禽类动物进行实验室检测，可以明确禽白血病的感染情况。
根据检测结果，结合临床表现，可以对禽白血病进行准确的诊断。
通过对禽类动物的组织标本进行病理学检测，可以观察到病理改变的特征，如淋巴组织增生、肿瘤形成等，从而对禽白血病进行确诊。
三、预防措施1. 加强动物免疫力通过提高禽类动物的体质，加强饲养管理，合理配合饲料，以及定期进行免疫接种等措施，可以提高动物的免疫力，降低禽白血病的发病率。
支原体活疫苗的使用和监测
对于没有免疫过支原体活疫苗的鸡群来说，通过ELISA试验及早发现并控制感染来预防疾病传播是一个很有效的方法。
最近对于曾免疫过支原体活疫苗的鸡群进行的血清学数据表明ELISA（酶联免疫吸附试验）方法可以用于监测免疫是否成功或者是否有田间感染。
采用ELISA方法进行监测及控制的目的是预防因支原体感染引起的产蛋下降。
未免疫鸡群的早期检测监测鸡群（假设未感染鸡群）的目的是确定其为阴性群或尽早检测出继发感染MG（支原体）或MS（滑液囊支原体）的鸡只。
早期检出支原体增殖鸡群是极为重要的，当某一群体变成阳性群后，要采取必要的措施防止疾病扩散，其确诊的试验费用也很高。
用于监测的任何方法都不仅对于确定早期感染高度敏感并且对于确诊有高度特异性。
将免疫疫苗作为一种防御措施要想使鸡群免于支原体感染很难做到，例如：在具有多批次产蛋鸡的商品蛋鸡场内。
因此对鸡群进行支原体疫苗免疫来预防MG或MS感染是一种选择。
支原体活疫苗的使用和监测高娃译（山东益生种畜禽股份有限公司山东烟台518026）疫病防制物要注意生、熟分开；搞好厨房卫生，处理活禽、冷藏和解冻生禽后，要用肥皂和流动水彻底洗手，养成良好的卫生习惯。
四、尽量避免与禽类接触，尤其要远离病死畜禽。
公园、绿地是迁徙候鸟的栖息地，迁徙季节不要近距离接触；外出旅途中，应尽量避免接触野生禽鸟或进入野禽栖息地；学校及幼儿园应采取措施，教育儿童不要饲喂野鸽或其他雀鸟；接触过禽鸟或禽鸟粪便，要用消毒液和清水彻底清洁双手；家养宠物鸟者，在候鸟迁徙时期尽量不要悬挂于室外。
对于养殖场户来说，禁止家禽与家畜混养，特别是猪与禽，因为猪是禽流感病毒的“放大器”；养殖场必须封闭管理，以杜绝家禽与野禽的接触（家禽和野禽接触后，容易发生病毒重配），消除疫病传播隐患。
五、加强职业防护，发现可疑情况及时就诊并上报。
从事禽类养殖、销售、宰杀、加工业者以及兽医、医务人员等高危人群，必须做好个人防护。
如在工作时穿工作服、戴口罩、戴手套等防护用具，严格执行操作规程，工作前后彻底消毒等；年老体弱、患有基础疾病的居民，在呼吸道传染病高发时期，应尽量减少去人群拥挤的场所，发现有类似流感症状者，要戴口罩等防护用具，及时到医院就诊。
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鸡白细胞介素3（IL-3）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T0.6ng/L -16ng/L使用目的：本试剂盒用于测定鸡血清、血浆及相关液体样本中鸡白细胞介素-3（IL-3）含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鸡白细胞介素-3（IL-3）水平。
用纯化的鸡白细胞介素-3（IL-3）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入鸡白细胞介素-3（IL-3），再与HRP标记的白细胞介素-3（IL-3）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的白细胞介素-3（IL-3）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中白细胞介素-3（IL-3）浓度。
试剂盒组成标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
操作程序总结：计算以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
保存条件及有效期1．试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月RDChicken Interleukin 2FOR RESEARCH USE ONLYAssay range：15 ng/L -300 ng/L 96 determinations PurposeThis kit allows for the determination of IL-2 concentrations in Chicken serum, cell culture supernates and other biological fluidsPrinciple of the assayT he kit assay Chicken IL-2 level in the sample，use Purified Chicken IL-2 antibody to coat microtiter plate wells, make solid-phase antibody, then add IL-2 to wells, Combined antibody which With HRP labeled goat anti- chicken become antibody - antigen - enzyme-antibody complex, after washing Completely, Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed, reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm. The concentration of IL-2 in the samples is then determined by comparing the O.D. of the samples to the standard curve.Materials provided with the kitSpecimen requirements1.extract as soon as possible after Specimen collection,and according to the relevantliterature, and should be experiment as soon as possible after the extraction. If it can’t, specimen can be kept in -20 ℃ to preserve, Avoid repeated freeze-thaw cycles.2.Can’t detect the sample which contain NaN3, because NaN3 inhibits HRP active. Assay procedure1.Dilute and add sample:Dilute Original density Standard as follow table:2.add sample：Set blank wells separately (blank comparison wells don’t add sample and HRP-Conjugate reagent, other each step operation is same). testing sample well. add Sample dilution 40μl to testing sample well, then add testing sample 10μl (sample final dilution is 5-fold), add sample to wells , don’t touch the well wall as far as possible, and Gently mix.3.Incubate: After closing plate with Closure plate membrane ,incubate for 30 min at 37℃.4.Configurate liquid: 30-fold wash solution diluted 30-fold (or 20-fold) with distilled water and reserve.5.washing：Uncover Closure plate membrane, discard Liquid, dry by swing, add washing buffer to every well, still for 30s then drain, repeat 5 times, dry by pat.6.add enzyme：Add HRP-Conjugate reagent 50μl to each well, except blank well.7.incubate：Operation with 3.8.washing：Operation with 5.9.color：Add Chromogen Solution A 50ul and Chromogen Solution B to each well, evade the light preservation for 15 min at 37℃10.Stop the reaction：Add Stop Solution50μl to each well, Stop the reaction(the blue colorchange to yellow color).11.assay：take blank well as zero , Read absorbance at 450nm after Adding Stop Solution andwithin 15min.Steps descriptionCalculateTake the standard density as the horizontal, the OD value for the vertical ,draw the standard curve on graph paper, Find out the corresponding density according to the sample OD value by the Sample curve, multiplied by the dilution multiple, or calculate the straight line regression equation of the standard curve with the standard density and the OD value ,with thesample OD value in the equation, calculate the sample density, multiplied by the dilution factor, the result is the sample actual density.Important notes1.The kit takes out from the refrigeration environment should be balanced 15-30 minutes inthe room temperature, ELISA plates coated if has not use up after opened, the plate should be stored in Sealed bag.2.washing buffer will Crystallization separation, it can be heated the water helps dissolvewhen dilute . Washing does not affect the result.3.add Sample with sampler Each step, And proofread its accuracy frequently, avoids theexperimental error. add sample within 5 min, if the number of sample is much , recommend to use Volley .4.if the testing material content is excessively higher (The sample OD is bigger than the firststandard well ),please dilute Sample (n-fold), Please diluente and multiplied by the dilution factor.（×n×5）.5.Closure plate membrane only limits the disposable use, to avoid cross-contamination.6.The substrate evade the light preservation.7.Please according to use instruction strictly, The test result determination must take themicrotiter plate reader as a standard.8.All samples, washing buffer and each kind of reject should according to infective materialprocess.9.Do not mix reagents with those from other lots.Storage and validity1．Storage：2-8℃.2．validity：six months.。