酶联免疫法(ELISA)测定植物激素含量
植物激素免疫测定指南
植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）免疫测定是利用抗原、抗体特异性反应而建立的，根据可视化方法的不同可分为：酶联免疫、放射免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定、生物发光免疫测定、浊度免疫测定法等。
由于酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assays, 简称ELISA）具有灵敏性、特异性高，且方便、快速、安全、成本低廉的特点，而日益被广泛应用于植物激素测定。
目前，几大类植物激素IAA,ABA, GA3、GA4、iPA、ZR、DHZR等都建立了相应的ELISA方法并有试剂盒出售。
植物激素的酶联免疫检测方法有两种形式（见下图），一种是在固相载体上直接包被抗体（直接法，先包被二抗，再加一抗），另一种是包被抗原（间接法）。
直接法利用游离抗原和酶标抗原与吸附的抗体进行竞争。
间接法利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体进行竞争。
间接法的原理可用下式表示：Ab+H+HP=AbH+AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素－蛋白质复合物。
根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，即结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP的多少，就可以确定游离H 量的多少。
材料、试剂及设备1 材料各种新鲜植物材料2 仪器设备研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10μl，40μl,200μl,1000μl），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。
3 试剂(1) 包被缓冲液：称取１.５g Na2CO3, 2.93g NaHCO3, 0.2g NaN3（可不加）, 用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为9.6.(2) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 ·12H2O，用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。
植物激素的测定方法
植物激素的测定方法植物激素是一类由植物自身合成并参与生长发育调控的活性物质，对植物的生长发育起着重要作用。
因此，准确测定植物激素的含量对于研究植物生长发育调控机制具有重要意义。
本文将介绍几种常用的植物激素测定方法。
一、高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法是目前应用最广泛的植物激素测定方法之一。
该方法基于植物激素在高效液相色谱柱上的保留时间和峰面积，通过与已知浓度的标准品比较，可以计算出待测样品中植物激素的含量。
高效液相色谱法具有分离效果好、分析速度快、准确度高的优点，但需要专用的仪器设备，操作较为复杂。
二、气相色谱法（GC）气相色谱法是另一种常用的植物激素测定方法。
该方法通过将待测样品中的植物激素转化为易挥发的衍生物，然后在气相色谱柱上进行分离和定量分析。
气相色谱法具有测定灵敏度高、分离效果好的特点，但需要对样品进行预处理，并且对仪器的稳定性要求较高。
三、酶联免疫吸附法（ELISA）酶联免疫吸附法是一种常用的免疫学测定方法，也可以用于测定植物激素的含量。
该方法通过将植物激素与特异性抗体结合，然后再用酶标记的二抗进行检测，最后通过比色反应或发光反应来测定植物激素的含量。
酶联免疫吸附法具有操作简便、成本较低的优点，但需要特异性较好的抗体。
四、放射免疫测定法（RIA）放射免疫测定法是一种使用放射性同位素标记的植物激素进行测定的方法。
该方法通过将放射性同位素标记的植物激素与待测样品中的植物激素结合，然后通过放射性计数来测定植物激素的含量。
放射免疫测定法具有灵敏度高、测定范围广的特点，但需要使用放射性同位素，存在辐射危险。
五、质谱法（MS）质谱法是一种高灵敏度的分析方法，可以用于测定微量的植物激素。
该方法通过将待测样品中的植物激素通过质谱仪进行分子质量分析，从而测定植物激素的含量。
质谱法具有高灵敏度、高分辨率的特点，但需要专用的仪器设备和较高的技术水平。
植物激素测定方法有高效液相色谱法、气相色谱法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法和质谱法等。
化学发光法elisa
化学发光法elisaELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的生物化学分析方法，通过检测化学发光信号来定量分析样品中的目标物质。
它是一种高灵敏度、高特异性的实验技术，广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
化学发光法ELISA的原理是利用酶标记抗体与待测物质结合，然后通过酶催化反应产生化学发光信号。
ELISA分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA等多种类型，根据实验需要选择不同的方法。
在ELISA实验中，首先需要将待测物质固定在试验板上，然后加入酶标记抗体与待测物质结合。
接着，加入底物溶液，底物与酶催化反应产生化学发光信号。
最后，使用专用的发光仪器测量发光强度，根据发光强度的大小可以定量分析样品中的目标物质含量。
化学发光法ELISA具有许多优点。
首先，ELISA方法具有高灵敏度，可以检测到非常低浓度的目标物质。
其次，ELISA方法具有高特异性，可以准确地区分目标物质与其他物质的结合。
此外，ELISA方法操作简单、快速，可以同时处理多个样品，提高实验效率。
最重要的是，ELISA方法可以应用于多种样品类型，包括血清、尿液、细胞培养液等，具有广泛的应用前景。
化学发光法ELISA在医学领域有着重要的应用。
例如，ELISA可以用于检测血液中的病原体抗体，如HIV、乙肝病毒等。
ELISA还可以用于检测肿瘤标志物，帮助早期发现肿瘤并进行治疗。
此外，ELISA还可以用于检测药物浓度，指导药物治疗的调整。
除了医学领域，化学发光法ELISA在生物学、环境科学等领域也有广泛的应用。
例如，ELISA可以用于检测植物中的激素含量，研究植物生长发育的调控机制。
ELISA还可以用于检测环境中的污染物，如重金属、农药等，评估环境质量。
尽管化学发光法ELISA具有许多优点，但也存在一些局限性。
首先，ELISA方法对样品的处理要求较高，需要进行样品预处理、稀释等步骤，增加了实验的复杂性。
玉米生理生化实验报告
一、实验目的1. 探究玉米在不同生长阶段的主要生理生化特性。
2. 分析玉米光合作用、呼吸作用、水分利用效率等生理指标。
3. 通过实验了解玉米种子萌发、幼苗生长及植株发育过程中的生理生化变化。
二、实验材料与方法1. 实验材料：玉米种子（品种：郑单958）、生长培养基、蒸馏水、NaOH溶液、碘液、斐林试剂等。
2. 实验方法：（1）种子萌发实验：将玉米种子浸泡在蒸馏水中，置于恒温培养箱中，定期观察种子萌发情况，并记录萌发率。
（2）幼苗生长实验：将萌发的玉米幼苗移栽至生长培养基中，定期测量幼苗株高、叶面积等生长指标。
（3）生理生化指标测定：a. 光合作用：利用光合仪测定玉米叶片的光合速率、蒸腾速率等指标。
b. 呼吸作用：利用呼吸仪测定玉米叶片的呼吸速率。
c. 水分利用效率：通过测定玉米植株的水分含量和光合速率，计算水分利用效率。
d. 植物激素含量：利用酶联免疫吸附法（ELISA）测定玉米叶片中的生长素、细胞分裂素等植物激素含量。
e. 酶活性测定：利用比色法测定玉米叶片中过氧化物酶、超氧化物歧化酶等酶活性。
三、实验结果与分析1. 种子萌发实验：- 种子萌发率随浸泡时间延长而增加，浸泡时间为24小时时，种子萌发率最高。
- 种子萌发过程中，呼吸速率和水分含量逐渐增加，表明种子在萌发过程中需要消耗大量能量和水分。
2. 幼苗生长实验：- 玉米幼苗在生长培养基中生长良好，株高、叶面积等生长指标随培养时间延长而逐渐增加。
- 幼苗生长过程中，叶片颜色逐渐由黄绿色转变为绿色，表明光合作用逐渐增强。
3. 生理生化指标测定：- 光合作用：玉米叶片的光合速率和蒸腾速率随光照强度增加而增加，表明玉米具有较强的光合作用能力。
- 呼吸作用：玉米叶片的呼吸速率随温度升高而增加，表明玉米在较高温度下呼吸作用较强。
- 水分利用效率：玉米水分利用效率较高，表明玉米具有较强的水分利用能力。
- 植物激素含量：玉米叶片中生长素和细胞分裂素含量较高，表明玉米具有较强的生长调节能力。
植物激素的提取和纯化
植物激素测定的方法
1、生物测定法
生物测定法是通过测定激素作用于植株或离体器官后所产生的生 理生化效应的强度，从而推算植物激素含量的方法。
特点：简单易操作，但是其灵敏度及专一性均不够高 。
2、物理和化学方法
薄层层析、气相色谱(GC)、高效液相层析(HPLC)和质谱分析(MS)、 色质联谱(GC-MS)可以更为精确地检测多种激素 。
实验步骤
• 1、植物激素的提取：
分次加入3ml 80%甲醇 称样（0.5g） 10000g 倒入离心管 10min 离心
研磨 倒出上清液
• 2、激素的纯化：过C18柱法
5ml针筒接在C18柱上 5ml 100%甲醇 5ml 70%甲醇
5ml乙醚
加样ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
• 3、取出300μl氮气吹干备用。
实验5 植物激素的提取和纯化
一般激素在植物中的含量极低，性质又不稳定，加 之细胞中其他化合物的干扰，故测定的方法必须 十分灵敏和专一。通常首先用合适的有机溶剂来 提取，既要避免许多干扰物质，又要防止破坏激 素本身。其次采用各种过柱、萃取或层析步骤， 使激素得到部分提纯。然后再用生物的、物理的 或化学的方法测定其含量。
特点：灵敏度和选择性高，重复性好，但对前处理要求较高 。
3、免疫分析法
放射免疫检测法(RIA)和酶联免疫吸附检测法(ELISA)是当前常用的两 种激素定量技术。
特点：高专一性，高灵敏性，操作简便，样品往往只需初步纯 化。
实验材料、试剂和仪器
• 1、实验材料：新鲜采集的叶片或其他部分； • 2、试剂：80%甲醇； • 3、仪器：研钵、移液抢、塑料离心管、高速低温 离心机、Sep-Pak C18柱、吹氮气装置。
植物激素的测定方法-精品文档
二、免疫球蛋白的分子结构
免疫球蛋白的基本结构
• 四肽链结构 ，链间二硫键连接 • 两条重链（H）和两条轻链（L） • 氨基端和羧基端。
可变区与恒定区
• 根据氨基酸排列顺序的不同分为： 可变区（V）和恒定区（C） • 可变区（V区）：氨基酸组成、排列顺序变化较 大 • 恒定区（C区）：氨基酸数量、种类、排列顺序 及 含糖量都比较稳定
注意事项 ：
（ 1 ）微量加液器应注意保养并定期校正，否则结果误差 较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应物间不能充分 混匀反应。 （ 2 ）洗涤时力求次数足够，且避免形成气泡，否则洗涤 不完全。 （3）温育时要力求受热均匀，同时避免液体蒸发。 （ 4 ）比色时反应管内不能留有气泡，管底不能存有水滴， 否则出现较大误差。
测定标准物各浓度和各样品490nm
处的OD值。
数据分析
在波长 450nm 处分别读取各标准孔和样本孔 OD 值， 以 OD值为横坐标，“标样激素含量的对数”为纵坐
用酶标仪进行比色，以0 ng/ml标准孔为空白孔，
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的
利用反对数求得ABA的绝对含量。
OD值在标准曲线上查出待测样品的 ABA含量的对数。
植物激素的酶连免疫分析法
几种酶标分析仪
DNM-9602G酶标分析仪
DNM-9602A酶标分析仪
DNM-9602 标配酶标分析仪
操作步骤
包被---温育---洗涤---竞争--温育---洗涤---加二抗---温育--
-洗涤---显色---比色---计算
包 被
• 每小孔中加入100μl包被缓冲液，然后
植物激素的测定方法？
生物活性法 气相色谱（气-质联机） 液相色谱（液-质联机） 酶连免疫法（ ELISA 法）
植物激素的检测方法
比色谱法是最早应用于生长 素分析的光谱法，但由于该法选 择性差，现很少被应用。荧光分 析法是进行痕量、超痕量甚至分 子水平上分析的重要手段，它具 有选择性好、取样少、灵敏度高 以及简便快速等优点，近年来在 植物激素分析中得到广泛应用。
电化学分析法
电化学分析法相对于气相色谱(GC)、液相色 谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)、免疫法等分析方法具 有简单、方便和仪器价廉等特点. 在早期的研究中, 植物激素的电化学分析方法主要是针对脱落酸、赤 霉素、玉米素和激动素等植物激素标准品的电化学 行为进行探讨. 通过研究发现, 植物激素存在的本底 溶液的性质和pH 对测定结果会产生很大影响。
色谱法和光谱法
色谱法
光谱法
色谱学是利用物质在不同介质中的 分配原理进行测定的, 包括纸上层析、薄 层层析( TLC)、气相色谱( GC)、高效相 色谱( HPLC) 以及气质联用( GC-M S) 等, 将分离和测定结合起来是色谱法的基本 特点。根据色谱学理论, 某种化合物在一 定色谱条件下的出峰时间(保留时间) 是 固定的, 这是色谱学定性的依据； 而色 谱峰面积(或峰高) 与物质的含量(或总量) 成正比, 这是色谱学定量的基础。
植物激素 的 检测方法
目录
CONTENTS
01
02
03
04
植物 激素 定义
植物 激素 分类
植物 激素 检测 方法
参考 文献
1
植物激素的定义
植物激素的定义
天然植物激素或内源性植物激素, 是植 物自身代谢产生的一类具有高度生物活 性的有机小分子化合物. 它们一般先在 植物的某一部位合成, 然后再转运到其 他部位去发挥作用。植物激素虽是小分 子, 却调控着几乎整个植物生命周期, 如 种子萌发、茎叶伸长、果实成熟以及脱 落等生理过程。植物激素还能感应植物 所处生存环境的外界刺激, 如水分、光 照、温度和损伤等, 并作出相应的反应。
酶联免疫法(ELISA)测定植物激素含量
酶联免疫法（ELISA）测定植物激素含量姓名：李希东专业：植物学学号：200808201 日期：09.5.10 成绩：一、实验目的：掌握间接法测定植物激素的原理和方法；了解逆境对玉米根系ABA和IAA含量的影响。
二、实验原理：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbert assay，简称ELISA)是在免疫酶技术(immuno enzymite technique)的基础上发展起来免疫测定技术。
其建立在两个重要的生物化学反应基础之上的，即①抗原抗体反应的高度专一性和敏感性；②酶的高效催化特性。
ELISA把这二者有机地结合在一起，即被分析物先与其相应的抗体或抗原反应，然后再检测抗体或抗原上酶标记物的活性，从而达到定性或定量测定的目的。
间接法是将过量的与蛋白质连接的待测植物激素(实验前将该激素与牛血清白蛋白等蛋白质连接成[激素一蛋白质复合物])吸附在固相支持物上，然后加入待测植物激素和相应抗体，使抗体与待测植物激素及激素蛋白质复合物结合，再加入酶标抗体(标记酶与非特异第二抗体的复合物)，就形成〔蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物〕，加入底物后就生成有色产物，测定其吸光率，可计算待测抗原的量。
如果抗体、激素一蛋白质复合物和酶标抗体的量一定，并且[激素·蛋白质复合物]和待测激素的总量超过抗体的量，那么生成的[蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物]的量就受待测激素含量的限制，因此待测抗原的量将与吸光率成反比。
图A表示间接酶联免疫方法的基本原理：A.间接酶联免疫原理示意图示反应板（固相载体）示激素特异抗体（一抗）示激素（抗原）示非特异二抗示蛋白质·激素复合物示标记酶本实验所采取的方法，则是利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体的竞争性结合反应，它的原理可用下式表示:Ab十H十HP=AbH十AbHP其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素一蛋白质复合物。
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酶联免疫法（ELISA ）测定植物激素含量
姓名：李希东 专业：植物学 学号：200808201 日期：09.5.10 成绩：
一、实验目的：
掌握间接法测定植物激素的原理和方法； 了解逆境对玉米根系ABA 和IAA 含量的影响。
二、实验原理：
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbert assay ，简称ELISA)是在免疫酶技术(immuno enzymite technique)的基础上发展起来免疫测定技术。
其建立在两个重要的生物化学反应基础之上的，即①抗原抗体反应的高度专一性和敏感性；②酶的高效催化特性。
ELISA 把这二者有机地结合在一起，即被分析物先与其相应的抗体或抗原反应，然后再检测抗体或抗原上酶标记物的活性，从而达到定性或定量测定的目的。
间接法是将过量的与蛋白质连接的待测植物激素(实验前将该激素与牛血清白蛋白等蛋白质连接成[激素一蛋白质复合物])吸附在固相支持物上，然后加入待测植物激素和相应抗体，使抗体与待测植物激素及激素蛋白质复合物结合，再加入酶标抗体(标记酶与非特异第二抗体的复合物)，就形成〔蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物〕，加入底物后就生成有色产物，测定其吸光率，可计算待测抗原的量。
如果抗体、激素一蛋白质复合物和酶标抗体的量一定，并且[激素·蛋白质复合物]和待测激素的总量超过抗体的量，那么生成的[蛋白质·激素·第一抗体·第二抗体·酶复合物]的量就受待测激素含量的限制，因此待测抗原的量将与吸光率成反比。
图A 表示间接酶联免疫方法的基本原理：
A.间接酶联免疫原理示意图
示反应板（固相载体）
示激素特异抗体（一抗）
示激素（抗原） 示非特异二抗
示蛋白质·激素复合物 示标记酶
本实验所采取的方法，则是利用游离抗原和吸附抗原与游离抗体的竞争性结合反应，它的原理可用下式表示:
Ab 十H 十HP=AbH 十AbHP
其中Ab表示抗体，H表示游离激素，HP表示吸附在板上的激素一蛋白质复合物。
根据质量作用定律，当该反应体系中Ab及HP的量确定时，游离H越多，结合物AbH形成的就越多，而AbHP形成的就越少，RF结合在板上的抗体就越少，通过酶标二抗检测结合物AbHP 的多少，就可以确定游离H量的多少。
三、实验器皿：
1、材料：正常条件和NaCl处理下的玉米种子
2、仪器:
天平、研钵、离心管（5mL）、离心机、青霉素小瓶、封口膜、培养箱、反应板、解剖盘、纱布、移液枪（1000μL、100μL、50μL）、滤纸、酶联免疫测定仪
3、试剂:
包被缓冲液，磷酸盐缓冲液(PBS)，样品稀释液，底物缓冲液，洗涤液，终止液，提取液。
（缓冲液均放入4℃冰箱储存）
四、实验步骤：
1. 样品中激素的提取（计量）
称取1g 左右材料，加2ml 样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆(一定要磨细)，转入5ml离心管，再用2ml 提取液分次冲洗研钵并转入离心管中，摇匀。
在4℃下提取4h，3000~4000rpm 离心15~20min，取上清液，沉淀中加1ml 提取液，摇匀，置4℃下再提取1hr,离心，合并上清液。
记录体积，残渣弃去。
将一定体积的上清液转入青霉素小瓶中，吹干（低温保存），用样品稀释液定容(一般1g 样品用1ml样品稀释液定容)，摇匀后再用于测定。
2. 样品测定
（1）包被：向反应板中每孔加100μL IAA抗原，将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内，37℃保温3h。
（2）洗板室温下平衡，洗涤液洗4次，第一次迅速倒掉并甩干。
（3）竞争:
a、配标样：IAA 稀释成一系列浓度(2000 ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、250、125、62.5、
31.25、0) 8个。
b、加标样及样品：每个浓度加2孔，每孔50μL，每个样品重复2孔，每孔50μL，边缘孔不加。
c、加抗体：每孔加50μL，将酶标板放入湿盒内开始竞争。
37℃0.5h
（4）洗板
（5）加底物显色：每孔加100μL (在暗处操作)，然后放入湿盒内，当显色适当后，即0 ng/ml 孔OD490nm为1.2~1.5，而本底即完全抑制孔不超过0.1~0.2，( 两者之差为1左右) 。
每孔加入50μL 2~3 mol/L硫酸终止反应。
15-20min
比色：用标准曲线最高浓度孔调0，测定OD490nm
五、实验记录
1. 酶标板加样记录
表1 酶标板加样图
2. 测定标准曲线
表2 不同浓度标样激素测定值
2000 1000 500 250 125 62.5 31.25 0
0 0 0.42
0.45
0.36
0.47
0.60
0.62
0.75
0.71
0.92
0.87
0.82
0.98
0.98
0.98
4. 实验结果记录
表3 样品测定结果
5. 实验结果
ABA含量（ng/ml）对照玉米盐胁迫玉米
玉米根部1 玉米根部2 平均值363.937
583.571
363.937
697.229
583.571
638.756
玉米茎尖1 玉米茎尖2 平均值583.571
824.976
697.229
1252.317
583.571
871.045
实验结果对照玉米盐胁迫玉米
玉米根部1 玉米根部2 平均值0.78
0.78
0.78
0.68
0.71
0.695
玉米茎尖1 玉米茎尖2 平均值0.71
0.57
0.64
0.65
0.71
0.68
六、实验结果计算或分析：
ABA可作为植物发育的重要调节物质，如促进休眠、促进气孔关闭、抑制生长、促进离层的形成进而引起器官脱落等；ABA也可作为触发植物对逆境胁迫应答反应的传递体，参与调控植物对逆境胁迫，如干旱、高盐、低温等产生的应答。
业已证明，脱落酸（abscisic acid，ABA）是传递胁迫信息（如盐胁迫等）的重要信使，能够增强植物体对多种逆境的抵抗能力。
有报道表明受到较严重的水分胁迫时，不仅在田间葡萄各营养器官中均发现ABA的积累，而且在“全球红”葡萄试管苗上也发现ABA含量急速上升，还有报道表明盐胁迫下辣椒内源ABA含量迅速增加。
ABA的增加可诱导某些酶的重新合成而增加植物的抗冷性、抗涝性和抗盐性。
本实验表明盐胁迫下ABA的含量比正常条件下增加，说明ABA 对植物抵御盐胁迫有重要作用。