第十三章双水相萃取
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萃取技术—双水相萃取技术(药物分离纯化课件)
内侧流 外侧 分配 萃取物
体 流体 系数
细胞色素 C 磷酸盐 PEG 0.18 肌红蛋白 磷酸盐 PEG 0.009 过氧化氢酶 磷酸盐 PEG 0.12 尿激酶 磷酸盐 PEG 0.65
内侧流 速,cm/s
16.3 4.0 16.3 16.3
外侧流 传质系 速,cm/s 数,cm/s
6.6 5.5?0 -6 5.0 7.5?0 -7 5.0 2.8?0 -5 5.0 2.0?0 -4
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
1.双水相萃取的应用
双水相分离条件 （1） 目的分子与细胞应分配在不同的相 （2） 分配系数应足够大 （3） 离心机容易分离
双水相萃取的应用
分离物质
举例
体系
NaDS-硫酸葡聚糖
酶 核酸 生长素 病毒 干扰素
细胞组织
过氧化氢酶的分离 分离有活性核酸DNA 人生长激素的纯化 脊髓病毒和线病毒纯化 分离β－干扰素
双水相萃取的应用--双水相萃取技术（萃取技术）
2.双水相萃取分离技术的发展方向 （1）廉价双水相体系的开发
优点： (1)蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到15％以前没有沉淀，但在PEG浓度大于
5％时，溶解度显著地减小，在盐溶液中的溶解度更小。 (2)粘度小。PPT的粘度是粗dextran的1/2,传质好。 ⑶价格便宜。PPT几十$/kg,粗dex几百$/kg
系线
TMB：系线连接双节线上两点的 直线。
在临界点处，分配系数为1
临界点
药物分离与纯化技术课程
3．双水相相图
系线反映的信息:
(1)系线长度：衡量两相间相对差别的尺度。越长则两相间性质差 别越大，反之则越小；趋向于零时，（双节线上的点，临界点）， 两相差别消失，成为均一相。
双水相萃取详细资料
三步两水相萃取酶的流程：
细胞匀浆液
第一步双水相萃取
+PEG +盐（或是葡聚糖）
分离机
下相 ） 细胞碎片
杂蛋白 （核酸、多糖）
上 相（PEG相
（目标产物）如prot、E +盐
第二步双水相萃取 静置分层
下 相（盐相） 核酸多糖
上 相（PEG相） 目标产物
杂蛋白
（亲水性较强）
+盐
第三步双水相萃取 静置分层
分子间作用力与熵增加相比占主导地位。
➢ 作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上、下两相。
➢ 作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚 物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。
➢ 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形
成均相的高聚物水溶液
• 聚合物的不相容性：两种聚合物分子间存在斥力，在 达到平衡后，分成两相，两种聚合物分别进入到一相 中。
优点：1.与固定床反应器相比，不需载体，不存在多孔载体中的 扩散阻力，故反应速度快，生产能力较高；2.生物催化剂在两水 相系统中教稳定；3.两相间表面张力低，轻微搅拌即能形成高度 分散的系统，分散相液滴在10μm一下，有很大的表面积，有利于 底物和产物的传递。
PEG系统中细胞碎片分配到下相中较容易 分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐（有时也可 加入适量的PEG），尽兴第二次双水相萃取，以除去多 糖和核酸，它们的亲水相较强因而容易分配在盐相中， 而蛋白质就留在了PEG相中；在第三步萃取中，应该使 蛋白质分配在盐相中（例如：调节pH），以使和主体 PEG分离。色素由于其疏水性，通常分配在上相。主体 PEG可循环使用，而盐相蛋白质则可用超滤方法去除残 余的PEG以提高产品的纯度。
双水相萃取
双水相萃取黄酮类化合物研究进 展
一．双水相萃取分离纯化黄芩苷 二．双水相萃取分离纯化葛根素 三．双水相萃取分离纯化其他黄酮类化合物
双水相萃取分离纯化黄芩苷
• 黄芩苷：是黄芩的主要有效成分, 具有抗 炎、抗菌、解热、降压、利尿、利胆、保 肝以及调节免疫等作用。
•
利用聚乙二醇( PEG)/K2HPO 4 水相体系对黄
双水相萃取分离纯化其他黄酮类化合物
• 萃取分离测定桑叶和绞股蓝茶中中的芦丁 • 萃取分离测定柿叶黄酮 • 双水相萃取橙皮苷 • 双水相体系萃取分离杜仲黄酮 • 双水相体系中纯化山楂叶中黄酮类物质
• 总之，利用双水相萃取均能取得了较好的效果和 较高的产物得率。
双水相萃取的发展方向
• 廉价高聚物体系 • 新型功能双水相体系 • 高速逆流双水相色谱 • 双水相电泳
双水相萃取存在的问题
• 双水相萃取是一项可以利用不复杂的设备, 并在温和条件下进行简单的操作就可获得较高收 率和有效成分的新型分离技术。但在应用和研究 过程中仍存在着易乳化、成相聚合物的成本较高、 水溶性高聚物大多数粘度较大、不易定量控制、 高聚物回收困 难等技术难题。虽然双水相萃取 存在以上一些问题, 但双水相萃取技术在黄酮类 化合物的分离纯化中都取得了较好的效果, 有望 成为一种新型的黄酮类化合物的分离纯化方法。
双水相的种类
常见的能形成双水相体系的高聚物有聚乙二醇 (PEG)、聚丙二醇、甲基聚乙二醇、聚乙烯醇、聚 乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素 、葡聚糖、聚丙基葡聚糖、羟丙基葡聚糖、聚蔗 糖, 无机盐有硫酸钾、硫酸铵、草酸钠、磷酸钾等 。
双水相萃取特点
① 两相的溶剂都是水 ,上相和下相的含水量 高达70%～90% ,不存在有机溶剂残留问 题。
双水相萃取的原理及应用课件
双水相萃取的原理及应用
ATPE 的历史：
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ATPE 的历史：
1956年瑞典lund大学的 Albertsson教授及其同事开始 对双水相系统进行比较系统研 究。测定了许多双水相系统的 相图，为双水相萃取系统的发 展奠定了基础。只局限于实验 室内的测定和理论研究。
双水相萃取的原理及应用
ATPE 的历史：
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ATPE 的历史：
Kula教授研究小组对双水相 的应用、工艺流程、操作参数、 工程设备、成本分析等进行了 大量研究，在应用上获得成功。 1978年首先将双水相萃取技术 用于酶的大规模分离纯化。
双水相萃取的原理及应用
ATPE 的历史：
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ATPE 的历史：
双水相萃取可分离多肽、蛋 白质、酶、核酸、病毒、细胞、 细胞器、细胞组织，以及重金 属离子等，近年来，还应用于 一些小分子，如抗生素、氨基 酸和植物的有效成分等的分离 纯化。作为反应系统用于酶反 应，生物转化，发酵的产物生 产与分离的集成。
特别是成功地应用在蛋白质的大规模分离中。
双水相萃取的原理及应用
ATPE 的基本原理
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ATPE 的基本原理:
双水相萃取与 水-有机相萃取的 原理相似,都是依 据物质在两相间 的选择性分配。
双水相萃取的原理及应用
ATPE 的基本原理
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ATPE 的基本原理:
当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后, 由于表面性质、电荷作用和各种作用力(如憎水键、 氢键和离子键等) 的存在和环境因素的影响,使其在 上、下相中的浓度不同。
双水相萃取的原理及应用
Aqueous two-phase extraction
2014210918 康文渊
双水相萃取的原理及应用
生物分离工程-双水相萃取
358.33±9.06 350.64±8.20
1000g体系 531.97±6.89 13.17±0..41±7.66
异丙醇/硫酸铵双水相体系直接萃取发酵液中2,3-丁二醇
表4.1 在10 g体系中双水相直接萃取发酵液
No. K2,3-BD Kacetoin Kglucose
2 双水相体系的系线和相图的制作
在双水相体系组成成分确定以后,首先要配制双水相
体系, 而双水相体系的配制依据是体系的相图, 所以, 在配制双水相体系以前应先把该体系的相图(包括系线) 制作出来 以 PEG/(NH4)2SO4 体系为例: 从 PEG/(NH4)2SO4 的量可得出体系组成的质量分数,混合分相后,测出上相 和下相中PEG、(NH4)2SO4的含量, 由此可得到3个点即加 料点、上相点和下相点,然后调整PEG或(NH4)2SO4的量,重 将得到的所有的上相点和下相点在坐标图上用光滑曲线 连接起来组成双节曲线,而每1次的加料点、上相点和下 相点的连线则为系线。
聚丙二醇
甲基聚丙二醇 聚乙二醇 聚乙烯醇 聚乙烯吡咯烷酮 羟丙基葡聚糖 葡聚糖 聚乙烯醇
聚乙二醇
聚乙烯吡咯烷酮 葡聚糖 聚蔗糖
聚乙烯醇
甲基纤维素
或
羟丙基葡聚糖
聚乙烯咯烷酮 葡聚糖
甲基纤维素 羟丙基葡聚糖 葡聚糖
聚合物1
聚合物2或盐
乙基羟乙基纤维素 葡聚糖
羟丙基葡聚糖
葡聚糖
聚蔗糖
葡聚糖
聚丙二醇 甲氧基聚乙二醇 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷
4）外加电场的影响
当在两相分界的垂直方面上加上电场时由于 电位差增加而使分配系数发生改变 如用PEG8000 /DextranＴ 500体系分离肌红蛋白,在外加48.1 Ｖ/cm的电场强度40 min后,分配系数Ｋ从0.81变 为38.7,上相回收率从44.7%增高到98.0% 。
双水相萃取
葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系
双水相萃取
(Aqueous Two Phase Extraction)
因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两 相中水分都占很大比例(85％一95％)，活性蛋 白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同 比例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中 蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂 的缺点。
PEG = 聚乙二醇(polyethylene glycol) Kpi = 磷酸钾 DX= 葡聚糖(dextran)
双水相体系形成的原因
1. 双水相体系的成因是聚合物之间的不相溶性，即 聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透， 具有相分离倾向，一定条件下分成两相(aqueous two-phase system, ATPS) 。一般认为，只要两 种聚合物水溶液的水溶性有所差异，混合时就可 发生相分离，并且水溶性差别越大，相分离的倾 向越大。
一些无机离子的分配系数
正离子 K＋ Na＋ NH4＋ Li＋
分配系数K＋ 0.824 0.889 0.92 0.996
负离子 I－ Br－ Cl－ F－
分配系数K－ 1.42 1.21 1.12 0.912
无机盐的影响
pH6.9溶菌酶带正电， 卵蛋白带负电
U2-U1>0
4. 温度的影响
一般都可在室 温下操作。而 且室温时粘度 较冷却时低， 有助于相的分 离并节约了能 源开支。
水系 数 减
水解程度的影响
易一 集般 中来 于说 低， 分蛋 子白 量等 相高
分 子 量 物 质
2. pH的影响
pH会影响蛋白质中可离解基团的离解度，因而改 变蛋白质所带电荷和分配系数；另外，pH还影响 系统缓冲物质磷酸盐的离解程度，从而影响分配 系数。
双水相萃取
(Aqueous Two Phase Extraction)
因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两 相中水分都占很大比例(85％一95％)，活性蛋 白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同 比例分配于两相，这就克服了有机溶剂萃取中 蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂 的缺点。
PEG = 聚乙二醇(polyethylene glycol) Kpi = 磷酸钾 DX= 葡聚糖(dextran)
双水相体系形成的原因
1. 双水相体系的成因是聚合物之间的不相溶性，即 聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透， 具有相分离倾向，一定条件下分成两相(aqueous two-phase system, ATPS) 。一般认为，只要两 种聚合物水溶液的水溶性有所差异，混合时就可 发生相分离，并且水溶性差别越大，相分离的倾 向越大。
一些无机离子的分配系数
正离子 K＋ Na＋ NH4＋ Li＋
分配系数K＋ 0.824 0.889 0.92 0.996
负离子 I－ Br－ Cl－ F－
分配系数K－ 1.42 1.21 1.12 0.912
无机盐的影响
pH6.9溶菌酶带正电， 卵蛋白带负电
U2-U1>0
4. 温度的影响
一般都可在室 温下操作。而 且室温时粘度 较冷却时低， 有助于相的分 离并节约了能 源开支。
水系 数 减
水解程度的影响
易一 集般 中来 于说 低， 分蛋 子白 量等 相高
分 子 量 物 质
2. pH的影响
pH会影响蛋白质中可离解基团的离解度，因而改 变蛋白质所带电荷和分配系数；另外，pH还影响 系统缓冲物质磷酸盐的离解程度，从而影响分配 系数。
双水相萃取
3、双水相萃取过程 、 双水相萃取过程包括：双水相的形成、溶质在双水相中的分配、 双水相萃取过程包括：双水相的形成、溶质在双水相中的分配、 双水相的分离、聚合物的回收、盐的回收。 双水相的分离、聚合物的回收、盐的回收。 在实际操作中，经常将固状（或浓缩的） 在实际操作中，经常将固状（或浓缩的）聚合物和盐直接加入 到细胞匀浆中，同时进行机械搅拌使成相物质溶解，形成双水相； 到细胞匀浆中，同时进行机械搅拌使成相物质溶解，形成双水相； 溶质在两相中发生物质传递，达到分配平衡； 溶质在两相中发生物质传递，达到分配平衡；两相可在离心机中分 如碟片式离心机可将两相分别从不同的出口排出。 相，如碟片式离心机可将两相分别从不同的出口排出。 如果产品是蛋白质，且分配在盐相，则可在错流操作方法下， 如果产品是蛋白质，且分配在盐相，则可在错流操作方法下，用 超滤或渗析的膜过滤回收盐及得到较浓的蛋白质溶液； 超滤或渗析的膜过滤回收盐及得到较浓的蛋白质溶液；若蛋白质在 PEG中，可通过加入盐使蛋白质重新分配到盐水中，或用膜来进行 中 可通过加入盐使蛋白质重新分配到盐水中， 蛋白质和PEG的分离。其他方法如离子交换和吸附、电泳等也可用 的分离。 蛋白质和 的分离 其他方法如离子交换和吸附、 于成相物质的回收及蛋白质的分离。 于成相物质的回收及蛋白质的分离。
（4）pH值的影响 ） 值的影响 对于有相间电位的萃取， 值 对于有相间电位的萃取 ， pH值 影响蛋白质的带电情况， 影响蛋白质的带电情况 ， 从而对萃 取产生影响；其次pH值影响磷酸盐 取产生影响；其次 值影响磷酸盐 的解离（ 磷酸盐体系） 的解离（ 如 PEG/磷酸盐体系）， 因 磷酸盐体系 而影响相间电位和蛋白质的分配系 数；pH值亦可改变蛋白质自身结构 值亦可改变蛋白质自身结构 和性质，改变萃取结果。 和性质，改变萃取结果。 例如 ： 溶菌酶和卵蛋白的分离 体系中加入NaCl， 当 ， 在 PEG/Dex体系中加入 体系中加入 ， pH值为 时溶菌酶带正电，卵蛋白 值为6.9时溶菌酶带正电 值为 时溶菌酶带正电， 带负电， 从表11.8可知 ， 上相聚集 可知， 带负电 ， 从表 可知 了较多的氯离子， 了较多的氯离子 ， 下相聚集了较多 的钠离子， 的钠离子 ， 因此带正电的溶菌酶大 量迁移到上相，而卵蛋白则相反。 量迁移到上相，而卵蛋白则相反。 （5）温度的影响 ） 温度对分配系数的影响较小，操作在常温下进行。 温度对分配系数的影响较小，操作在常温下进行。PEG对蛋白质具有 对蛋白质具有 稳定作用，常温下蛋白质一般不会失活或变性。 稳定作用，常温下蛋白质一般不会失活或变性。
萃取分离技术
2
• 只要两种聚合物水 溶液的水溶性有所 差异，混合时就可 发生相分离，并且 水溶性差别越大， 相分离倾向也就越 大
• 某些聚合物的溶液在与 某些无机盐等低分子质 量化合物的溶液相混时， 只要浓度达到一定值， 也会产生两相。其形成 机理是由于盐析作用
1
3
双水相萃取原理
0.39%葡聚糖 0.65%甲基纤维素 98.96%水 1.58%葡聚糖 0.15%甲基纤维素 98.27%水
具有气体相似的渗透能力，SCF较容易滲透入基体，大大提 高了萃取的效率。
超临界流体萃取的基本原理
作为溶剂的超临界流体与被萃取物料接触， 使物料中的某些组分(称萃取物)被超临界流体溶 解并携带， 从而与物料中其他组分 （萃余物)分 离， 之后通过降低压力或调节温度， 降低超临界 流体的密度， 从而降低其溶解能力， 使超临界流 体解析出其所携带的萃取物， 达到萃取分离的目 的。
超临界流体萃取的流程图：
CO2超临界流体萃取
CO2的临界温度为31.06 ℃，临界压力为7.39 MPa，临界条 件容易达到； 化学性质不活泼，无色、无味、无毒，安全性好； 价格便宜，纯度高，容易获得。 在天然产物提取中， CO2超临界流体可以有效地防止热敏性 物质的氧化和逸散，完整保留生物活性，且能把高沸点，低 挥发性、易热解的物质在沸点温度以下萃取出来； 原料中的重金属、无机物、尘土等都不会被二氧化碳溶解带 出，真正做到“绿色萃取”； CO2是非极性化合物，在超临界状态下对脂类化合物的萃取 是非常适合的，但对极性化合物的萃取效果就不理想。
谢谢
3、双水相体系中的 传质和平衡速度快 , 回收率高 ,分相时间 短 ,传质过程和平衡 过程速度均很快
6、大量杂质能够 与所有固体物质一 起去掉，使整个分 离过程更经济
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第三节 影响双水相萃取的因素
形成相系统的高聚物分子量和化学性质、被分配物质的大小 和化学性质对双水相萃取都有直接影响。
1、成相高聚物浓度－界面张力
位于临界点附近的相系统，细胞粒子可完全分 配于上相或下相，此时不存在界面吸附。 一般：高聚物浓度增大，系统组成偏离临界点， K>1或<1。 高聚物浓度增大，界面吸附增强。细胞粒子向 界面转移，可能完全转移至另一相，主要依赖 于它们的表面性质。
4、生物亲和分配：
成相高聚物偶联生物亲和配基后，对生物大分子的 分配系数影响很显著。
5、疏水效应
一般情况下，蛋白质的表面存在疏水区，疏水区所 占比表面越大，其疏水性越强，不同组分由于其 表面疏水性的差异使得其各自在上下相中产生相 应的分配平衡。
6、温度及其他（通气、搅拌）
作业
名词解释：双水相萃取技术、 影响双水相萃取的因素有哪些？
第十三章 双水相萃取
第一节 概述
传统萃取法：有机溶剂萃取；蛋白质易失活；部 分蛋白质具较强亲水性，不溶于有机溶剂。 双水相萃取法：利用物质在互不相溶的两水相间 分配系数的差异来进行萃取的方法。 主要有两大类： 1、聚合物—聚合物—水系统：聚合物分子在空间 阻碍作用使相互间无法渗透，从而在一定条件下 特点：能保留产物活性，操作可连续化，在去除细胞 分为两相。 碎片方面比过滤、离心方法优越得多。 2、聚合物—无机盐——水系统：主要是由于盐析 应用：酶的中间规模分离，小分子生物活性物质分离。 作用，只要浓度达到一定值之后，也会产生两相。
2、成相高聚物的分子量
一般原则：同种高聚物分子量减小，将有利于萃 取物在低分子高聚物一侧的分配。 当高聚物浓度、盐浓度、温度等其他条件保持不变时， 被分配的蛋白质易为相系统中低分子量高聚物所吸引， 而易被高分子量高聚物所排斥。
选择相系统时，可改变成相高聚物的分子 量以获得所需的分配系数。
3、电化学分配－盐类的影响：
一、水溶性高聚物相系统
当两种高聚物水溶液相互混合时，按其相 互作用可分为三类： 互不相溶：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上下两相。 复合凝聚：形成两个水相，但两种高聚物 都分配于一相，另一项几乎全部为溶剂水。 完全互溶：形成均相高聚物水溶液。相萃取的基本概念
溶质在两水相间的分配主要由其表面性质决定， 通过在两相间的选择性分配得以分离。
双水相萃取时，盐对带电大分子的分配影响很大。 生物大分子的分配主要决定于离子的种类和各种 离子间的比例。 应用：PEG-Dextran双水相系统中，离子组分的 变化可使不同核酸从一相转移到另一相。 应用：从细胞匀浆中除去核酸和细胞碎片。 系统中加入0.1mol/L氯化钠可使核酸和细胞碎片 转移到下相，产物酶位于上相，分配系数0.1~1.0. 如氯化钠浓度增大到2~5mol/L，几乎所以蛋白质、 酶都转移到下相，上相富含核酸。
Ct、Cb：被萃取物 质在上下相的浓度。
分配系数（K）：溶质在两水相间分 配能力的大小。
K=Ct/Cb
K与溶质的浓度和相体积比无关，主要取决于相 系统的性质，被萃取物的表面性质和温度。 分配系统由多种因素决定：粒子大小、疏水性、 表面电荷、粒子或大分子构象等。
三、相图p259
两相区
均相区
系线长度是衡量两相差别的尺度