实验一 抗体的制备及效价检测
抗体制备及效价测定讲义
抗体制备及效价测定讲义实验一、兔抗人IgG制备一、实验材料1．实验动物：健康雄性家兔1只；2．抗原：纯化人IgG lmg；3．实验试剂：完全福氏佐剂（CFA），不完全弗氏佐剂（IFA），0.01M PBS（8 g NaCl，0.2 g KCl，2.9 g Na2HPO4.12H2O，0.2 g KH2PO4，以NaOH调节pH至7.2，加双蒸水至1000 mL），普鲁卡因溶液，肾上腺素，硫柳汞，叠氮钠。
4．实验用具：2.5mL、5mL注射器，10mL无菌小烧杯，塑料静脉插管，5mL无菌冻存管，250mL 无菌三角瓶，50mL无菌尖底离心管。
二、操作步骤1．抗原制备：将纯化的人IgG用0.01M PBS（pH7.2）或生理盐水稀释成lmg/mL，加入等体积无菌CFA或IFA 至5mL无菌冻存管中，置于超声波破碎仪上，粉碎头浸入液面下0.5-0.8 cm，离瓶底距离0.5 cm左右，以免打碎玻璃瓶，抗原置冰上，每次乳化10-15秒，间隔1分钟左右，反复乳化3-4次即。
将乳化剂滴入冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。
2．家兔免疫：（1）家兔捉拿方法：一只手抓住兔的颈部皮毛，将兔提起，用另一只手托其臀，或用手抓住背部皮肤提起来，放在实验台上，如图1：图1 家兔的捉拿方法（2）初次免疫：在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处选择6-10处免疫接种点，采用肌内、皮下或皮内注射，每点注射上述乳化人IgG抗原0.2mL。
（3）二次免疫：第一次免疫后间隔2周再以lmg/mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。
（4）三次免疫：第二次免疫后间隔1周再以lmg/mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。
（5）终末免疫：第三次免疫后间隔1周再以lmg/mL人IgG抗原加等体积IFA乳化后于后腿肌肉或背部皮下多点加强免疫。
抗体制备方法
第1章 抗体制备技术抗体（antibody，Ab）是机体B淋巴细胞受到抗原刺激后所产生的特异性球蛋白，故亦称为免疫球蛋白。
机体初次接触抗原后，激发机体产生的特异性抗体亲和力低、持续时间短；而当同一抗原再次刺激机体后，则能产生高亲和力、高效价、持续时间长的抗体。
由于抗体能与相应的抗原发生特异性结合反应，因此特异性抗体是免疫学实验中常用的试剂，不仅对于抗原的分析鉴定和定量检测极为重要，而且广泛应用于临床疾病的诊断、治疗和预防中。
在免疫学检测中应用的主要抗体是多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体常用免疫动物的方法获得，而单克隆抗体则采用杂交瘤技术制备。
本章主要介绍这两种抗体的制备方法。
实验一 多克隆抗体的制备多克隆抗体（polyclonal antibody）是机体针对抗原的不同表位所产生的抗体混合物。
是用制备的纯化免疫原按照一定的免疫程序接种给所选择的动物，在含有多种抗原表位的抗原刺激下，该动物体内多个B细胞克隆被激活并产生针对这种抗原多种不同表位的抗体混合物。
含有这些特异性抗体的动物血清称为免疫血清或抗血清，而从免疫血清中纯化的免疫球蛋白则称为抗体。
一、抗体制备的流程优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的纯度和免疫原性，动物的应答能力以及免疫程序（如免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因素）。
因此制备高质量的抗体必须具备理想的免疫原、适宜的动物和切实可行的免疫方案。
（一）免疫动物的选择免疫用的动物主要为哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、豚鼠及小鼠等。
选择动物要依据抗体制备的条件而定。
1．抗原与动物的种系 抗原的来源与免疫动物之间种系关系越远，其抗原免疫原性越强，越易产生免疫应答；反之，种系关系越近，则抗原免疫原性越弱。
如用鸡球蛋白免疫亲缘关系较近的鸭或鹅，则免疫原性较差。
2．动物的个体状况 动物的年龄与健康状况可影响产生抗体的效价，年龄太小者易产生免疫耐受，而年老体衰者免疫应答能力低下，不易产生高效价的抗体。
实验一-抗体的制备及效价检测
实验一抗体的制备—动物的免疫一、实验目的了解免疫的原理，掌握免疫制备抗体的方法。
二、实验原理机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫和细胞免疫的过程。
一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构---抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。
当上述两个条件具备时，抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。
抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。
佐剂的使用能够延长抗原在体内的存留时间，增加可溶性抗原的免疫性。
氢氧化铝可作为免疫佐剂加强免疫。
三、实验步骤1．动物的选择：选择2-3个月以上的小鼠。
免疫作好标号。
分笼饲养。
2. Al(OH)3的制备，4.84克AlCl3溶于50ml无菌蒸馏水充分溶解，2.4克氢氧化钠溶解在于50ml无菌蒸馏水充分溶解，混合充分反应后，得到约16mg/mL的氢氧化铝悬浊液。
分别倍比稀释得8mg/mL和4mg/mL的氢氧化铝悬浊液2．抗原和佐剂混合抗原吸附剂的制备：将20mg抗原（卵清蛋白）溶解在20mL 的生理盐水中，稀释为1 mg/ml，与Al(OH)3佐剂混合制成吸附混合物用于动物免疫。
取0.1mL抗原与0.1mL的Al(OH)3悬浊液混合吸附30min,得到含0.2mg/ml，0.4 mg/ml和0.8 mg/ml的Al(OH)3佐剂免疫混合物0.2ml用于腹腔注射免疫动物。
4．免疫方法：第一次免疫：A组：每只小鼠腹腔注射，0.2 ml（含0.2mg/ml Al(OH)3免疫混合物）。
B组：每只小鼠腹腔注射，0.2 ml（含0.4mg/ml Al(OH)3免疫混合物）C组：每只小鼠腹腔注射，0.2 ml（含0.8mg/ml Al(OH)3免疫混合物）第二次免疫：（第一次免疫后1周）A组：每只小鼠腹腔注射，0.2 ml（含0.2mg/ml Al(OH)3免疫混合物）。
第03章抗体制备
第三节 多克隆抗体的制备及应用
一、免疫动物的选择
抗原与动物种属之间的关系 动物的个体因素 抗原的性质与动物种类 抗体的用量和要求
IgY有如下几方面的优点
无需采血，只需收集免疫母禽产下的禽蛋即可提取 抗体；
使用少量的抗原免疫禽类既可获得大量的质量均一 的特异性IgY；
噬菌体抗体库主要工作流程
从外周血或其他免疫组织器官克隆出全套抗体基因菌体表达，构建全部Ig cDNA的噬菌体抗体库。
筛选含有目的Ig表达的噬菌体。 建立目的Ig表达的噬菌体抗体库。 扩增制备噬菌体抗体。 纯化抗体。
噬菌体抗体库技术的主要特点
IgY抗体耐酸、耐热，经巴氏消毒后活性依然存在， 因此容易保存和运输；
由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免 疫球蛋白之间不会发生交叉反应；
IgY不激活哺乳动物的补体系统，不与类风湿因子或 Fc受体相结合，避免在免疫检测过程中产生假阴性或假阳 性结果；
IgY对哺乳动物抗原的敏感性高。
二、抗原剂量的选择
四、采血方法
颈动脉放血法 静脉采血法 心脏采血法
五、抗血清鉴定及保存
抗体效价和纯度的测定 抗体特异性的鉴定 抗体亲和力的鉴定 抗血清的保存
六、抗体的纯化
IgG类抗体的纯化：盐析法粗提γ-球蛋白、离子交换 层析提取IgG、亲和层析法。
特异性抗体的纯化：亲和层析法、吸附法
七、多克隆抗体的特性和应用
用于某些疾病的紧急预防，例如破伤风和Rh不合的 新生儿溶血症等。
用于某些感染性疾病和移植排斥反应等的治疗。 应用于某些疾病的临床检验。 在科研中常用于免疫印迹和免疫组化等。
第四节 单克隆抗体的制备及应用
抗体效价检测步骤
抗体效价检测步骤抗体效价检测是一种用于确定特定抗体在溶液中的浓度的测试方法。
制定抗体检测方案的目的是为了发现一些疾病或病菌感染后体内的抗体水平，以便给这些人提供更好的诊断和治疗方案。
抗体检测可以帮助诊断多种疾病和监测免疫应答。
抗体效价检测的步骤：1. 确定抗原：首先，需要选择与所检测试物一致的合适抗原。
可以是病原体中的某个蛋白质、脂多糖、多糖等化合物。
2. 制备样品：接下来，需要制备出一定浓度的抗原，然后制备一定浓度的粗抗血清作为实验对象，这里抗血清就是被免疫动物或人的血清。
3. 设置不同浓度的样品和抗体：设置一系列不同浓度的测定样品和一定浓度的抗体，一般会先制作含有较多抗体的肯定样品和不含抗体的阴性对照样品。
4. 混合样品和抗体：添加不同浓度的抗体到不同浓度的抗原溶液中或在不同浓度的抗原中加入相同浓度的抗血清，稀释一定倍数（常用2倍）后，把稀释完后的溶液混合均匀。
5. 反应：将混合物加入试剂板中，以促使抗体与抗原结合并发生反应，在一定的条件下，让其反应一定的时间（常用30分钟到数小时）。
6. 洗涤：去掉未结合的物质，洗刷试管或板，这是为了减少误差，使试验结果更加可信。
7. 加入检测酶标记二抗：在试管或板中加入检测酶标记的二抗，这通常是一种抗体，其可与被检测抗体特异性结合。
8. 再次洗涤：去掉未结合的物质，称为第二次洗涤。
9. 加入底物：加入相应的酶底物，以促使反应物下一步的曝光和输送。
10. 停止反应：反应一定时间（通常为10–30分钟），使颜色发生变化，这里会加入用于停止反应的酸或酵素抑制剂。
11. 测定结果：测定反应颜色的浓度，以反映所检知物的含量，从而确定抗体效价，也就是可以得到测量结果，用来确定抗体的水平。
抗体效价检测是一种非常重要的诊断方法，它可以帮助医生和研究人员快速探讨细菌和疾病的数量变化，进而制作出更有效的治疗和疫苗。
抗体效价检测步骤
抗体效价检测步骤抗体效价检测是一种常用的方法，用于评估抗体样品的质量和活性。
该检测可以确定抗体样品中所含抗体的浓度以及其与靶标结合的能力。
以下是抗体效价检测的一般步骤：1. 制备样品和控制组：首先需要准备抗体样品和相应的阳性和阴性对照物。
阳性对照物是对于靶标已知有高亲和力的抗体样品，而阴性对照物则是不包含任何抗体的样品。
2. 稀释样品：将抗体样品进行连续稀释，通常从高浓度开始，以便确定抗体效价的范围。
每一次稀释应按照一定比例进行，如1:2或1:10等。
3. 设置试验板：将稀释好的抗体样品、阳性和阴性对照物，以及含有靶标的试验物添加到试验板中的孔中。
每个样品应设置多个孔，以获得平均效价。
4. 孵育：将试验板置于孵化器中，在适当的温度和时间下进行孵育。
这有助于抗体与靶标结合，并形成固定复合物。
5. 洗脱：将试验板的孔洗脱干净，以去除未结合的抗体。
这可以通过重复洗涤孔中添加和去除缓冲液来实现。
6. 反应：加入检测抗体，这是一种能与固定复合物中的抗原结合的二抗。
检测抗体通常被标记，以便进行可视化。
典型的标记物包括酶，如辣根过氧化物酶（HRP），或荧光染料，如荧光素等。
7. 反应孵育：将试验板放回孵化器中，在合适的温度下进行孵育。
这有助于检测抗体与固定复合物结合，并形成更大的复合物。
8. 洗脱：类似于步骤5，洗涤试验板的孔，以去除未结合的检测抗体。
9. 可视化：根据检测抗体的标记物，对于酶标记的检测抗体可以加入亮色底物，并观察色素的产生。
对于荧光标记的检测抗体，则可以在荧光显微镜下直接观察发光信号。
10. 数据分析：根据样品和对照组的可视化结果，测定抗体效价。
通常使用半最大抗体效价（EC50）来表示抗体效价，即抗体浓度在50%时与靶标结合。
抗体效价检测是一个常见的实验技术，它在抗体研究和生物医学领域有着广泛的应用。
通过正确执行上述步骤，可以准确地确定抗体样品的效价和活性，进一步支持科研和临床应用。
血清抗体效价的测定
实验报告
10.选择波长630nm，将酶标板置于载板台上，开始扫描，测定OD值。
结果如下所示：
思考题：
1.查阅资料，了解共有哪些类型的ELISA实验，以及本实验中所用ELISA属于哪一类？答：本实验中所用ELISA属于间接法ELISA。
①直接ELISA
原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进行孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要用于测定抗原。
②间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标二抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显色。
③双抗夹心法ELISA
原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。
将特异。
抗体效价测定操作规程
抗体效价测定操作规程 Hessen was revised in January 2021抗体效价测定操作规程操作步骤：一．IgG类1.IgG类抗体效价滴定，须取适量血清200μL加等体积2—Me溶液混合，封口，置37℃水浴箱作用60分钟，先稀释血清：200L病人血清600L生理盐水备用，排列6支试管按顺序编号。
第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，在第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。
这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256。
2.加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2％相应红细胞悬液200L，混匀。
（如待检血清抗体为抗A，则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B，则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B，则倍量稀释两份血清，一份加入A型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；）3.先直接观察离心结果，之后在每管分别加入凝聚胺试剂盒中的R1液3d，混合30S均匀后，在各加R2液2滴，操作方法同凝聚胺交叉配血法，然后判读结果。
通常以肉眼观察到的第一个“±”的凝集管作为判断的终点，终点血清稀释度的倒数为效价（Titer），或称滴度。
二．IgM1.血清连续倍量稀释法先稀释血清：100L病人血清+700L生理盐水备用，排列6支试管按顺序编号。
第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。
这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256。
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实验一抗体的制备及效价检测
实验目的：本实验是单克隆抗体技术的免疫阶段的过程，为单克隆抗体技术提供免疫淋巴细胞。
了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术，掌握双向免疫扩散法测定抗体的效价。
一．实验原理
机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫和细胞免疫的过程。
一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构---抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。
当上述两个条件具备时，抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。
抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。
完全福氏佐剂的使用能够延长抗原在体内的存留时间，增加可溶性抗原的免疫性。
通常制备抗体时常用完全福氏佐剂加强免疫。
抗原、抗体在合适的浓度和比例条件下，抗原和其相应的抗体在有固相支持的液相环境中各自发生扩散。
分子双向扩散接触时形成肉眼可见的沉淀线反应。
抗体的效价即时指与固定浓度的抗原发生沉淀反应时所需的最小抗体浓度。
二．实验步骤
1．动物的选择：选择2-3个月以上的小鼠。
免疫作好标号。
分笼饲养。
2．抗原的选择：将抗原（纤维素酶）稀释为4 mg/ml，即可与佐剂混合制成乳剂用于动物免疫。
3．佐剂和抗原乳剂的制备
佐剂完全福氏佐剂：轻矿物油（石腊油）8.5 ml；羊毛脂1.5 ml；灭活结核杆菌10 mg。
抗原乳剂制备（1）油剂：矿物油和羊毛脂按比例混合，高压8磅20分钟灭菌后作为油剂，使用前微火融化。
（2）水剂：灭活结核杆菌1 mg/ml + 抗原4 mg/ml （均为终浓度）。
（3）油剂和水剂1：1混合。
混合方式：研磨或者注射器混合。
4．免疫方法：小鼠背部皮下多点注射，每点0.1ml。
第1次免疫：实验组小鼠加佐剂的抗原。
A组2只（1-2号）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。
B组4只（3-6号）：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml加佐剂的抗原乳剂。
第2次免疫：第3周实验组小鼠不加佐剂抗原。
A组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。
B组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml2mg/ml抗原液。
第3次免疫：第二次免疫后1周，实验组小鼠不加佐剂抗原。
A组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml磷酸缓冲液。
B组：每只小鼠背部、腋下多点注射，共计0.4 ml2mg/ml抗原液。
5．抗血清的制备
第3次免疫一周后，眼眶取血或心脏取血。
收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。
在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2ml），贮于-40℃以下冰箱，或冻干后贮存于4度冰箱保存。
6．抗体的效价检测：双向免疫扩散法。
琼脂凝胶板的制备：胶布包围一片载玻片使之形成不透水的槽，或在培养皿中。
用生理盐水加热溶解琼脂配成1%溶液，均匀浇注于玻片内。
注意勿产生气泡，琼脂厚度约2.5mm 。
打孔：待琼脂凝固后，用去尖头的吸头（直径约为3-4mm ）在凝胶上打孔，孔间距为3-5mm 。
在小孔中加少量加热的液体琼脂，防止渗漏。
打孔样式为梅花样，如图
加样：加样于孔内，左中间孔为抗原；右中间孔为无关抗原（牛血清白蛋白）；边孔为不同浓度的抗体（系列用生理盐水稀释的抗体1-1/2-1/4-1/8-1/16-1/32）。
注意不要外溢（加满为止）。
结果观察：加样完毕，将琼脂板平放于湿盒内，在室温或37 扩散18-24小时后，观察结果。
三．实验结果
四．结果讨论。