细胞培养-实验前准备
细胞培养步骤
花鲈肌肉和肝脏组织细胞原代培养1.细胞培养准备工作准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。
具体工作如下：一、清洗（1）常用器具：细胞培养瓶、细胞培养板、培养皿、广口瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、电子天平、纱布、脱脂棉、止血钳、镊子、解剖剪、解剖刀、解剖针、注射器、注射器过滤器、移液枪、枪头、离心管、细胞冻存管、酒精灯、试管架、超净工作台、倒置显微镜、生化培养箱、烘箱、液氮罐、封口膜、喷壶、以及洗刷用品等。
（2）玻璃器皿清洗：烧杯、量筒、玻璃棒、广口瓶（瓶盖不泡盐酸，清洗赶紧后直接高压灭菌）等玻璃器皿自来水刷洗，除去灰尘，烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
泡盐酸12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净，然后用蒸馏水冲洗干净后用烤箱烘干，高压灭菌，烘干备用。
（3）塑料器皿的清洗：细胞培养皿、培养板、培养瓶可以直接使用，进口枪头、进口离心管高压灭菌。
（4）金属制品的清洗：止血钳、镊子、解剖剪、解剖刀等先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。
放入铝制盒内包装好，高压灭菌，再烘干备用。
（5）棉织品：纱布和脱脂棉，高压灭菌，再烘干备用。
二、溶液配制（1）PBS：用电子天平准确称取NaCl /8.0 g，KCl /0.2 g，KH2P04/0.29 g，Na2HP04-12H20/ 1.42 g溶于800 mL的超纯水中，用玻璃棒搅拌至溶解后调节pH值为7.2～7.4，然后定容至1L。
置于高压灭菌锅中灭菌30min，冷却到室温后分装，于4℃冰箱冷藏备用。
等渗0.01MPBS（1X PBS）细胞培养用，用电子天平准NaCl/8.00g浓度为8/58.5=0.13675M，本配方主要靠NaCl，KCl/0.20g浓度为0.2/74.5=0.00268M，Na2HPO4·12H2O/2.90g浓度为 2.90/358= 0.0081M Na2HPO4·2H2O/1.44g浓度为 2.90/358=0.0081M，KH2PO4/0.24g浓度为0.25/136= 0.0019M，溶于800 mL的dddH2O，用玻璃棒搅拌至溶解，dddH2O定容至1000ml。
细胞培养过程中的注意事项及试剂配制
细胞培养过程中的注意事项及试剂配制一.常用设备准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。
配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。
培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。
必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO孵箱（孵育培养物）、2水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。
二.无菌操作无菌室的灭菌：1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。
2.CO孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者20.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75％酒精棉球擦净双手。
无菌操作的演示：1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。
如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。
三.器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：(1)新的玻璃器皿的洗消：1.自来水刷洗，除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
细胞培养操作步骤
细胞培养操作步骤细胞培养是一项用于研究和生产生物技术产品的基础技术。
以下是细胞培养的一般操作步骤：1.实验室准备：-消毒：在开始实验之前，对实验室进行消毒处理，确保实验环境的无菌。
-工具准备：准备好所有需要的培养器具，如离心管、试管、培养皿、吸管等。
-培养基准备：根据实验需要，准备好适当的培养基，并对其进行消毒处理。
2.细胞准备：-细胞收获：收获细胞，并将其转移到一个装有细胞培养基的培养皿中。
-细胞计数：使用细胞计数器或显微镜对细胞进行计数和分析，以确定细胞的浓度和活性。
-细胞传代：如果需要，将细胞进行传代以维持其活性和数量。
3.培养条件：-培养温度：根据细胞的要求，将培养皿放置在适当的温度控制设备中，通常为37℃。
-CO2浓度：对于一些细胞（如哺乳动物细胞），需要提供适当的CO2浓度来维持其生长和代谢。
-培养液更换：根据具体要求，定期更换培养液，以保持细胞的健康生长。
4.细胞培养：-培养基添加：向培养皿中加入适当量的培养基，以提供细胞生长和繁殖所需的养分。
-培养皿处理：将培养皿放入恒温培养箱中，确保细胞在适宜的环境中生长。
-细胞观察：定期使用显微镜观察细胞的生长情况和形态变化，以评估细胞的健康状态。
-培养皿除菌：如果培养皿被发现有细菌或真菌污染，需要将其除菌，以保证细胞的无菌状态。
5.细胞传递：-细胞解离：当细胞达到所需密度或需要进行分离时，使用适当的酶或溶液将细胞从培养皿中解离。
-细胞收获：通过离心，将细胞收集到离心管中，并进行计数和分析。
-细胞传递：将细胞转移到新的培养皿中，重新开始培养过程。
细胞培养是一项复杂而精细的操作，需要高度的无菌技术和细心的操作。
在整个过程中，需要持续监测和调整培养条件，以确保细胞的健康生长和繁殖。
此外，注意遵循实验室的安全规范，保护自己和实验室的安全。
细胞培养的成功与否，将直接影响到后续实验的结果和应用。
细胞培养室操作规程
细胞培养室操作规程1. 引言在细胞培养室进行实验时，需要遵循一定的操作规程，以确保实验的顺利进行并保护实验人员和细胞的安全。
本文档旨在提供详细的细胞培养室操作规程。
2. 实验前准备在进行细胞培养室实验前，需要做好以下准备工作：- 穿戴实验室制定的个人防护装备，如实验服、手套、口罩和护目镜。
- 检查实验室设备和操作台的清洁度，并确保工作区域整洁无杂物。
- 准备实验所需的培养基、细胞培养物和实验器材，并进行必要的消毒处理。
- 检查培养器具和实验器材的完整性和干净程度。
3. 实验操作在进行细胞培养室实验时，需按照以下操作规程进行：- 打开细胞培养室的门时，先用消毒剂擦拭手部，然后使用洗手液洗手并彻底冲洗干净。
- 进入细胞培养室后，先进行操作台和培养器具的消毒处理，使用消毒剂彻底擦拭工作面和器具表面。
- 进行各项实验操作前，务必佩戴好手套，勿将裸露的手部接触培养物或实验器材。
- 操作过程中，避免发生剧烈动作和摇动，以防止细胞培养物的污染。
- 操作完成后，彻底清洁和消毒操作台、培养器具和实验器材，确保无残留。
4. 废弃物处理细胞培养室中产生的废弃物需按照以下要求进行处理：- 生物废弃物和污染物应放入专用的标有生物危险标志的中，严禁随意丢弃。
- 已消毒处理的实验器皿和培养器具应单独收集，放入装有消毒液的中浸泡，待处理完毕后进行干燥和垃圾分类处理。
5. 安全措施在细胞培养室实验中，请注意以下安全措施：- 不得在实验室内饮食、吸烟或使用化妆品。
- 注意保持良好的个人卫生，经常洗手、勤换手套，避免感染的交叉传播。
- 遇到实验室事故或异常情况时，应立即向负责人报告，并按照相关应急预案进行处理。
6. 总结细胞培养室操作规程的遵守对于实验的成功和细胞的安全至关重要。
在进行实验前准备、实验操作、废弃物处理和安全措施等方面都需要严格按照规程执行。
保持实验室整洁和个人卫生，是保证实验可靠性和重复性的基础。
细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存)
例如,配制1000ml的5%的稀盐酸,150ml的浓HCL加850ml的蒸馏水即 可。
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细胞计数
方法
吸出细胞悬液少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和 计数板之间。 静置三分钟 镜下观察，计数板四大格细胞总数。公式为：细胞数/ml= 四大格细胞总数/4 ×104个
细胞培养
1
一 原代培养（略）
2
二. 传 代 培 养
准备及注意事项 换液 传代 冻存 复苏 MTT
3
准备事项
1. 紫外灯照射细胞室30分钟,风机运行10分 钟后方可进入实验室.
2. 穿专用的口罩,帽子,拖鞋,工作衣等. 3. 带手套,并用酒精擦拭之. 4. 准备好实验必需用品. 5. 超净工作台内操作前用酒精棉球擦拭台面. 6. 超净工作台内操作完成后，
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RPMI1640培养基的配制：
1. 取一小袋1640培养粉，加高压过的三蒸水800ml， 在1000ml的烧杯中用玻璃棒搅拌溶解；
2. 加碳酸氢钠2.0g，再加三蒸水定容至1000ml； 3. 加青霉素(100U/ml) ，链霉素（100µg/ml）； 4. 在超净工作台内过滤除菌，分装成180ml，-
15
MTT法
1.实验开始前，96孔板应在超净台紫外灯下照 射2个小时以上。
2.从培养箱中拿出培养瓶，观察，加PBS，加 胰酶消化，加培养基，计数。
（方法及步骤同传代1-13步。）
3.加培养基，调整细胞浓度为10000个/200µl.
4.加到96孔板内,每板6行8列共48孔,每孔
200µl.
5.盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微
4. 取出器皿，高压后，放烤箱上层，再次烘 干即可使用。
细胞培养的准备工作
细胞培养的准备工作细胞培养是生物医学研究中常见的实验技术，它是通过在培养基中提供适当的营养物质和环境条件，使体外培养的细胞可以持续生长和繁殖。
为了保证细胞培养实验的成功进行，准备工作是至关重要的。
在这篇文章中，我们将详细介绍细胞培养的准备工作，包括实验室设备准备、培养基配制以及无菌操作等关键步骤。
希望本文能够对你有所帮助。
一、实验室设备准备在进行细胞培养实验之前，首先需要准备实验室必备的设备，包括无菌工作台、培养箱、显微镜、培养皿、移液器、离心机等。
这些设备能够提供无菌、恒温、湿度适宜的环境，为细胞的生长提供良好的条件。
1. 无菌工作台：无菌工作台是进行细胞培养实验的重要设备之一，它能够为实验人员提供洁净的操作环境，防止外源微生物对培养细胞的污染。
2. 培养箱：培养箱提供了恒温和适宜的CO2浓度环境，使细胞在体外也能够保持正常的生长状态。
3. 显微镜：显微镜用于观察培养的细胞形态和数量，帮助实验人员了解细胞培养的情况。
4. 移液器：移液器用于在无菌条件下向培养皿中加入培养基、溶液和细胞悬液，是进行细胞培养实验中必备的工具。
5. 离心机：离心机用于离心培养皿中的细胞悬液，帮助实验人员收集和分离细胞。
以上设备的准备是细胞培养实验进行的基础，它们能够帮助实验人员进行规范的细胞培养操作，保证实验结果的准确性和可靠性。
二、培养基配制培养基是支持细胞生长和增殖所必需的营养物质和生长因子的混合物，其配制的质量和无菌性直接影响着细胞培养实验的成败。
通常来说，培养基包括基本培养基和添加剂两部分。
1. 基本培养基：基本培养基是细胞培养实验中不可或缺的组成部分，它提供了细胞生长所需的营养物质和生长因子，如含有丰富氧气和CO2的DMEM培养基、含有丰富营养物质的RPMI-1640培养基等。
在配制基本培养基时，需要严格按照配方比例将粉末溶解于无菌水中，再经过滤灭菌或高压灭菌处理，最终得到无菌的培养基液体。
2. 添加剂：培养基中常加入的添加剂包括胎牛血清、青霉素/链霉素、L-谷氨酸、非必需氨基酸等，这些添加剂可以增进细胞的生长和增殖，提高细胞培养的成功率。
细胞培养实验报告
细胞培养实验报告细胞培养实验报告细胞培养主要包括细胞复苏、细胞传代和细胞冻存三个过程。
一、实验仪器及用品（一）超净台：1.枪头：10 mL、5 mL、1 mL、200 μL、10 μL；2.移液枪：同上，及相应的支架；3.离心管：50 mL、15 mL、1.5 mL，及相应支架与盛皿；4.记号笔；5.PBS缓冲液；6.酒精棉；7.废液杯×2：一个装枪头，一个装废液；8.封口膜；9.排枪卡槽；（二）细胞间：1.离心机：中型、小型；2.培养瓶：透气的用于培养，密封的用于运输，培养皿；3.灭菌离心管、枪头、冻存管等备用；4.毛巾、手套、口罩、酒精喷壶、灭菌超纯水、除菌滤膜；5.100 μL排枪；6.血球计数板、载玻片；7.水浴锅；（三）冰箱：1.双抗、环丙沙星；2.4℃：DMEM、1640、PBS、已配培养基；3.-20℃：MTT、MTS、DMSO、血清、胰酶；（四）缓冲间：罐、液氮罐；1.CO2（五）换衣间1. 实验服、拖鞋、手套、口罩、酒精喷壶；二、实验前准备（一）实验前将需要带入的物品洗净、高温灭菌、喷酒精，放入传送窗，将传送窗与细胞间紫外开启杀菌半小时；（二）半小时后关闭紫外，开启风阀与空调，散去臭氧，双手用洗手液洗净擦干后进入换衣间，换上隔离服（若不使用超净台，换实验服即可），戴上口罩、手套喷酒精，进入缓冲间风浴1-3 min；（三）进入细胞间，冰箱中取出所需溶液（胰酶、培养基等）置于超净台中，开启超净台紫外，关闭传送窗紫外，将物品取出后喷酒精后放于应处位置；注：若是冬天，溶液应在37℃水浴后再使用，所有物品放入超净台前均需再喷酒精，特别是盖口处。
三、细胞培养（一）细胞复苏1. 培养基配制：倒出50 mL培养基，加入50 mL血清，5 mL双抗（浓度10-50 μg/mL环丙沙星可作用一周抑制支原体生长），分装3天够用的培养基即可，所有都用封口膜封住；2. 冻存液配制：1 mL DMSO、2 mL血清、7 mL培养液混合；3.37℃温育DMEM培养液（含双抗和血清）。
生物实验步骤详解
生物实验步骤详解生物实验是生物学研究中不可或缺的一部分，不仅可以帮助我们更好地了解生命系统的运作规律，还可以为未来的科学研究提供重要的依据。
然而，进行生物实验需要遵守一系列规定和步骤，以确保实验的准确性和可靠性。
在本文中，我们将简要介绍几个生物实验的步骤和注意事项。
细胞培养实验细胞培养实验是一种常见的生物实验，可以用来研究细胞的生长、分化和细胞信号转导等问题。
以下是一些需要注意的步骤：1. 准备培养基：先要准备含有营养物质、生长因子和抗生素等的培养基。
由于不同类型的细胞对培养基的要求各不相同，因此需要根据实验需要来选择适合的培养基。
2. 提取细胞：首先从器官或组织中提取细胞，将其进行消化或分离，并将细胞悬浮于培养基中。
3. 培养细胞：将细胞培养于恒温、湿度适宜的环境中。
定期更换培养基以去除代谢物和细胞分泌的废物。
4. 细胞观察：通过显微镜观察培养的细胞，以确定其形态、分化和生长状态。
PCR实验PCR是一种常见的生物技术，可以用来扩增DNA序列，从而帮助我们了解DNA的序列和功能。
以下是一些需要注意的步骤：1. 准备反应混合液：将模板DNA、引物和酶等添加到反应管中，制备PCR反应混合液。
引物的设计需要精确筛选，以确保特异性和灵敏度。
2. PCR反应：在热循环仪中进行PCR反应，并根据实验需要设置不同的温度和时间参数。
热循环仪可以模拟PCR反应在不同程度上的变化。
3. PCR产物检测：通过凝胶电泳或其他分析方法检测PCR扩增产物。
凝胶电泳可以对PCR产物的长度、特异性和数量进行分析。
Western blotting实验Western blotting是一种常见的蛋白质检测技术，可以用来检测蛋白质的存在、表达和定量。
以下是一些需要注意的步骤：1. 蛋白提取：从细胞或组织中提取蛋白质，并将其分离和纯化。
提取蛋白的方法和条件应根据实验需要而定。
2. 蛋白电泳：使用SDS-PAGE技术将蛋白质进行电泳分离，并将其转移到薄膜上。
细胞培养基本操作
细胞培养基本操作细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细胞的过程。
细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。
一、实验前准备实验开始前，水浴箱调节至36度恒温。
取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。
消毒双手和超净台。
取约1ml 细胞完全培养基放于15ml 离心管中。
水浴箱调节至40度恒温，由液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到40度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。
整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。
注：解冻到0度时（即冻存管里还有最后一点冰）立刻转移到含培养基的离心管中。
然后用5ml的热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来，之后补全生于的培养基到细胞瓶中。
二、制备细胞悬液吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，吸取1ml培养液加入冻存管，将剩余细胞全部吸入离心管中。
上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。
离心：1000rpm，室温离心3min。
注：细胞复苏后最好等几分钟再离心，因为冻存前加了胰酶消化，对细胞造成一定损伤，复苏后立即离心对细胞造成损伤较大。
三、细胞培养离心后，倒掉上清液，缓慢操作，不要倒掉底部的细胞沉淀。
向离心管内的细胞沉淀加入1ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液。
培养瓶内加入4ml 完全培养基，细胞悬液加入培养瓶内，左右前后轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2 的培养箱中培养。
24-48 小时后换液或传代继续培养，换液传代的时间由细胞情况而定。
四、注意事项1、解冻速度要快在常温下，冻存液中的DMSO 对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻存液完全融化。
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
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放射灭菌
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紫外光射线 适用范围：控制空气污染，消毒物品表面 。 限制：对皮肤及眼有害，穿透力小，不能透 过玻璃。 电离辐射 适用范围：消毒对热敏感的外科器械等 。 限制：昂贵、需特殊装置。
0.22 ~0.45 µ m
过滤
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膜滤器
适用范围：对热敏感的液体，如血清和动物培养基。 限制：需先清除悬浮物质，一些有用的活性物质可能被 吸附掉。
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单独使用时，一般只用于空气和台面的消毒。如仅用 紫外线照射带菌的器皿，则无法彻底灭菌，所以应与 其他消毒方法结合使用，如先用75％的酒精浸泡，再 照紫外线消毒灭菌等。 ②检查消毒灭菌效果照射后为检查超净台是否达到无 菌效果，可在已照射的洁净台四角和酒精灯旁分别放 置5个含琼脂糖半固体培养基的直径90 mm培养皿， 20 min后再转入37℃培养箱中培养72 h，观察细菌生 长情况。如果每块平皿上无菌落生长，说明洁净台符 合无菌标准。
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玻璃器皿的灭菌包装 � 1 局部包装：较大器皿如培养瓶，烧杯，容量 瓶，三角瓶等以及体积较小瓶口包装方便的容 器如青霉素瓶等，采用局部包装。
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2 全包装：体积较小的培养皿、注射器、胶塞、 尽速器械（剪刀、镊子）等采用全包装。 1 直接装入率饭盒，再用细胞培养灭菌袋灭菌。 缺点：密封不严，不宜长时间使用。 2 纸包装， 要掌握正确包装方法，不要是锐器 扎破包装纸。
常用灭菌方法
物理灭菌法
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湿热灭菌:高温高压法、流动蒸汽或沸水 干热灭菌：烤箱、焚烧、酒精灯 射线照射灭菌：紫外线、电离辐射 过滤灭菌：微孔滤膜、玻璃丝滤器 超声射线消毒灭菌 主要使用6OCo、X射线进行消毒灭菌，可用于 牛血清和塑料制品的灭菌。 (2)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热 灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒 方法之一。 ①消毒方法 现在一般用无臭氧型紫外灯。消毒的效能与距离成反 比，：进行空气消毒时灯管应距地面2.5 m以内；台面的消毒应在 80 cm以内；培养器皿的消毒在30 cm以内。 消毒的时间与效能存 在一定关系，但不是绝对的：照射20 min后，有71％的细菌被消 灭；40 min后79％的细菌被消灭；60 min后86％的细菌被消灭。 紫外线照射时间再长也不是100％的灭菌，最多只能把90％的细菌 消灭，过长的照射是没有意义的。
化学灭菌方法
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3、塑料制品的清洗 塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的 包装，打开包装即可用，多为一次性物品。 必要时用2% NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲 洗，再用5%盐酸溶液浸泡30分钟，最后用自来 水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。
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一次性培养瓶、培养板不提倡反复使用，反复使用肯 定会导致会导致实验结果可信度下降，甚至导致实验 结果错误，但在某些特殊的实验情况下需要重复使用 的，可以按照以下方式来进行消毒灭菌。 一、清洗： 1) 用过的培养瓶自来水冲洗数遍，用棉球温柔擦洗瓶 底，去除贴壁细胞和蛋白质沉积物，注意千万不要用 毛刷洗，否则瓶底会毛糙，下次培养细胞就难以观察 了。 2) 泡铬酸洗液过夜，最好不要超过24小时，自来水冲 洗数遍后再用自来水浸泡数小时，再用自来水冲洗， 蒸馏水和超春水各冲洗3遍。
3自来水冲净洗液。 4蒸馏水淋洗器具的内外壁 5倒置晾干，或烘干、热风吹干。 6放置在专用橱柜中备用。
玻璃器皿的清洗
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1.浸泡: 新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新 玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5％盐酸浸泡过夜；用过 的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应 立即浸入清水中备刷洗。 2.刷洗: 将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要 留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、 晾干，备浸酸。 3.浸酸 :浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧 化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于六小时，一般过夜 或更长。放取器皿要小心。 4.冲洗: 刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗 的干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器 皿至少要反复“注水－倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或 烘干后包装备用。
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培养操作有关仪器
贮液瓶：主要用于存放或配制各种培养用液体，如培养液，血清及试剂等。 储液瓶分为不同规格，如1000ml ，500ml，250ml，100ml，50ml，5ml等 吸管：主要分为刻度吸管和无刻度吸管，主要用于吸取、转移液体及吹打， 混匀及传代细胞。 加样器：用于吸取，移动液体或滴加样本，可根据需要调节量程。
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微生物污染是细胞培养工作失败的重 要原因之一
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微生物的生存能力远大于培养的动植物细 胞，争夺培养细胞的营养物质，改变培养 细胞的体外生存环境如pH，导致细胞培 养失败。
动物细胞培养的清洗要求
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玻璃培养器皿的洗涤 1、常规洗涤
1先洗涤油污、石蜡、胶布等物。 2洗洁精中洗涤，直至瓶壁上不挂水珠为止 3自来水冲洗，去除洗洁精。必要的话重复2 4蒸馏水淋洗器具的内外壁 5倒置晾干，或烘干、热风吹干。 6放置在专用橱柜中备用。
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玻璃丝滤器
适用范围：消毒空气，如超净工作台上的层流设计。 限制：昂贵，环境应较清洁，以免阻滞过滤器。
湿热灭菌
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高温高压法
高压灭菌锅，120℃，1大气压/cm2下，保持15~20分钟。 适用范围：玻璃器皿、不锈钢用具、固体培养基、和部 分液体培养基等。 限制：蒸汽不能渗透的无效，受热会损坏的不能用，如 塑料制品。
第一节： 动物细胞实验前准备2
清洗 � 消毒灭菌（sterilization） � 无菌操作
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从事细胞培养工作，最基本也是最关键的要 求是：无菌操作，防止污染 。 � 污染源：微生物污染和化学污染 � 微生物污染： 细菌 真菌（酵母菌和霉菌） 支原体 病毒 污染源广泛存在于空气中、实验材料上、实验 器皿器械上、培养用液中等 。
干热灭菌
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烤箱 适用范围: 消毒蒸汽不能渗透或经蒸汽会损坏的物 品,如油类、玻璃、刀具、金属等。 限制：损坏不能耐长时间高温的物品，如纸、布类。 焚烧 处理不能再用的污染物品。 焚烧炉应够大，燃烧迅速，注意空气污染。 酒精灯
使用烤箱的注意事项： 方法：于150°C恒温40 min, 或120°C恒温 2h，或160°C恒温1.5-2h (杀芽孢杆菌)， 然后关掉电源使其自然降温，待温度低于 60 °C后，才能打开烤箱，否则内外温差太 大，易引起玻璃器皿的损坏。 处理意外：当烤箱温控失调导致起火时， 绝对不可打开烘箱门。
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金属器械：主要用于解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件; 手术刀（解剖刀）、手术剪（解剖剪）、眼科虹膜小剪（将组织剪成 小块），血管钳及组织镊（持取物品），口腔探针或代用品（放置原 代培养的组织小块）
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杂用品：金属饭盒、试管架、橡胶塞、记号笔、 搪瓷盘、枪头、橡胶塞、酒精灯、酒精、棉球 等。 一般而言，实验准备时杂物要多于实验所需， 枪头数要多于实验所用的数量，橡胶塞（瓶盖） 要多于瓶数。
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注意事项： 1 浸泡、煮沸、酸泡时器皿内要充满液体，不 得有气泡； 2 冲洗时要用流水震荡洗涤，每瓶灌 2/3体积 的自来水，震荡后倒掉，重复 15-20次； 3 煮沸前水面要高于器材5cm，水沸后投入洗 涤剂。
消毒灭菌
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实验室整体灭菌：紫外线、熏蒸 手：75%酒精消毒 衣服: 煮沸或射线照射 培养器具 培养基 采用适当的灭菌方法灭菌 其他培养用液
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(3)干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放 人干燥箱内，加热至160℃，保温90－120 min。用于RNA提取实 验的用品则需180℃，保温5－8 h。 (4)湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方 法。 温热消毒：即高压蒸气消毒，是一种使用最广泛、效果最好的消 毒方法。温热消毒时，消毒物品不能装得过满，以防止消毒器内 气体阻塞而千百万危险，保证其内气体的流通。在加热升压之 前，先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气，冷气空气排出 后，关闭排气阀门，同时检验安全阀活动自如，继后开始升压， 当达到所需压力时，开始记算消毒时间。消毒过程中，操作者不 能离开工作岗位，要定时检查压力及安全，防止消毒及表皮意外 事件发生。
洗液配方
配方成分 (g) 重铬酸钾 重铬酸钾(g) (ml) 浓硫酸 浓硫酸(ml) (ml) 蒸馏水 蒸馏水(ml) 弱液 50 100 1000 次强液 强液 100 200 1000 60 800 200 常用配方 100 200 800
洗液的配制方法：
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弱液：KCrO4 50g + dH2O 1000 mL 0mL。 加热溶解，冷却后，缓缓加入工业用硫酸10 100 0mL 次强液： KCrO4 100g + dH2O 20 200mL mL。 加热溶解，冷却后，缓缓加入浓硫酸200 200mL 饱和液： KCrO4 10g + dH2O 20 mL 加热溶解，冷却后，缓缓加入浓硫酸，并同时加入研碎的 KCrO4 ，直到过饱和为止。比例一般为1000 mL浓硫酸加 入KCrO4 50g。
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洗液配制时要注意的几点！！！
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1、 KCrO4液要冷却后才能加浓硫酸。 以防暴沸。 KCrO4液中。 2、浓硫酸要慢慢倒入 、浓硫酸要慢慢倒入KCrO 3、洗液要密封保存，以免失效。 橙色→ 蓝绿色
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2、胶塞的清洗 细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲 洗，再做常规处理， 常规清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用 2% NaOH或洗衣粉煮沸 10-20分钟，以除掉培养中的蛋白 质。自来水冲洗后，再用 1%稀盐酸浸泡30分钟或蒸馏水 冲洗后再煮沸 10-20分钟，晾干备用。