鼠疫实验室检测技术
鼠疫流行病学调查方法
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研究目的和意义
开展鼠疫流行病学调查对于了解疫情的传播途径、制定防 控策略和措施具有重要意义。
通过调查，可以评估疫情的危害程度、传播风容和方法
研究内容包括疫情报告、病例定义、病例搜索、疫情分布特 征和影响因素分析等。
流行病学调查方法包括病例对照研究和队列研究等，可以分 析疫情传播的各个环节和影响因素，评估防控措施的效果。
社区调查与样本采集
开展社区调查
了解当地人口分布、流动人口、卫生习惯、动物和环境等情况，以便评估疫 情传播风险和制定防控措施。
样本采集和检测
采集病例及其密切接触者的生物样本，进行病原学检测和血清学检测，有助 于了解疫情的病原和传播情况。
数据整理与分析
数据整理
整理和分析收集到的各种数据，包括病例 数量、分布、病情轻重、治疗情况等，以 便更好地了解疫情现状和发展趋势。
02
鼠疫流行病学概述
鼠疫的病原学
鼠疫病原体
鼠疫病原体是鼠疫菌，属于耶尔森氏鼠疫杆菌属，主要存在 于啮齿动物和跳蚤中。
鼠疫菌的分类
鼠疫菌分为不同类型，包括腺型鼠疫、肺型鼠疫、败血症型 鼠疫等。
鼠疫的流行病学特征
传播途径
鼠疫主要通过带菌的鼠类、蚤 类、野生动物等传播，也可通
过空气飞沫传播。
季节性
鼠疫多发于春夏季节，与鼠类活 动和跳蚤繁殖有关。
样本采集
采集病例的相关样本，如血液、痰液、呕吐物等，进行实验室检 测和分析。
监测和观察
对相关人群进行监测和观察，及时发现新的病例和疑似病例，追 踪密切接触者，防止疫情扩散。
调查总结阶段
数据整理和分析
对调查数据进行整理、统计和分 析，评估疫情的严重程度、流行 趋势和影响因素，为制定防控措 施提供依据。
布病检测方法
布病检测方法布病，又称为鼠疫，是一种由鼠疫耶尔森菌引起的传染病，主要通过啮齿类动物传播给人类。
布病的早期症状包括发热、头痛、肌肉疼痛等，如果不及时治疗，可能会导致严重的并发症甚至死亡。
因此，及时准确地进行布病检测对于预防和控制疾病的传播至关重要。
本文将介绍几种常见的布病检测方法，帮助大家了解如何进行有效的检测和诊断。
1. 血清学检测方法。
血清学检测是目前常用的布病检测方法之一。
通过检测患者的血清中是否含有鼠疫耶尔森菌的特异抗体，可以确定是否感染了布病。
这种方法的优点是操作简便、结果快速，可以在短时间内得出初步诊断。
但是，血清学检测方法也存在一定的局限性，例如在感染初期可能无法检测出抗体，容易产生假阴性结果。
2. 细菌培养检测方法。
细菌培养检测是通过将患者的组织样本或体液样本进行培养，观察是否能够分离出鼠疫耶尔森菌来进行诊断的方法。
这种方法的优点是可以直接获得病原体，对于确诊布病具有重要意义。
然而，细菌培养检测需要较长的培养周期，通常需要数天甚至数周才能得出结果，且操作复杂、耗时。
3. 分子生物学检测方法。
分子生物学检测方法是近年来发展起来的一种新型检测方法，通过检测患者组织样本或体液样本中的鼠疫耶尔森菌的DNA或RNA来进行诊断。
这种方法具有高度的特异性和敏感性，能够快速准确地检测出病原体，对于布病的早期诊断具有重要意义。
然而，分子生物学检测方法需要专业的实验室设备和技术支持，成本较高，限制了其在临床上的推广应用。
4. 免疫组化检测方法。
免疫组化检测方法是通过检测患者的组织样本中是否含有鼠疫耶尔森菌的特异抗原来进行诊断的方法。
这种方法具有较高的特异性和准确性，可以帮助医生进行准确的病理诊断。
然而，免疫组化检测方法需要专业的实验室设备和技术支持，且操作复杂，不适合于临床快速诊断。
总结。
布病的及时检测对于预防和控制疾病的传播至关重要。
目前，血清学检测、细菌培养检测、分子生物学检测和免疫组化检测是常用的布病检测方法。
鼠疫监测实施方案
鼠疫监测实施方案一、背景介绍。
鼠疫是由鼠疫杆菌引起的一种急性传染病，主要通过啮齿类动物传播给人类。
鼠疫在人类中的发病率虽然较低，但一旦发生疫情，往往具有较高的致死率。
为了有效预防和控制鼠疫的传播，需要建立健全的鼠疫监测实施方案。
二、监测对象。
1. 野生啮齿类动物，包括老鼠、松鼠、野兔等。
2. 家畜，包括家兔、家鼠等。
3. 人群，特别是那些与啮齿类动物有密切接触的人群，如农民、清洁工等。
三、监测内容。
1. 野生啮齿类动物的监测，定期对野生啮齿类动物的栖息地进行调查，采集样本进行鼠疫杆菌的检测。
2. 家畜的监测，对家畜进行定期的健康检查，及时发现并隔离疑似感染鼠疫的家畜。
3. 人群的监测，对与啮齿类动物有密切接触的人群进行定期的健康监测，及时发现并隔离疑似感染鼠疫的患者。
四、监测方法。
1. 野生啮齿类动物的监测方法，采用捕捉、诱捕、毒饵等方法对野生啮齿类动物进行监测，采集样本进行实验室检测。
2. 家畜的监测方法，定期对家畜进行健康检查，包括体温、体重、食欲等指标的监测，发现异常情况及时报告和隔离。
3. 人群的监测方法，对与啮齿类动物有密切接触的人群进行定期的健康监测，包括体温、呼吸、血压等指标的监测，发现异常情况及时报告和隔离。
五、监测结果处理。
1. 野生啮齿类动物的监测结果处理，对检测到鼠疫杆菌的野生啮齿类动物，立即采取相应的隔离和消毒措施，防止疫情扩散。
2. 家畜的监测结果处理，对发现疑似感染鼠疫的家畜，立即隔离并进行进一步的检测，确诊后进行治疗或者安全处置。
3. 人群的监测结果处理，对发现疑似感染鼠疫的人群，立即隔离并进行进一步的检测，确诊后进行治疗或者安全处置。
六、监测方案的实施。
1. 建立健全的监测机制，明确监测的对象、内容、方法和结果处理等各项细节。
2. 加强对监测人员的培训，提高监测工作的专业化水平。
3. 加强监测结果的信息共享和沟通，及时发现和处理疫情风险。
七、总结。
建立健全的鼠疫监测实施方案对于预防和控制鼠疫的传播具有重要意义。
5、鼠解剖采样及血清、培养分离检验
鼠疫菌的毒素
鼠疫菌毒性物质在鼠疫菌的细胞内部及荚膜中 均可发现，现已证明鼠疫菌有两种毒素，即鼠 毒素和内毒素。 鼠疫菌的毒力和毒力决定子 于鼠疫菌毒力多原性的理论，这个概念的实质 在于鼠疫菌的毒力和某些性状相关，毒力是鼠 疫菌某些性状的综合表现，并把他研究的几种 抗原和特征称为毒力决定子。
现已证明的毒力决定子是：V和W毒力抗原(VW)、产 生荚膜抗原(FraI)、色素沉着因子(Pgm)、鼠疫杆菌素 I(PstI)、血浆凝固因子(F)， 后面三个因子显然是互相 联系的。 此外，有关鼠疫菌的毒力决定子还有嘌呤依赖(Pu)、鼠 毒素(T)， 过氧化氢酶、五碳醣核酸酶和透明质酸酶等。 根据WHO鼠疫专家委员会第四报，普遍被承认的毒力 决定子只有四个， 即：Fra1、VW、Pgm、Pst1。
用病人材料，死于鼠疫的人尸和动物尸体的新 鲜脏器制备的涂片，可见到两端钝园，两极浓 染的典型鼠疫杆菌，呈散在或小堆，偶见链状 排列。在陈旧性病灶及腐败材料中，常见到菌 体澎大和着色不良的球形菌影及其他变形的鼠 疫杆菌。在压印标本中，可以看到吞噬细胞内 外有鼠疫杆菌。此点对于鉴别杂菌污染材料有 很大的价值，因为动物死后，污染的杂菌不会 被吞噬细胞所吞噬。
鼠疫菌的毒力常以最小致死量(MLD) 表 示：即能引起实验动物全部死亡的最小 菌量。或用半数致死量(LD50)表示，即能 引起试验动物半数死亡的菌量来表示。 鼠疫菌的毒力可分为四种类型：即弱毒 菌株、低毒菌株、毒菌株和强毒菌株。
鼠疫菌的抗原结构和血清学特征
鼠疫菌有16种抗原，假性结核杆菌有13种抗原；在鼠 疫菌和假性结核杆菌的抗原中有11种是两菌共有的。 1.F1抗原又称荚膜FI（fraction I）抗原，是一种糖蛋白， 分子量20000～500000，它至少可以分成4个亚单位， 即F1A、F1B、F1Aa、F1Ba（分子量15000～17000）。 是鼠疫菌在37℃培养时在菌体周围生长的一层封套物 质中的一部分，在37℃培养时F1抗原产生的多，在 28℃培养时产生极少。F1抗原的抗原性较强，特异性 较高，有白细胞吞噬作用，可用凝集、补体结合或间 接血凝检测。
实验室判定鼠疫标准
实验室判定鼠疫标准# 实验室判定鼠疫标准## 一、前言嘿，朋友！你知道鼠疫吗？这可是个相当厉害的传染病呢。
在历史上，鼠疫那可是造成了不少的大灾难。
现在虽然医疗水平进步了很多，但鼠疫依然是我们需要高度重视的疾病。
实验室判定鼠疫标准就像是一个特殊的“侦探指南”，它能帮助科学家和医生们准确地发现鼠疫病菌的踪迹，搞清楚一个人是不是真的感染了鼠疫。
这标准可是非常重要的，就像一把精确的尺子，能够准确测量出鼠疫的存在与否，这样才能及时采取措施，防止鼠疫的传播，保护大家的健康。
## 二、适用范围（一）临床疑似病例的确诊比如说，有一个病人出现了高热、淋巴结肿大、咳嗽等症状，这些症状有点像鼠疫，但又不能确定。
这时候，实验室判定鼠疫标准就派上用场了。
医生会采集病人的血液、痰液或者淋巴结穿刺液等样本送到实验室，按照这个标准进行检测，如果符合标准中的判定，那就可以确诊为鼠疫病例了。
（二）疫情监测在一些鼠疫可能流行的地区，像草原、山区等地，卫生部门会定期进行疫情监测。
他们会捕捉一些老鼠或者其他可能携带鼠疫病菌的小动物，采集它们的组织或者粪便样本。
实验室就会依据判定鼠疫的标准来检测这些样本，看看这个地区是否存在鼠疫病菌的活动，就像给这个地区做一个“健康体检”一样。
（三）鼠疫研究对于研究鼠疫的科学家来说，这个标准就像是他们的研究手册。
不管是研究鼠疫病菌的生物学特性，还是探索新的治疗方法，准确判定鼠疫是基础。
科学家们在实验室里操作各种实验，根据这个标准来确定自己研究的样本是否为鼠疫病菌，确保研究方向的准确性。
## 三、术语定义（一）鼠疫耶尔森菌这是导致鼠疫发生的罪魁祸首，是一种细菌。
你可以把它想象成一个小小的、坏坏的微生物小怪兽。
它长得有点像小短杆，在显微镜下才能看到它的模样。
这种细菌特别狡猾，它能通过老鼠身上的跳蚤传播给人类，进入人体后就开始捣乱，引起各种严重的症状。
（二）血清学检测简单来说，就是通过检测血液中的一些成分来判断是否感染鼠疫。
鼠疫实验室检测技术
吸水纸
C区：羊抗 小鼠Ig
免疫荧光技术(IFT)
标记物-荧光素(如异硫氰荧光素 Yersinia pestis 免疫荧光染色 FITC)
荧光素标记抗体检测相应抗原-直 接法：如FITC-FIMcAb为异硫氰 酸荧光黄标记鼠疫F1单克隆抗体。
方法：固定好的玻片标本用1%牛 血清PBS浸洗5分钟，流水冲洗。 用FITC-FIMcAb适量（0.2ml）荧 光染色，室温作用30分钟，流水 冲洗。干燥，荧光显微镜油镜观 察，鼠疫菌染上翠绿色荧光
鼠疫噬菌体试验
➢ 在培基上密集平行划线培养鼠疫菌，鼠疫噬菌体滴 于上端划线中部，直立平板，使噬菌体液垂直划线 自然流下，置20℃培养24h,有明显的噬菌带。
➢ 在18~22℃鼠疫噬菌体只能裂解鼠疫菌而不裂解假 结核菌，具有较强的专一性(噬菌作用具有种的特异 性)，是鼠疫细菌学诊断中特异的鉴定方法之一。
目标基因
引物序列
产物长度
fra 1F 5’-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3’
249 bp
1R 5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’ pla 2F 5’-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3’ 456 bp
2R 5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’
鼠疫菌染色方法有革兰氏染色（菌体染成红 色）、美兰染色（菌体染成兰色，两极浓染明 显）、姬姆萨染色（菌体染成色，荚膜染成色）
鼠疫菌染色检查(脏器压印片)
革兰氏染色
美兰染色
鼠疫菌染色
鼠疫菌涂片的革兰氏染色
鼠疫菌染色检查
Wayson stain(魏申氏染 荚膜染色—墨汁负染色 色)呈现的两极浓染特 征
传染病学-鼠疫
鼠 疫Plague鼠疫n是鼠疫耶尔森菌引起的烈性传染病。
n传染性强，病死率高，属国际检疫传染病和我国法定的甲类传染病。
n我国近十年人间鼠疫病例数逐年增多，以腺鼠疫为主，需引起高度重视。
【病原学】——鼠疫耶尔森菌（一）形态n属肠杆菌科，耶尔森氏菌属，革兰染色阴性。
n外观为两端钝圆，两极浓染的椭圆形小杆菌。
长约1～1.5μm，宽约0.5～0.7μm，有荚膜，无鞭毛、无芽胞。
【病原学】（二）培养n普通培养基n适宜温度为28～30℃n酸碱度为pH6.9～7.2n培养16～18h，用显微镜观察可见一层形状不一，浅灰色小菌落，是培养初期的菌落特征。
24～48h后可形成直径0.1～0.2mm，圆形，中心突出，透明的浅灰色小菌落。
72h后直径4mm。
【病原学】（三）抗原n荚膜FI抗原n毒力V/W抗原（四）两种毒素n鼠毒素或外毒素：毒性蛋白质n内毒素：脂多糖鼠疫耶尔森菌毒力有关抗原的编码基因【病原学】（五）抵抗力n对外界抵抗力较弱，对光、热、干燥及一般消毒剂均敏感。
n日光直射4～5小时即死，加热55℃ 15分钟或100℃ 1分钟、5%苯酚、5%甲酚皂，0.1升汞、5%～10%氯胺均可将病菌杀死。
n但在潮湿、低温与有机物内存活时间则较久，在痰和脓液中可存活10～20天，在蚤粪中可存活1个月，在尸体中可存活数周至数月。
【流行病学】（一）传染源主要传染源鼠类和其他啮齿动物主要储存宿主黄鼠属和旱獭属次要储存宿主褐家鼠、黄胸鼠（也是人间鼠疫的主要传染源）可能传染源猫、羊、兔、骆驼、狼、狐等（二）传播途径n动物和人间鼠疫的传播啮齿动物→鼠蚤→人鼠蚤叮咬是主要传播途径。
痰液、脓液或病兽的皮、血、肉n呼吸道飞沫传播人-飞沫-人之间肺鼠疫患者【流行病学】（三）易感人群n人群对鼠疫普遍易感，无性别年龄差别，存在一定数量的隐性感染。
n病后可获持久免疫力。
n预防接种可获一定免疫力，可降低易感性。
【流行病学】（四）流行特征n流行情况非洲、亚洲、美洲发病最多。
目前使用的鼠疫诊断标准
目前使用的鼠疫诊断标准鼠疫是一种由鼠疫杆菌引起的急性传染病，可分为鼠源性鼠疫、蚤源性鼠疫和呼吸道鼠疫三种类型。
为了指导医生对鼠疫进行诊断，世界卫生组织（WHO）和国际鼠疫控制中心（IPCC）制定了一系列诊断标准。
在本文中，我们将讨论目前使用的鼠疫诊断标准，并提供一些参考内容。
1. 临床表现标准：鼠疫的临床表现可以根据感染部位分为鼠疫淋巴结炎、鼠疫败血症和鼠疫肺炎。
临床医生可以根据患者的症状和体征来判断是否可能是鼠疫。
常见症状包括高热、寒战、头痛、乏力等。
参考内容示例：根据世界卫生组织的定义，鼠疫淋巴结炎表现为肿大的淋巴结，通常伴有皮肤红肿和疼痛。
鼠疫败血症表现为发热、寒战、肌肉疼痛和全身不适等。
鼠疫肺炎表现为咳嗽、咳痰、胸痛和呼吸困难等。
2. 实验室检测标准：为了确诊鼠疫，实验室检测是必不可少的。
鼠疫的诊断通常通过检测患者的血液、淋巴结组织或呼吸道标本中的鼠疫杆菌。
参考内容示例：实验室诊断通常通过培养鼠疫杆菌并进行形态学鉴定来确认。
此外，目前还可以使用聚合酶链反应（PCR）技术来检测鼠疫杆菌的DNA。
血清学检测也是常用的方法，通过检测患者血清中的抗体水平来确定是否感染了鼠疫杆菌。
3. 流行病学标准：鼠疫的流行病学调查对于及时发现和控制疫情至关重要。
根据流行病学数据，可以确定是否存在鼠疫的流行性传播。
参考内容示例：流行病学调查包括对病例的调查和对接触者的追踪。
通过询问患者和他们的接触者，了解疫区、接触史、动物接触史等信息，可以帮助确定鼠疫的暴发和传播情况。
此外，对鼠疫疫区的鼠类和蚤类进行监测也是重要的流行病学调查内容。
4. 影像学标准：鼠疫肺炎患者通常可以通过胸部X线或CT扫描来观察相关影像学改变，以帮助诊断和评估疾病的严重程度。
参考内容示例：鼠疫肺炎的影像学表现常包括肺实变、肺炎、胸腔积液等。
通过观察胸部X线或CT扫描结果，可以帮助医生判断患者是否有鼠疫肺炎的病变。
总结：目前使用的鼠疫诊断标准主要包括临床表现、实验室检测、流行病学调查和影像学观察。
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GICA双抗体夹心法—测抗原
标本 T区：特异性单 克隆抗体 (F1McAb)
吸水纸
G区：金标特异性抗体 (鼠型F1McAb)
C区：羊抗 小鼠Ig
免疫荧光技术(IFT)
标记物-荧光素(如异硫氰荧光素 FITC) 荧光素标记抗体检测相应抗原-直 接法：如FITC-FIMcAb为异硫氰 为异硫氰 酸荧光黄标记鼠疫F1单克隆抗体 单克隆抗体。 酸荧光黄标记鼠疫 单克隆抗体。 方法：固定好的玻片标本用1%牛 方法：固定好的玻片标本用 牛 血清PBS浸洗 分钟，流水冲洗。 浸洗5分钟 血清 浸洗 分钟，流水冲洗。 适量（ 用FITC-FIMcAb适量（0.2ml）荧 适量 ） 光染色，室温作用30分钟 分钟， 光染色，室温作用 分钟，流水 冲洗。干燥， 冲洗。干燥，荧光显微镜油镜观 察，鼠疫菌染上翠绿色荧光 Yersinia pestis 免疫荧光染色
一、鼠疫菌菌体形态检查
典型的鼠疫菌呈短而粗，菌体长 典型的鼠疫菌呈短而粗，菌体长1~2µm，宽 ， 0.5~0.7µm,中段膨大，两端钝圆，且两极浓染 中段膨大， 中段膨大 两端钝圆， 的卵圆形小杆菌，有荚膜，无鞭毛，无芽胞。 的卵圆形小杆菌，有荚膜，无鞭毛，无芽胞。 革兰氏染色阴性。 革兰氏染色阴性。 染疫动物或患者及其尸体的新鲜脏器制备的压 印片，可见到两端钝圆、 印片，可见到两端钝圆、两极浓染的典型鼠疫 压印标本中可在吞噬细胞内外见到鼠疫菌， 菌。压印标本中可在吞噬细胞内外见到鼠疫菌， 对于鉴别杂菌污染材料极有价值。 对于鉴别杂菌污染材料极有价值。 鼠疫菌染色方法有革兰氏染色（ 鼠疫菌染色方法有革兰氏染色（菌体染成红 ）、美兰染色 菌体染成兰色， 美兰染色（ 色）、美兰染色（菌体染成兰色，两极浓染明 ）、姬姆萨染色 菌体染成色，荚膜染成色） 姬姆萨染色（ 显）、姬姆萨染色（菌体染成色，荚膜染成色）
鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验
典型鼠疫菌菌落形态 噬菌带
鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验
鼠疫菌培养特征 鼠疫噬菌体试验
三、鼠疫F1抗原、抗体检测
鼠疫F1抗原检测 鼠疫F1抗体检测 1.反向血球凝集试验(RIHA) 1.间接血球凝集试验(IHA) 2.酶联免疫吸附试验(ELISA) 2.酶联免疫吸附试验(ELISA) 3.胶体金免疫层析法(GICA) 3.胶体金免疫层析法(GICA) 4.免疫荧光技术(IFT)
内部对照：以鼠疫菌EV株DNA为模板 采用上述f1引物扩 为模板， 内部对照：以鼠疫菌EV株DNA为模板，采用上述f1引物扩 增出fra基因 基因249 bp片段，再以 片段， 基因引物： 增出 基因 片段 再以16SrRNA基因引物： 基因引物
F 5’-AGCGGCAGCGGGAAGTAGTT-3’ R 5’-TCAACCCCTTCCTCCTCGCT-3’
RIHA微量法结果：
酶联免疫吸附试验(ELISA)
测抗体. 测抗体
双抗原夹心法：F1抗原包被反应板， 双抗原夹心法： 抗原包被反应板， 抗原包被反应板 加入待测标本28℃反应1.5h洗板， 洗板， 加入待测标本 ℃反应 洗板 加入HRP-F1抗原 ℃反应 洗板， 抗原28℃反应1h洗板 洗板， 加入 抗原 加入底物OPD蔽光反应 蔽光反应30min后加 加入底物 蔽光反应 后加 终止液(2mol/L硫酸 。 硫酸)。 终止液 硫酸 间接法： 已知F1抗原包被反应板 抗原包被反应板， 间接法： 已知 抗原包被反应板， 加标本37℃反应1h洗板，加入酶标 加标本 ℃反应 洗板， 洗板 二抗37℃反应1h洗板 洗板， 二抗 ℃反应 洗板，加入底物 (如OPD或TMB)蔽光反应 蔽光反应30min显 如 或 蔽光反应 显 色后加终止液。 色后加终止液。 用肉眼观察结果并用酶标仪检测每 孔的吸光度值(A) 孔的吸光度值 测抗原 双单抗夹心法： F1-McAb包被反应 双单抗夹心法： 包被反应 加入标本28℃反应1.5h洗板，加 洗板， 板，加入标本 ℃反应 洗板 洗板， 入HRP-F1McAb 28℃反应 洗板， ℃反应1h洗板 加入底物OPD蔽光反应 蔽光反应30min后加终 加入底物 蔽光反应 后加终 止液。 止液。 双抗体夹心法(改良法 美国CDC鼠疫 改良法-美国 双抗体夹心法 改良法 美国 鼠疫 诊断技术实验室操作手册)：鼠疫免疫 诊断技术实验室操作手册 ： 血清特异性抗体( 包被反应板， 血清特异性抗体 F1Ab)包被反应板， 包被反应板 加标本37℃反应1h洗板 洗板，加 洗板， ℃静置1h洗板 HRP标记的羊抗小鼠 标记的羊抗小鼠IgG 37℃反应 标记的羊抗小鼠 ℃反应1h 洗板,加底物 洗板 加底物OPD蔽光反应 蔽光反应30min显色， 显色， 加底物 蔽光反应 显色 加终止液。 加终止液。 肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔的 吸光度值(A) 吸光度值
扩增出16SrRNA基因 基因396bp片段加载体重组而成，产物 片段加载体重组而成， 扩增出 基因 片段加载体重组而成 长度645 bp ，使用了内部对照，可有效的防止假阴性结果。 使用了内部对照，可有效的防止假阴性结果。 长度 应用多重PCR方法来检测鼠疫菌，所选取的扩增区域都为鼠 方法来检测鼠疫菌， 应用多重 方法来检测鼠疫菌 疫菌的特异区域，可有效地将鼠疫菌与其它细菌相鉴别， 疫菌的特异区域，可有效地将鼠疫菌与其它细菌相鉴别，具 有较高特异性。 有较高特异性。
鼠疫PCR
反应条件(扩增 预变性95℃ 反应条件 扩增) ：预变性 ℃ 5min，1个循 扩增 预变性 ， 个循 然后95℃ 环；然后 ℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 ， ℃ ， ℃ min，30个循环；最后 ℃ 5 min。共1小时 个循环； ， 个循环 最后72℃ 。 小时 40分。 分 电泳：反应管中加溴酚蓝指示剂5µl， 电泳：反应管中加溴酚蓝指示剂 ，混均短 暂离心。 暂离心。胶体的每一孔中加入上述处理的反 应产物8µl， 不超过5V/cm)电压 应产物 ，在80--100V(不超过 不超过 电压 缓冲液中电泳约1小时 下TBE缓冲液中电泳约 小时。凝胶成像仪读 缓冲液中电泳约 小时。 取结果并照相。 取结果并照相。
鼠疫菌染色检查(脏器压印片)
革兰氏染色 美兰染色
鼠疫菌染色
鼠疫菌涂片的革兰氏染色
鼠疫菌染色检查
Wayson stain(魏申氏 染色)呈现的两极浓染 特征 荚膜染色—墨汁负染色
二、鼠疫菌的培养特性
鼠疫菌是典型的异养菌。 鼠疫菌是典型的异养菌。 鼠疫菌为需氧菌，亦为兼性厌氧菌。 鼠疫菌为需氧菌，亦为兼性厌氧菌。 鼠疫菌在普通培基上生长良好，培养的最适温度为28℃ 鼠疫菌在普通培基上生长良好，培养的最适温度为 ℃，最适 pH为6.9-7.1，发育初期的最适氧化还原电位（Eh）约为 为 ，发育初期的最适氧化还原电位（ ） 100~150mV，接种后至少 以上才能形成肉眼可见的菌落， ，接种后至少20h以上才能形成肉眼可见的菌落， 以上才能形成肉眼可见的菌落 一般24~48h形成肉眼可见的小菌落。 形成肉眼可见的小菌落。 一般 形成肉眼可见的小菌落 强毒鼠疫菌对钙离子有半依赖性，缺乏时生长不良。 ℃ 强毒鼠疫菌对钙离子有半依赖性，缺乏时生长不良。37℃缺钙 条件下强毒鼠疫菌生长受限并释放大量Yops,表现很强的表达 条件下强毒鼠疫菌生长受限并释放大量 表现很强的表达 和分泌毒力蛋白V抗原 抗原（ ）。此现象称为低钙反应 和分泌毒力蛋白 抗原（LcrV）。此现象称为低钙反应，受 ）。此现象称为低钙反应， 70kb(45MD)质粒上的遗传基因控制。 质粒上的遗传基因控制。 质粒上的遗传基因控制 典型鼠疫菌培养18-20h光镜下呈透明的碎玻璃片状。培养 光镜下呈透明的碎玻璃片状。 典型鼠疫菌培养 光镜下呈透明的碎玻璃片状 培养24h 以上菌落在透过光线下呈灰白色略带淡青色， 以上菌落在透过光线下呈灰白色略带淡青色，反射光线下菌落 圆形隆起呈淡灰白色，镜下见菌落中心发暗， 圆形隆起呈淡灰白色，镜下见菌落中心发暗，有黄褐色粗糙颗 周边围绕一圈宽窄不等，边缘不整呈锯齿状、 粒，周边围绕一圈宽窄不等，边缘不整呈锯齿状、薄而透明的 花边。 花边。
鼠疫实验室检测技术
鼠疫实验室检测
针对病原体本身的生长繁殖、生理生化特性 的检测：鼠疫菌的染色检查；鼠疫菌的培养 及鼠疫噬菌体试验；鼠疫菌的生化检查、营 养需求、毒素检测、毒力测定等。 针对病原体特异性抗原结构的检测：鼠疫F1 抗原抗体检测；鼠疫菌外膜蛋白的检测。 针对病原体遗传基因的检测：鼠疫菌的质粒 检测；鼠疫菌特异性核酸片断的检测；鼠疫 菌全基因组测定；插入序列的检测。
间接红血球凝集试验(IHA)
鼠疫菌特异性F1抗原致敏经单宁酸鞣化 处理的醛化绵羊红血球，制备成F1抗原 致敏血球，检查鼠疫特异性F1抗体。试 验方法和结果判定均为常规操作。
IHA微量法结果：
反向血球凝集试验(RIHA)
用F1抗体致敏血球，检查鼠疫特异性F1 抗原。试验方法和结果判定与IHA相同。
目标基因 fra pla 引物序列 产物长度 249 bp 456 bp 1F 5’-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3’ 1R 5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’ 2F 5’-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3’ 2R 5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’
多重PCR扩增结果
鼠疫PCR 鼠疫多重PCR
内部对照质粒与不同浓度EV菌 PCR扩增结果 多重PCR扩增结果
鼠疫菌质粒检测
鼠疫菌的三个寻常质粒： pPCP1— 6Mda(9.5kb) 编码鼠疫菌素，鼠疫菌素耐受，凝固酶和胞浆素 原活化因子； pCD1—45 Mda(70kb)编码Ⅲ型分 泌系统的质粒，即主要编码低钙反应并表达LrcV 及一系列耶尔森菌特有的Yops； pMT1— 65Mda(100kb)编码F1抗原和鼠毒素。 91001全基因组测序新发现的质粒：pCRY—长 度21742bp，具有独立复制能力，有一群编码Ⅳ 型分泌系统的基因。 质粒DNA提取---碱裂解法和热裂解法 质粒电泳分析