高效液相色谱解析
0512 高效液相色谱法公示稿
0512 高效液相色谱法公示稿高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种高效、精确的分析技术，已被广泛应用于医药、食品、环境监测等领域。
本文将从原理、应用和前景等方面进行深入剖析，为读者全面了解和掌握这一分析技术提供有价值的信息。
1. 原理解析高效液相色谱法是一种分离和分析化合物的技术，其原理基于化合物在流动相和固定相之间的分配行为。
在高压作用下，样品通过色谱柱，不同成分将以不同速度通过柱体，从而实现了对混合物中化合物的分离。
这一技术对样品的纯度、成分和结构都具有较高的分辨率，能够快速有效地进行定性和定量分析。
2. 应用领域HPLC技术在医药、食品、环境监测等领域有着广泛的应用。
在医药领域，HPLC常被用于药物的含量测定、杂质分析等，对制药行业的质量控制具有重要意义。
在食品领域，HPLC可用于食品添加剂、农药残留等有害物质的检测，保障食品安全。
HPLC技术也在环境监测领域发挥着重要作用，可用于大气、水体等环境中污染物的检测与分析。
3. 前景展望随着分析技术的不断发展，HPLC技术也在不断创新和完善。
未来，HPLC技术有望实现对更多样品、更微量成分的分析，同时提高分析的快速性和灵敏度。
在自动化和智能化方面，HPLC技术也将有更多的突破，为人类的健康和环境保护提供更可靠的技术支持。
在总结回顾本文的内容时，我们不得不承认高效液相色谱法作为一种重要的分析技术，已经在各个领域展现出了其不可替代的作用。
在日益复杂和严峻的环境和健康挑战下，HPLC技术的不断创新与完善，将为人类创造更美好的未来。
我们也需要关注HPLC技术在应用中可能面临的挑战和问题，并期待其更加广泛和深入的发展。
希望本文对读者对HPLC技术有一个全面、深刻和灵活的理解，并能够对相关领域的从业者有所启发。
笔者认为HPLC技术的发展需要更多的资金和人才投入，并呼吁相关部门和机构加大对HPLC技术的支持与推广，以促进其更快速、更广泛地应用到各个领域中。
论述高效液相色谱中常用的分离模式及工作原理
论述高效液相色谱中常用的分离模式及工作原理高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）是一种广泛应用于物质分离、纯化和定量分析的分析技术。
其高效性能主要得益于其独特的分离模式和工作原理。
在高效液相色谱中，常用的分离模式包括反相色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等。
本文将逐步解释这些分离模式的工作原理。
首先，我们来介绍反相色谱（RPLC）。
反相色谱是HPLC中最常见的分离模式。
在反相色谱中，固定相是由疏水性的支持物表面进行修饰而得到的。
样品溶液在流动相的推动下，通过与固定相之间的亲疏水相互作用来分离。
疏水性物质在反相色谱中相对亲疏水性中亲水性物质在反相色谱中相对疏水性物质分离的速度更快。
因此，反相色谱可以广泛应用于酚类化合物、脂肪酸、药物和多肽等的分离。
接下来是离子交换色谱（IEC）。
离子交换色谱是基于固定相上的阴、阳离子交换基团与样品中的离子进行离子交换作用来分离的。
在离子交换色谱中，固定相通常是一种离子交换树脂，它具有具体的功能基团，如硫酸基团、胺基团等。
在离子交换色谱中，样品溶液与离子交换树脂之间发生的离子交换反应决定着样品的分离效果。
离子交换色谱广泛应用于离子、氨基酸、蛋白质和核酸等的分离。
第三种常见的分离模式是凝胶过滤色谱（GFC）。
凝胶过滤色谱是基于样品中分子的分子大小来实现分离的。
在凝胶过滤色谱中，固定相是由合适的多孔性材料构成。
较大的分子无法穿过固定相的孔隙，因而会在流动相的推动下被留下，而较小的分子则可以穿过固定相的孔隙并进行解析。
凝胶过滤色谱常用于蛋白质、多肽、寡核苷酸和碳水化合物等的分离。
最后是亲和色谱（AFC）。
亲和色谱是基于样品分离物与固定相之间特定的亲和反应进行分离的。
在亲和色谱中，固定相常常是由一种具有亲和性和特异性的配体进行修饰得到的。
这种配体可以选择性地与目标分析物结合，而其他的干扰物则被保留下来。
氯霉素眼药水的高效液相色谱分析
通过高效液相色谱分析，可 以建立氯霉素眼药水产品的 质量标准和控制方法，为产 品的注册和上市提供科学依 据和技术支持。
THANKS
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氯霉素眼药水一般采用滴眼的方式给药，使用时需遵医嘱，避免长期使用或滥用 ，以免产生耐药性和副作用。
高效液相色谱分析简介
高效液相色谱分析是一种常用的分离和检测方法，具有分离效果好、灵敏度高、应用范围广等优点。 它通过高压泵将不同成分的混合物注入色谱柱，利用不同成分在固定相和流动相之间的分配系数差异 进行分离，再通过检测器进行检测和定量分析。
氯霉素眼药水的高效液相 色谱分析
• 引言 • 氯霉素眼药水的制备 • 高效液相色谱分析方法 • 氯霉素眼药水的HPLC图谱分析 • 结果与讨论 • 结论
01
引言
氯霉素眼药水简介
氯霉素眼、 角膜炎等。氯霉素具有抗菌谱广、作用强等特点，对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴 性菌都有较好的抑制作用。
回收率和线性范围
通过添加不同浓度的氯霉素标准品到 氯霉素眼药水中，可以测定方法的回 收率和线性范围，从而评估该方法在 实际应用中的适用性和可靠性。
与其他方法的比较
与微生物学方法的比较
将高效液相色谱法与微生物学方法进行比较，可以评估两种方法在测定氯霉素眼药水中的氯霉素含量时的准确性 和可靠性。
与其他色谱方法的比较
通过不断优化制备工艺，可以提高氯霉素眼药水的生产效率和产品质量， 降低生产成本，提升市场竞争力。
对质量控制的意义
高效液相色谱分析为氯霉素 眼药水提供了有效的质量控 制手段，可以确保产品的质
量和安全性。
分析结果可以用于监控生产 过程中的质量控制情况，及 时发现并解决潜在的质量问 题，保证产品的稳定性和可
高效液相色谱HPLC基本原理
色谱柱的温度控制：优化色谱柱的 温度提高分离效率
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色谱柱的维护：定期清洗和维护色 谱柱保证其性能稳定
色谱柱的填充：优化色谱柱的填充 方式提高分离效果
流动相的组成：有机溶剂和水
流动相的选择原则：根据样品性质和检测器类型选择
流动相的优化方法：通过改变有机溶剂和水的比例、改变有机溶剂的种类、改变有机 溶剂的浓度等方法进行优化
流动相的优化效果：提高分离效果、提高检测灵敏度、降低检测时间等
固定相的选择： 根据样品性质 和分离要求选 择合适的固定
相
固定相的粒径： 粒径越小分离 效果越好但会 增加压力和延
长分析时间
固定相的表面 处理：表面处 理可以提高固 定相的稳定性
和选择性
固定相的填充： 填充方式会影 响柱效和分离 效果常用的填 充方式有轴向 填充、径向填 充和螺旋填充
汇报人：
智能化：I技术在HPLC中的应用提 高分析效率和准确性
高通量：高通量HPLC技术的发展提 高分析速度和通量
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微型绿色环保：环保型HPLC技术的发展 降低对环境的影响和污染
气相色谱-质 谱联用：提高 检测灵敏度和
准确性
样品采集：选择合适的样品采 集方法如抽样、取样等
样品预处理：对样品进行预处 理如过滤、离心、稀释等
样品保存：选择合适的样品保 存方法如冷藏、冷冻等
样品分析：对样品进行分析如 定性、定量等
进样器选择：根据样品性质 和实验要求选择合适的进样 器
样品准备：选择合适的样品 进行适当的处理和稀释
进样操作：将样品注入进样 器确保样品完全进入色谱柱
高效液相色谱涉及的数据处理基本公式解析
高效液相色谱涉及的数据处理基本公式解析（宁波大学海洋学院赵百添）1.保留时间t R2.调整保留时间t'R扣除死时间后的保留时间,也称折合保留时间。
在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定于组分的性质，因此，t'R（或t R）可用于定性分析。
反映了被分析的组分与色谱柱中固定相发生相互作用，而在色谱柱中滞留的时间，它更确切地表达了被分析组分的保留特性。
3.死时间t M不被固定相滞留的组分，从进样到出现最大峰值所需的时间。
关系：t R=t'R+ t M4.保留体积V R从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积,又称为洗脱体积。
V R＝F × t R5.死体积V M不被固定相滞留的组分，从进样到出现最大峰值所需的流动相体积。
V M＝F × t M6.调整保留体积V'R扣除死体积后的保留体积。
V'R＝V R－V M或V'R＝F×t'R7.分配系数K指一定温度下,处于平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比，以K表示。
分配系数反映了溶质在两相中的迁移能力及分离效能，是描述物质在两相中行为的重要物理化学特征参数。
分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。
在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs、Cm 很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。
这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。
因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。
在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K 值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。
混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。
超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱
超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）是一种高级的质谱技术，结合了超高效液相色谱（UPLC）和飞行时间质谱（Q-TOF-MS）两种先进的仪器技术。
以下是对这一技术的解析：1.UPLC：超高效液相色谱是高效液相色谱（HPLC）的进化版本，它具有更高的分辨率、更快的分离速度和更小的样品用量。
UPLC使用更小粒径的柱和更高的操作压力，可以实现更高的分离效率。
2.Q-TOF-MS：四级杆串联飞行时间质谱是一种质谱仪器，包括四级杆（Quadrupole）、离子漂移室（Ion Mobility）和飞行时间质谱仪。
Q-TOF-MS 能够以高灵敏度和高分辨率检测样品中的离子，并通过测量飞行时间来确定其质荷比。
3.UPLC-Q-TOF-MS：将UPLC与Q-TOF-MS结合，可以实现高效的色谱分离和高分辨率的质谱分析。
这种组合能够提供详细的化合物分析，包括准确的质量测定、离子碎片的信息，以及高灵敏度的检测。
4.应用领域：UPLC-Q-TOF-MS 在药物分析、代谢组学、蛋白质组学、环境分析等领域得到广泛应用。
它可以用于对各种复杂样品的全面分析，有助于识别未知化合物、量化目标分子，并研究化学反应、生物代谢等过程。
5.优势：UPLC-Q-TOF-MS相对于传统的方法具有更高的分析速度、更高的分辨率、更好的敏感性和更少的样品消耗。
这使得它成为许多科研领域和实验室中的首选分析工具之一。
总体来说，UPLC-Q-TOF-MS是一种高级的分析技术，适用于对复杂混合物中化合物的详尽分析，为化学、生物和环境科学领域提供了强大的工具。
液相色谱质谱分析
质谱图是以质荷比(m/z)为横坐标、相对强度为纵坐标构 成，将原始质谱图上最强的离子峰定为基峰并定为相对强度 100％，其他离子峰以对基峰的相对百分值表示。
丙酮的质谱图
（2）离子峰的主要类型
分子在离子源中可产生各种电离，即同一分子可产生多 种离子峰：分子离子峰、同位素离子峰、碎片离子峰、重排 离子峰、亚稳离子峰等。 设有机化合物由A，B，C和D组成，当蒸汽分子进入离子 源，受到电子轰击可能发生下列过程而形成各种类型的离子：
CH3
1) 根据质谱峰的质荷比测定化合物的分子量， 推测分子式及结构式 2) 根据峰强度进行定量分析
2.质谱仪的结构
（1） 进样系统
作用：将样品分子引入到离子源中。 方式： 蠕动泵连续进样
六通阀直接进样 色谱进样系统
(2) 离子源
作用：
1. 将导入质谱仪系统的样品去溶剂化 2. 将离子源处的大气压与质谱仪系统一级 真空阻隔开 3. 被分析物离子化或将溶剂中的离子转化 成气相 4. 去除中性物质和带反极性电荷离子，否 则会对分析产生干扰
电喷雾电离源(ESI)
多电荷离子 测定的样品分子量大
(3) 质量分析器
作用: 是将不同碎片按质荷比m/z分开。 质量分析器类型：磁分析器、飞行时间、四 极杆、离子捕获、离子回旋等。
a 单聚焦型磁分析器
b 四级杆分析器
(4) 检测器
质谱仪常用的检测器有法拉第杯(Faraday Cup)、 电子倍增器及闪烁计数器、照相底片等。
分配比变化范围宽的 复杂样品应采取 梯度洗脱方式分离
流动相溶剂选 择的一般要求
1) 对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。 2) 适用于所选择的检测器。 3) 化学惰性好，以免破坏固定相。 4) 低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。 5) 纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。
高效液相色谱法HPLC
VS
报告结果
整理分析数据，撰写分析报告，提供各组 分的浓度、纯度等相关信息，为科研或生 产提供决策依据。
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实验操作步骤
流动相的准备与平衡
根据实验要求配制流动相，通过泵以适宜的流速 通过色谱柱进行平衡。
洗脱与检测
流动相带着样品经过色谱柱洗脱，各个组分依次 流出并进入检测器进行检测。
ABCD
进样
将样品注入进样器，通过压力将样品送入色谱柱 进行分离。
数据处理与结果分析
对检测器输出的信号进行处理，得到各组分的峰 形和峰面积，进行定性和定量分析。
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进样
将样品注入色谱柱。
分离
在流动相的带动下，样品中的 组分在色谱柱中进行分离。
检测
检测器对分离后的组分进行检 测，并记录信号。
数据处理
对采集到的数据进行处理、分 析和存储。
高效液相色谱仪的维护和保养
定期清洗色谱柱
使用适当的溶剂清洗色谱柱， 以去除残留物和杂质。
维护和检查检测器
定期检查检测器的性能和准确 性，确保其正常运行。
数据处理系统
用于采集、处理、分析和存储色谱数据，通常采用色谱工 作站。
高效液相色谱仪的操作流程
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样品准备
将样品进行适当处理，以 便注入色谱柱。
流动相制备
根据实验要求，选择合适 的流动相，并进行过滤和 脱气处理。
系统平衡
在进样之前，确保色谱系 统达到平衡状态，以提高 分离效果。
高效液相色谱仪的操作流程
样品的预处理
分离
对于复杂样品，需要进行分离操 作以去除杂质或提取目标成分。 常用的分离方法包括离心、过滤、
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梯度洗提，就是载液中含有两种（或更多）不同极性的 溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配 比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离 因素，以提高分离效果。梯度洗提可以分为两种：
a.低压梯度（也叫外梯度）：在常压下，预先按一定程序将 两种或多种不同极性的溶剂混合后，再用一台高压泵输入色 谱柱。
技术：采用高效固定相、高压泵、高灵敏检测器
实现：分析速度快、分离效率高、操作自动化分析。
2 通过进样器，注入样品混合物
3.由于混合物中各组分 性质不同，因而它们在 柱内移动速度不同而逐 渐分离。
1 通过高压泵，将流动相抽入柱子
4.通过检测器检测，得到组分的 电信号并进行放大；记录仪将放 大的电信号以图形形式记录下来。
目前常使用的有三种类型的输液泵，即往复柱塞泵、气动放大泵、 螺旋注射泵，它们各有优、缺点。
二、进样系统
高效液相色谱柱比气相色谱柱 短得多（约5～30c谱柱外的因素所引起 的峰展宽，主要包括进样系统、连 接管道及检测器中存在死体积。柱 外展宽可分柱前和柱后展宽。
六口旋转进样阀示意图
工作原理：手柄位于取样(Load)位置时， 样品经微量进样针从进样孔注射进定量环， 定量环充满后，多余样品从放空孔排出； 将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液 相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量 环，推动样品进入液相分析柱进行分析。
三、色谱柱
色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与 固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜 及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有 限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm， 内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往 内径较大，可达25mm 以上。一般在分离前备有一 个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这 样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱 和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保 证分离的性能不受影响。
1.高压
一般：150～300kg/cm2 ,甚至：500kg/cm2 为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压
2.高速
两相间交换千分之几秒，分析时间较经典法少很多(几分~几十分钟) 通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内可完成
3 高效
气相：2000塔板/米，液相：5000塔板/米
可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业蒸馏塔和气相 色谱的分离效能高出许多倍
液相色谱-质谱（HPLC-MS）联用是以HPLC 为分离手段，MS为检测器的一门综合性分析技术， 它集HPLC的高分离能力与MS的高灵敏度、极强的 定性专属特异性于一体的技术。它以液体溶剂作为 流动相的色谱技术，一般在室温下操作。可以直接 分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物 （包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等），分析范围 广，而且不需衍生化步骤。
四、检测系统 功能：连续地将色谱柱中流出的组分随时间
变化的情况，转变成大小不同的电信 号输入到记录仪中，得到色谱图。 按检测方式不同，分为： ①总体性质检测器（通用型） 示差折射检测器、电导检测器 ②溶质性质检测器（选择型） 紫外（最常用，对大部分有机物有响应）、荧光、 电化学检测器
五、梯度洗涤
不同点
1.应用范围： 气相：易挥发、热稳定 液相：不易挥发、热不稳定 但具有一定溶解性化合物， 不适合气体。
2.流动相作用： 气相：运载样品，不影响色 谱分离 液相：运载样品，参与、影 响色谱分离，且起主要作用。
3.分析样品： 气相：破坏样品，不能回收。 液相：不破坏样品，能回收。
ⅰ液固吸附色谱（LSC)
结果分析
黄酮类化合物 一级质谱中大多以 准离子分子形式存在，有少量碎片离 子。二级质谱中碎片信息则较少，主 要峰的质谱图见图 3 ～7。根据分析液 相中的色谱峰与总离子流图中所对应 的离子峰的质谱信息，并结合相关文 献的报道，对锦锈杜鹃 HPLC 分离出 的5 个主要峰进行分析，推断出其可能 的结构 。
（ 利用样品分子在固定相上吸附性能差异而分离）
ⅱ液液分配色谱（LLC）
（利用样品分子在两相中分配系数不同导致溶解度 不同而分离）（键合相色谱 60％） ⅲ离子交换色谱（IEC）
（利用样品分子的电荷性、导电性不同，导致对固 定相的亲合力不同而分离）
ⅳ体积排阻色谱（SEC)
（利用溶质分子大小不同导致对固定相的渗透力不 同而分离）
b.高压梯度 ( 或称内梯度系统 ) ：利用两台高压输液泵，将 两种不同极性的溶剂按设定的比例送入梯度混合室，混合后， 进入色谱柱。
质谱负离子模式的总离子流图与 356 nm 波长下紫外色谱图基本吻合， 但总离子流图的基线噪声较大。
液—质联用分析锦绣杜鹃叶黄酮类成分
1903年提出、1969～1970年开始发展
原理：以液体为相，采用高压输液系统，将具有不 同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液 等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分 被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样 的检测
4.高灵敏 紫外检测器：10－9g数量级
度
荧光检测器：10－11g(百万分之几），试样量小（几微升）
5.高选择 可分析在性质上极为相似化合物 性
（手性化合物、同位素、同分异构、空间异构）
相同点
1.都是重要的分离、分析 手段
2.气相的基本理论（塔板 理论、定性定量方法）
3.基本术语（色谱参数、 色谱图、色谱柱效）
上述每种色 谱类型均可进一 步分为多个不同 色谱方法。这些 方法可用于分析 分离，也可用于 制备分离，各色 谱方法在相关领 域应用互相补充。
一、泵系统
通用HPLC仪输液泵系统的基本要求是：提供(50-500)×105Pa的柱前 液压；输出无脉动恒定的液流；流速范围0.1-10mL/min；流速控制精度 0.5%或更好；系统组件耐腐蚀(密封性良好的不锈钢或氟塑料)。高压泵 产生的液体高压没有爆炸危险，因为液体的压缩性极小。最重要的是系 统密封性能好。