肿瘤坏死因子TNFα
小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)说明书
200 ng/L
3 号标准品
150µl 的 4 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
100 ng/L
2 号标准品
150µl 的 3 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
50 ng/L
1 号标准品
150µl 的 2 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
计算 以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的
OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数， 即为样品的实际浓度。 注意事项 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未
用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好
控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值
大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计 算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6．底物请避光保存。 7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9．本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。 保存条件及有效期 1．试剂盒保存：；2-8℃。 2．有效期：6 个月
肿瘤坏死因子α及其抑制剂的研究进展
肿瘤坏死因子α及其抑制剂的研究进展肿瘤坏死因子（TNF）α是一种在多种生物效应中起作用的细胞因子，主要由单核细胞、巨噬细胞和胸腺依赖淋巴细胞产生，分为溶解型和膜结合型。
TNFα通过与其受体（TNFR）特异性结合引起一系列细胞因子改变，进而实现促细胞生长和程序性细胞死亡并促进牙周炎、种植体周围炎以及局限性肠炎和类风湿性关节炎等疾病发展的作用。
TNFα抑制剂分为大分子抑制剂和活性小分子抑制剂，种类繁多，作用机制复杂，已大量应用于临床治疗并取得了优异的疗效；而新型TNFα抑制剂TNFR1前配体结合序列复合物对于TNFα引起的程序性细胞死亡、关节炎破骨活动有明显的抑制作用，具有治疗TNFα参与的炎性疾病的潜能。
标签：肿瘤坏死因子；肿瘤坏死因子受体；抑制剂；作用机制[文献标志码]A在牙周炎和种植体周围炎等炎性疾病中，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）α是释放最早并起枢纽作用的炎性因子，其下游的核因子（nuclear factor，NF）-κB会改变破骨细胞NF-κB受体活化因子配基和骨保护因子的表达，而RANKL与OPG间的比例变化可以参与破骨细胞的形成，导致骨的吸收。
TN Fα达到一定质量浓度时还可以直接抑制成骨细胞的增殖和分化。
TNFα不仅在种植体周围炎及其所引起的失败种植体周高表达，而且其表达水平与炎症和骨吸收的严重程度呈正相关。
在许多TNFα相关疾病的治疗过程中，TNFα抑制剂收到了明显的疗效；但是，随着有关TNFα的作用机制逐渐清晰，人们对TNFα抑制剂有着更高的期盼，希望其可以更精确地作用到疾病产生的核心步骤，更少的不良反应，又不影响TNFα在宿主防御中可能起到的有利的生物学功能。
1 TNFαTNFα是一种在多种生物效应中起作用的细胞因子，属于TNF超家族成员。
TNFα主要由单核细胞、巨噬细胞和胸腺依赖淋巴细胞（简称T细胞或T淋巴细胞）产生，其主要作用是促炎症反应发生发展和调节自身免疫，譬如炎性骨吸收、程序性细胞死亡和自身免疫疾病等。
tnf-a名词解释
tnf-a名词解释TNF-α是肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha）的简称。
它是一种由人体免疫系统产生的细胞因子，也是一种炎症性蛋白质。
TNF-α可参与多种生理和病理过程，包括免疫调节、细胞增殖和凋亡、发炎反应以及免疫细胞的激活等。
1. Elevated levels of TNF-α have been observed in patients with rheumatoid arthritis.（风湿性关节炎患者体内TNF-α的水平升高）。
2. Inflammatory bowel disease is characterized by an excessive release of TNF-α in the intestinal mucosa.（肠道炎症疾病的特征之一是肠道黏膜释放过多的TNF-α）。
3. TNF-α plays a crucial role in the pathogenesis of sepsis, a systemic inflammatory response to infection.（TNF-α在败血症（一种全身性感染引起的炎症反应）发病机制中起着关键作用）。
4. Anti-TNF-α therapies have shown promising results in the treatment of inflammatory diseases such as psoriasis and Crohn's disease.（抗TNF-α治疗在银屑病和克罗恩病等炎症性疾病的治疗中展现了良好的疗效）。
5. Increased TNF-α production has been linked to the development of insulin resistance and type 2 diabetes.（增加的TNF-α产生与胰岛素抵抗和2型糖尿病的发展相关）。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生物学活性测定
响。因为 TNF-β 细胞毒生物学作用等很多生物学效应均与 TNF-α 相似。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种主要由单核-吞噬细胞产生的单核因子，不仅具有选择性 地杀伤某些肿瘤细胞，而且有多种免疫调节作用。其检测方法主要包括生物学活性测定和免 疫学检测方法。其中细胞毒生物学检测方法敏感性较高，最为常用；免疫学检测方法包括酶 联免疫吸附试验(ELISA)和放射免疫测定法。
(一) 原理: TNF-α 受体广泛地分布于多种肿瘤细胞和血细胞，根据 TNF-α 与相应靶细胞结合后引 起不同的生物学效应，建立了多种检测 TNF-α 生物学活性方法。某些肿瘤细胞膜表面的 TNF-α 受体与 TNF-α 结合后，可导致这些肿瘤细胞的死亡，可通过检测对肿瘤细胞的杀伤 能力，来反映 TNF-α 的生物学活性。若这种肿瘤细胞先用 3H-TdR 标记，则被杀伤后３H-TdR 释放至细胞外，牽 I 通过测定肿瘤细胞释放３H-TdR 的量来反映 TNF-α 的杀伤活性。 (二) 操作步骤:
用 DYQ-Ⅱ型多头细胞收集器收集样品于 "9999"型玻璃纤维滤纸上
↓ 烤干后，进行 β 计数
结果判定:
1. TNF-α 作用 24h 后，在倒置显微镜下判定 50％L929 细胞杀伤的稀释度即为１个
TNF-α 活性单位。
2. 根据测得的 cpm 值按下列公式计数活性单位:
TNF-α 活性单位(U／ml)
对照组 cpm 值。
3. 胰蛋白酶和 DNA 酶浓度和消化时间要严格控制，犆?批酶均要摸索最适浓度和时间。
否则，消化时间过长或过短者会影响实验结果。
4. 为了增强检测系统的敏感性，在测定系统中加入放线菌素 D，但浓度不宜过大，一
般最终浓度为 0.5～1μg／ml。
TNFα信号通路在免疫系统中的作用机制
TNFα信号通路在免疫系统中的作用机制免疫系统是人体内的重要防御机制，它负责识别、攻击和清除病原体和异常细胞。
免疫系统的正常功能对于人体的健康至关重要。
然而，在某些情况下，免疫系统可能出现失调，导致炎症和疾病的发生。
TNFα（肿瘤坏死因子α）是一个重要的炎症介质，在免疫系统中发挥着关键的作用机制。
TNFα信号通路是免疫系统中的一个复杂网络，涉及多种信号分子、受体和信号途径。
当机体受到外界刺激（如感染、细胞损伤等）时，免疫细胞会产生和释放TNFα。
TNFα结合到免疫细胞表面上的受体，进而激活信号通路，触发一系列的生物学反应。
一方面，TNFα信号通路的主要作用是促进炎症反应。
TNFα能够触发免疫细胞的活化和增殖，促使它们释放趋化因子，从而吸引其他免疫细胞到炎症部位。
此外，TNFα还可促进炎症细胞的黏附和迁移，增加炎症细胞与内皮细胞之间的相互作用，从而加剧炎症反应的程度。
另一方面，TNFα信号通路也参与了免疫调节和细胞凋亡。
在免疫调节方面，TNFα能够激活特定的信号途径，调节免疫细胞的分化和功能。
例如，TNFα可以促使细胞向着炎症型免疫反应分化，增加炎症细胞的数量。
另外，TNFα还能够抑制细胞的免疫抑制功能，通过影响T细胞的活化和调节，影响免疫耐受的维持。
在细胞凋亡方面，TNFα也发挥着重要的作用。
TNFα能够促使某些细胞通过程序性细胞死亡自杀，以维护正常组织结构和功能。
这种细胞凋亡过程可以清除一些异常和受损细胞，防止它们继续分裂和繁殖，从而保护整个机体的健康。
然而，在某些情况下，TNFα也可能引发过度的细胞凋亡，导致组织破坏和疾病的发生。
除了以上作用机制，TNFα信号通路还与许多其他信号通路相互作用，如NF-κB、MAPK和JAK/STAT等。
这些信号通路能够进一步调节免疫系统的炎症反应、免疫调节和细胞凋亡等生物学过程。
通过不同的信号途径，TNFα信号通路能够实现免疫系统多种不同的功能。
虽然TNFα的正常功能对于免疫系统和机体的健康非常重要，但过度激活的TNFα信号通路也可能导致炎症性疾病的发生和发展，如类风湿性关节炎、炎症性肠病和银屑病等。
肿瘤坏死因子—α在急性胰腺炎中的作用
肿瘤坏死因子—α在急性胰腺炎中的作用细胞因子在急性胰腺炎发病机制的作用日益被重视，其中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作为急性胰腺炎发病过程中极其重要的因子及其在疾病中的作用也同样被重视。
TNF-α不仅通过对胰腺、肠道、肝脏等多器官的损伤，导致机体出现严重的炎症反应，还介导其他炎症因子的释放，加重对机体的损伤。
标签：急性胰腺炎；TNF-α急性胰腺炎（acute pancreatitis）是临床上的急腹症，其发病机制目前尚不明确。
自从1988年Rinderknecht提出了白细胞过度激活学说[1]后，细胞因子在急性胰腺炎发病机制中的作用逐渐被重视，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）作为急性胰腺炎始动因子的作用已经得到证实[2]。
现就促炎性细胞因子TNF-α在急性胰腺炎中的作用综述如下。
1 肿瘤坏死因子1.1 TNF-α的产生1975 年Carswell等发现了能使荷瘤鼠肿瘤发生出血、坏死而对正常组织细胞无明显作用的肿瘤细胞毒因子，Old将其命名为肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor TNF）。
TNF主要分为由活化T细胞产生的TNF-β和活化的单核细胞产生的TNF-α。
在人体内，产生TNF-α的主要细胞是单核巨噬细胞。
Ramudo等的研究表明，胰腺相关性腹水时胰腺腺泡细胞中的TNF-α量增加，而非单核细胞或淋巴细胞，可见腺泡细胞是真正产生TNF-a的炎症细胞[3]。
1.2 TNF-α的调节正常人循环中的TNF-α水平为（10～80）pg/mL。
在人和动物，能诱导产生TNF-α物质为LPS，静脉输入LPS后2h，血清TNF-α达到高峰，4h内恢复到基线水平。
部分细胞因子也能诱导TNF-α，例如：IFN、IL-1、IL-2等。
糖皮质激素、IL-4、IL-6、IL-10、PAF受体拮抗剂和抗MHC-Ⅱ类分子抗体等均能在转录水平或转录后水平抑制TNF-α产生。
能抑制NF-κB活性的物质（N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽等）和能抑制氧化酶的物质均能抑制TNF-α产生。
tnf-α il-6致热原理
TNF-α 和 IL-6 致热原理
TNF-α（肿瘤坏死因子-α）和 IL-6（白细胞介素-6）是促炎性细胞因子，在发热反应中发挥关键作用。
它们通过以下机制共同致热：
1. 刺激前列腺素合成：
•TNF-α 和 IL-6 刺激下丘脑垂体的花生四烯酸释放，从而导致前列腺素 E2 (PGE2) 的合成增加。
•PGE2 作用于下丘脑中的体温调节中枢，引起体温设定点的升高。
2. 抑制热消散：
•TNF-α 和 IL-6 诱导血管收缩，减少皮肤血流。
•这会降低热量的排出，导致体温升高。
3. 改变体温调节中枢的敏感性：
•TNF-α 和 IL-6 导致下丘脑体温调节中枢对体温升高的敏感性降低。
•这会阻止身体在体温上升时进行适当的热消散反应。
4. 促进热产生：
•TNF-α 和 IL-6 刺激棕色脂肪组织中的解偶联蛋白-1 (UCP-1) 表达。
•UCP-1 允许线粒体中的电子传递链绕过 ATP 合成，从而产生热量。
5. 影响神经递质释放：
•TNF-α 和 IL-6 改变神经递质，如去甲肾上腺素和血清素的释放。
•这些神经递质参与体温调节，它们的改变会影响热反应。
总之，TNF-α 和 IL-6 通过刺激前列腺素合成、抑制热消散、改变体温调节中枢的敏感性、促进热产生和影响神经递质释放，共同导致发热反应。
肿瘤坏死因子
肿瘤坏死因子（TNF-α）是免疫系统中细胞所产生的一种重要炎症因子，广泛参与到一些自身免疫疾病的病理损伤过程中。
在健康人体内，TNF-α浓度非常低，而在病患者体内则会发生成倍的增长。
TNF-α的过度表达会导致一些慢性炎症的病发，如风湿性关节炎、牛皮癣等，同时它还与败血性休克综合症、糖尿病等疾病的发生存在关联，因而是癌症和感染疾病在发病初期的一个重要标志物，实现TNF-α的高灵敏检测对于疾病诊断、遗传机理和药物传输的研究都具有重要意义。
目前有多种方法如酶联免疫法、荧光免疫检测和电化学免疫分析可用于TNF-α的检测。
为进一步提高检测的灵敏度，东南大学化学化工学院刘松琴课题组将“高分子聚合辅助的传感信号放大”概念引入到TNF-α的检测中，以SiO2作为载体在表面接枝聚合物，利用高分子动态聚合链的增长，将单个标记分子或者信号基团通过链增长而得到成千上百个重复单元，达到荧光、电化学和电化学发光信号增强的目的(Analytical Chemistry, DOI: 10.1021/ac201558w)。
首先制备粒径均一、分散性好的SiO2纳米微球，利用表面富含的羟基再修饰上聚合引发剂，选择具有生物兼容性基团的聚合单体（GMA），利用该引发剂标记的纳米微球引发A TRP反应，得到聚合物包裹的SiO2纳米微球Si/PGMA，再通过表面PGMA中的环氧基与量子点中的羧基反应结合上CdTe制得Si/PGMA/CdTe荧光纳米探针，并采用电化学发光和电化学方法对TNF-α进行了夹心免疫检测。
夹心免疫过程包括在金电极表面上先电聚合一层富含羧基的聚邻氨基苯甲酸（PAB）膜，活化羧基后结合抗体蛋白分子Ab1，并依次识别抗原Ag 和荧光纳米探针标记的二抗分子Si/PGMA/CdTe/Ab2，在检测TNF-α浓度的同时还研究了该新型纳米探针的信号放大作用。
实验过程如下图所示。
图1. Si/PGMA/CdTe/Ab2纳米荧光探针的制备过程示意图图2. Si/PGMA/CdTe/Ab2做为纳米荧光探针在夹心免疫检测中的应用示意图TEM图中可以明显看出聚合物和CdTe量子点成功包裹在了SiO2表面，并且探针分子修饰在金电极上以后仍然保持良好的荧光性质。
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人肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，细胞上清及相关液体样本中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。
用纯化的人肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α，再与HRP标记的肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的人肿瘤坏死因子α呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：450pg/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5.组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。
（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为300pg/ml，200pg/ml，100pg/ml，50pg/ml，25pg/ml）。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。
在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
注意事项：1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10.如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
（此图仅供参考）试剂盒性能：1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.92以上。
2.批内与批见应分别小于9%和15%检测范围：8pg/ml-400pg/ml保存条件及有效期：1.试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月FOR RESEARCH USE ONLYHuman Tumor necrosis factorαDrug NamesGeneric Name：Human Tumor necrosis factorα(TNF-α)ELISA Kit.PurposeThis kit allows for the determination of TNF-αconcentrations in Human serum,cell culture supernatant,and other biological fluids.Principle of the assayT he kit assay Human TNF-αlevel in the sample，use Purified Human TNF-αantibody to coat microtiter plate wells,make solid-phase antibody,then add TNF-αto wells,Combined TNF-αantibody which With HRP labeled,become antibody-antigen-enzyme-antibody complex,after washing Completely,Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed,reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of450nm. The concentration of TNF-αin the samples is then determined by comparing the O.D.of the samples to the standard curve.Materials provided with the kitMaterials provided withthe kit48determinations96determinations Storage User manual11Closure plate membrane22Sealed bags11Microelisa stripplate112-8℃Standard：450pg/ml0.5ml×1bottle0.5ml×1bottle2-8℃Standard diluent 1.5ml×1bottle 1.5ml×1bottle2-8℃HRP-Conjugate reagent3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Sample diluent3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Chromogen Solution A3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Chromogen Solution B3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Stop Solution3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃wash solution（20ml×20fold）×1bottle （20ml×30fold）×1bottle2-8℃Specimen requirements1.serum-coagulation at room temperature10-20mins，centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant,If precipitation appeared,Centrifugal again.2.plasma-use suited EDTA or citrate plasma as an anticoagulant,mix10-20mins,centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant,If precipitation appeared,Centrifugal again.3.Urine-collect sue a sterile container,centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant,If precipitation appeared,Centrifugal again.The Operation of Hydrothorax and cerebrospinal fluid Reference to it.4.cell culture supernatant-detect secretory components,collect sue a sterile container,centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant,detect the composition of cells,Dilut cell suspension with PBS（PH7.2-7.4）,Cell concentration reached1million/ml,repeated freeze-thaw cycles,damage cells and release of intracellular components,centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant,If precipitation appeared,Centrifugal again.5.Tissue samples-After cutting samples,check the weight,add PBS（PH7.2-7.4）,Rapidlyfrozen with liquid nitrogen,maintain samples at2-8℃after melting,add PBS（PH7.4）, Homogenized by hand or Grinders,centrifugation20-min at the speed of2000-3000r.p.m.remove supernatant.6.extract as soon as possible after Specimen collection,and according to the relevantliterature,and should be experiment as soon as possible after the extraction.If it can’t, specimen can be kept in-20℃to preserve,Avoid repeated freeze-thaw cycles.7.Can’t detect the sample which contain NaN3,because NaN3inhibits HRP active. Assay procedure1.Dilute and add sample to Standard:set10Standard wells on the ELISA plates coated,add Standard100μl to the first and the second well,then add Standard dilution50μl to the first and the second well,mix;take out100μl form the first and the second well then add it to the third and the forth well separately.then add Standard dilution50μl to the third and the forth well,mix;then take out50μl from the third and the forth well discard,add50μl to the fifth and the sixth well,then add Standard dilution50μl to the fifth and the sixth well,mix;take out50μl from the fifth and the sixth well and add to the seventh and the eighth well,then add Standard dilution50μl to the seventh and the eighth well,mix;take out50μl from the seventh and the eighth well and add to the ninth and the tenth well,add Standard dilution50μl to the ninth and the tenth well,mix,take out50μl from the ninth and the tenth well discard(add Sample50μl to each well after Diluting,(density:300pg/ml，200pg/ml，100pg/ml，50pg/ml，25pg/ml)2.add sample：Set blank wells separately(blank comparison wells don’t add sample and HRP-Conjugate reagent,other each step operation is same).testing sample well.add Sample dilution40μl to testing sample well,then add testing sample10μl(sample final dilution is 5-fold),add sample to wells,don’t touch the well wall as far as possible,and Gently mix.3.Incubate:After closing plate with Closure plate membrane,incubate for30min at37℃.4.Configurate liquid:30-fold(or20-fold)wash solution diluted30-fold(or20-fold)with distilled water and reserve.5.washing：Uncover Closure plate membrane,discard Liquid,dry by swing,add washing buffer to every well,still for30s then drain,repeat5times,dry by pat.6.add enzyme：Add HRP-Conjugate reagent50μl to each well,except blank well.7.incubate：Operation with3.8.washing：Operation with5.9.color：Add Chromogen Solution A50ul and Chromogen Solution B to each well,evade the light preservation for15min at37℃10.Stop the reaction：Add Stop Solution50μl to each well,Stop the reaction(the blue color change to yellow color).11.assay：take blank well as zero,Read absorbance at450nm after Adding Stop Solution and within15min.Important notes1.The kit takes out from the refrigeration environment should be balanced15-30minutes inthe room temperature,ELISA plates coated if has not use up after opened,the plate should be stored in Sealed bag.2.washing buffer will Crystallization separation,it can be heated the water helps dissolvewhen dilute.Washing does not affect the result.3.add Sample with sampler Each step,And proofread its accuracy frequently,avoids theexperimental error.add sample within5mins,if the number of sample is much, recommend to use Volley.4.if the testing material content is excessively higher(The sample OD is bigger than the firststandard well),please dilute Sample(n-fold),Please diluente and multiplied by the dilution factor.（×n×5）.5.Closure plate membrane only limits the disposable use,to avoid cross-contamination.6.The substrate evade the light preservation.7.Please according to use instruction strictly,The test result determination must take themicrotiter plate reader as a standard.8.All samples,washing buffer and each kind of reject should according to infective materialprocess.9.Do not mix reagents with those from other lots.CalculateTake the standard density as the horizontal,the ODAssay range8pg/ml-400pg/mlStorage and validity 1．Storage：2-8℃. 2．validity：sixmonths.This chart for reference only。