高效液相色谱中异常峰分析

异常峰分析
异常的色谱峰指的是色谱图中的无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。

异常峰是色谱实验工作中最棘手的问题。

这些峰严重影响色谱分析的结果。

色谱图中不可能有纯正的高斯对称峰, 轻微的拖尾是正常的, 这是由分离系统所决定的。

在此仅对几种异常峰进行分析。

1.峰前或峰后有小峰的分析
产生原因大致分为以下几种情形
(1) 样品不纯。

可改变不同的流动相和色谱柱,对样品进行分离比较, 选择合适的分离条件。

(2) 分析柱或保护柱柱头塌陷。

此情况较常见,可更换分析柱或保护柱后对峰形进行比较。

柱头塌陷时往往所有的峰都会出现峰分裂。

对色谱柱再生和清洗可以改善分离效果。

(3) 色谱柱柱容量下降。

当长时间使用后, 有一些强保留组分吸附在柱子中, 不大的进样量往往就会出现峰分裂。

用强洗脱能力的溶剂清洗色谱柱, 或更换色谱柱可使问题得到改善。

(4) 样品溶剂与流动相不匹配或进样体积过大。

当样品溶剂比流动相极性大时, 有时即使进样体积很小, 也容易出现峰变形和裂分现象。

建议用流动相溶解样品。

(5) 流动相不恰当。

此情况较罕见, 有些样品在特定的色谱条件下可能存在结构的动态平衡, 而出双峰, 这种双峰是无法分离完全的, 改变色谱条件尤其是p
H 值会使峰形正常。

(6) 样品分解。

不稳定的样品在色谱分离过程中变成其他物质而出现双峰。

这时需改变样品处理方法或色谱分离条件。

2.负峰分析
在色谱分析中有时会出现负峰或倒峰, 如图 3 中的大峰的左下就有一负峰。

出现这种现象可能是由以下几种原因引起的, 可针对不同情况进行排除, 进而使问题得到解决。

(1) 流动相吸收本底值过高。

此时可适当改变检测波长。

(2) 进样过程中进入空气。

进行排气处理, 直到基线平稳再进样。

(3) 样品组分的吸收低于流动相。

可改变流动相或改变检测波长。

(4) 配制样品的溶液与流动相不一样。

重新配制样品, 用与流动相一样的溶剂配制或稀释样品。

3.前沿、拖尾峰分析
拖尾：1 干扰峰，优化条件分离；2 色谱柱塌陷，更换色谱柱；3 流动相pH不合适，调节pH值；4 管路没有接好，存在较大的死体积，可以重新接一下。

前沿：1 溶剂选择不合适，选择合适的溶剂；2 样品过载，降低进样量； 3 柱温太低，升高柱温；4 色谱柱损坏，更换色谱柱；
图谱前沿和拖尾的原因主要是流动相选择不合适，可以相应调整流动相的极性，或者适当加入酸来调整，可以得到较好的改善。

一般来讲，酸碱在流动相中对于前沿和拖尾影响较大。

柱前沿是可能因为柱超载，拖尾是可能因为样品被污染，选择合适的流动相，调节好PH能够改善这以情况。

前辈们总是会告诉我们，拖尾峰与柱子有关，可能是过载，稀释样品再做，或换新柱做。

有时候托尾峰往往是有机性相近杂质没有分开，此时，可以优化分析方法，或更换柱子试一试；也可能由于柱子使用时间太久柱效下降出现塌陷等原因；再有也会根样品本身性质有关，基团需要流动相中添加能与之结合优化峰形的化学物质，要根据具体情况而定。

4.色谱双峰产生的可能及判断和处理
液相上有一句经典的话说得好“出两个峰肯定不是一种物质，出一个峰不一定是一种物质”。

而色谱双峰指的是明是一种物质，但在色谱图中出现双峰，而表明含二种物质。

我将这种情况分为四种原因。

1）色谱柱
如果你分析样品时发现每个色谱峰都双峰出现（出峰越快，双峰的可能性会减少），尤其采用单一纯物质时，可以肯定色谱柱出问题－柱头受损或柱头固定相变脏或
流失。

如果进样量少，原来色谱柱正常，色谱峰的形状多为一大峰带一小峰，不一定拖尾，这一般应是柱头受堵，将色谱柱反过来接，用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂，将堵在柱头的残留物冲掉，再反过来，一般情况下就行了。

当然不反冲，正冲有时也会正常的。

如果峰拖尾，双峰强弱相差不大，柱头固定相变脏或流失可能性更大，高频红外碳硫分析仪这是可以将进样那头拧开，将微孔滤片超声，柱头刮去一部分填料，重新填上新填料拧紧，不过这种活，需要一定技术，同时不能老干那种事，否则用不了几次，色谱柱就会应柱效很低而报废。

2）溶剂极性及进样量
许多HPLC分析者对此可能不以为然，一般的HPLC的书籍和文献都不会提到这方面的内容，而这确是双峰产生的一个很重要的原因。

目前HPLC分析多为反相色谱，流动相多为甲醇、乙腈、水，加各种添加剂以改善分离性能。

样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解。

最佳的溶解方法是用流动相溶解，但是很多情况是不一致的。

当用溶剂极性强度大的试剂，如纯甲醇、纯乙腈，纯乙醇，而分析体系中以水为主，样品进样量大，如定量管为20ul，此条件下完全可以肯定，单一的纯物质出双峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一样），且拖尾，保留时间会提前（相对进样量少而言），将进样量减少一半以上，峰型将变为正常。

这是样品的溶剂与流动相极性相差太大，而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的。

上面提到进样量造成双峰的一个原因，另一个原因是，进样量不一定大，但绝对量很大，色谱图上的双峰紧靠在一起，基本上齐高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色谱柱问题）。

将样品稀释再进样就可以了，这是由于进样量过大，色谱柱过载造成的。

3）样品的特性
有些样品由于其化学结构的特点，存在互变异构现象，而这种互变异构体无法分开，而是以一个动态平衡存在。

在色谱分析时，在一个特定的条件下，一种物质将出现双峰，双峰靠的很近，基本齐高，不拖尾，条件稍一变化，尤其pH，双峰现象将消失，如红霉素等。

有的样品紫外的色谱图上看不到双峰，但在LC－MS 下，用质谱检测器，其质谱的总离子流图上较明显，例如我分析过的农药啶虫眯（吡虫清）。

4）参数
记录的参数一般都内定的，不必修改，但GC和HPLC的参数是不完全一致的，例如C－R3A数据记录仪上的一般记录时间间隔GC为2ms，HPLC 为5ms，如果记录间隔时间缩短，一个峰将变为二个峰或更多。

5.鬼峰、倒峰、未出峰
6.峰裂分
裂峰产生原因的确定
样品基质复杂或分析多种样品——柱污染或部分阻塞滤片
流动相pH>=7——由于硅胶溶解导致柱塌陷(除非使用专门的柱子)
溶剂比流动相的强度大——可能产生裂峰或宽峰，由样品量决定（溶剂化效应）7.峰拖尾、峰展宽、峰前伸
峰拖尾原因的确定
评价柱选择——使用高纯度硅胶柱或不同键合技术柱
评价流动相效果——改变流动相pH和添加剂消除次级效应(流动相中组份与柱子相互作用)
减小进样量
消除柱外效应
冲洗柱子——检查柱子老化/塌陷
易记小卡片来了：其它常见峰异常问题汇总
Q&A峰问答
进行HPLC分析时，怎样才能知道某一个色谱峰是否是单一峰呢特别是分析中药成分的时候标准品加入法、DAD、还有改变流动相的组成是否能说明呢
1、多种不同原理的方法比较是首选。

2、其次采用DAD检测器进行光谱分析，如果提示不纯，估计有问题。

纯度阈值受仪器、流动相等影响，所以只能作为参考。

对于分子结构中差异有紫外吸收官能团的，dad检测器一般还是可以准确判断峰纯度的，但对于结构中无紫外吸收的那些差异，DAD检测器就无能为力了，比如某肽链中的氨基酸差异、或者一些对应异构体，dad也是无能为力的。

3、如果DAD不行，那么就需要采用质谱鉴别了，优选液质联用，如果是含盐流动相，可以采用收集不同时段的色谱流出物的方式，脱盐，进行质谱检测。

4、如果怀疑有异构体，这个就比较头疼了，非对应异构体需要二级（主要是对CID的能量有要求，可以打断侧链）的质谱才能判断侧链的区别。

对应异构体的辨别目前好像只有waters的离子淌度质谱（没做过）有一定的分辨能力，但也不是万能的。

所以峰纯度判定需要结合化合物及可能杂质的结构特点，来合理选择。