2、活菌计数法
活菌数的测定方法
活菌数的测定方法
一、直接计数法：
1.显微镜计数法：将样品通过适当稀释后涂布在平板上，然后在显微
镜下直接观察，将显示出的活菌数量进行计数。
2.罗氏计数室法：将适当稀释后的样品放在罗氏计数室中，通过显微
镜下观察菌落数并计数，然后根据稀释倍数计算活菌数。
3.涂布法：将稀释后的样品均匀涂布在琼脂平板上，在适宜温度下培
养一段时间，然后观察并计算菌落的数量。
二、间接计数法：
1.白细胞计数法：用白细胞计数板进行白细胞计数，由于白细胞数与
活菌数有一定的相关性，可以通过白细胞计数的结果进行推算。
2.生物标志物法：通过检测样品中特定的生物标志物，如ATP、葡萄
糖等，间接反映出活菌的数量。
3.代谢产物测定法：通过测定样品中的代谢产物（如氧气消耗量、二
氧化碳产生量等），间接推测出活菌的数量。
以上是常见的活菌数测定方法，不同的方法适用于不同的实际应用场景。
在选择测定方法时，需要考虑样品类型、检测目的、测定时间和精确
度等因素。
另外，为了提高测定结果的准确性，还需要严格控制实验条件，如温度、湿度、培养时间等。
最后，需要注意的是，活菌数的测定方法只能提供大致数量，无法直
接得到准确的数值。
因此，在进行活菌数测定时，需要结合其他的检测方
法和数据进行综合分析。
微生物活菌计数方法
杂菌数 亿/g
细菌杂菌 (亿 / g ) 10 8 19 .3 10 4
100 0.19 10 .10 0.1
重复 1 2 3 菌落 平均数
稀释倍数 （霉菌在马丁培养基 上） 103 104 105 6 / / 7 / / 8 / / 7.0 /
3
/
霉菌数 个/g 0.69×106
两个稀 释倍数 度菌落 数之比 / / / 1.1 2.5 / /
菌数 亿 /g,mL 25.3 3.2 0.38 0.30 / 0.032 0.015
无法数 无法数 无法数 313 289 无法数 32 15 315 38 32 136 5 3
3.2 标准差
标准差(Standard Deviation) ：各数据偏离平均数的距离 （离均差）的平均数，它是离差平方和平均后的方根。用δ表 示。标准差体现随机变量取值与其期望值的偏差。 标准 NY411-2000 固氮菌肥料的7.2.6.2。
浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正 比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表 示样品菌液浓度。根据浊度计算出细菌的数量。该方法一 般可以估计出细菌的数量级。
经常用于一些特殊的微生物的快速计数，如光合细菌和
藻类的测数。但是由于该方法仅能估测菌数，不能准确定 量，而且由于一些颗粒和添加剂的作用，不能正确反映该 样品的质量，所以在质检过程中不予采用。
微生物活菌平板计数方法和技术
微生物肥料和食用菌菌种质检中心 曹凤明
微生物计数方法种类
1. 2. 3.
直接计数法 核酸计数法 活菌计数法（培养法）
MPN（Most-Probable-Number ）最大可能数法 混菌法 平板技术法
常见微生物计数法汇总!(一)
常见微生物计数法汇总!（一）引言概述：微生物计数是一种常见的实验方法，用于定量估计和检测环境中的微生物数量。
常见微生物计数法有许多种，本文将汇总介绍其中的几种常用计数方法。
一、直接计数法1. 显微镜计数法：使用显微镜观察培养皿中的微生物数量，通过数在视野中出现的微生物来估算总数。
2. 填充网格计数法：使用遗传学细胞计数板或计数室将细胞封装在微小方格中进行计数。
3. 浓度计算法：通过对微生物液体培养物的稀释以及菌落形成数量进行计算，从而估算原始液体中微生物的数量。
4. 流式细胞仪计数法：利用流式细胞仪对细胞进行连续识别和计数，快速且准确。
二、间接计数法1. pH法：通过确定微生物在特定pH值下的生长情况来计算微生物的数量。
2. 活菌数测定法：使用平板法、涂布法和滤膜法等方法，根据菌落形成数量来计算微生物的数量。
3. 光密度测定法：利用光密度计测量微生物培养物中细胞浓度对光的吸光度，从而计算微生物的数量。
4. ATP测定法：通过测量微生物中的ATP含量来估算微生物数量。
5. 核酸测定法：通过分子生物学技术，测定微生物DNA或RNA的含量，计算微生物数量。
三、表面计数法1. 培养基涂布法：将待测样品均匀涂布在培养基表面，按规格标准进行观察和计数。
2. 表面化学计数法：通过使用表面活性剂或化学溶液对微生物进行杀灭，并利用计数技术计算杀灭的微生物数量。
3. 扫描电子显微镜计数法：利用扫描电子显微镜观察样品表面的微生物数量，并进行计数。
4. 膜过滤计数法：将待测液体通过微孔膜过滤，然后在培养基上进行培养和计数。
四、生物传感器计数法1. pH微电极法：利用微电极检测微生物生长过程中产生的H+离子浓度变化。
2. 导电性测定法：利用微生物生理代谢活性所产生的电导率变化进行计数。
3. 生物发光法：利用荧光素酶或细菌荧光素所产生的可见光等特性进行计数。
五、图像处理计数法1. 数字图像处理法：利用图像处理软件进行图像分析，自动或半自动计数微生物数量。
第六章普通微生物学课后习题及答案2
一、名词解释灭菌：指采用某种强烈的理化因素杀死物体中所有微生物的措施，包括病原微生物和非病原微生物。
消毒：只利用某种较温和的方法以杀死、消除或降低材料或物体上的病原微生物，使之不能引起疾病的方法；它可以起到防止感染或传播的作用。
防腐：指在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长繁殖但又未完全致死微生物的一种措施，它能防止食物腐败或防止其他物质霉变，这是一种抑菌作用。
共生关系：两种微生物紧密结合在一起形成一种特殊的共生体，在组织和形态上产生了新的结构，在生理上有一定的分工。
互生关系：两种可以单独生活的生物，当它们生活在一起时，通过各自的代谢活动而有利于对方，或偏利于一方的生活方式。
寄生关系：指一种生物生活在另一种生物的体内或体表，从中取得营养和进行生长繁殖，同时使后者蒙受损害甚至被杀死的现象。
前者称为寄生物，后者称为寄主或宿主。
拮抗关系：由某种生物所产生的某种代谢产物可抑制他种生物的生长发育甚至杀死它们的关系。
分批培养：将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获的培养方式。
连续培养：又称开放培养在一个恒定的容积的流动系统中培养微生物，一方面以一定速率不断加入新的培养基，另一方面有以相同的速率流出培养物，以使培养系统中的细胞数量和营养状态保持恒定。
纯培养：在适宜条件下培养纯种得到的培养物。
微生物纯种分离：将多种混杂微生物经某种技术或方法分离成纯种的过程。
混菌培养：两种或两种以上的微生物加以调节控制，不会互相干扰，生长不受抑制，生长在一起的培养方法。
二元培养：由两种具有特定关系的微生物组成的混合培养物。
同步培养：使培养物中所有的微生物细胞都处于相同的生长阶段的培养方法连续培养：又称开放培养在一个恒定的容积的流动系统中培养微生物，一方面以一定速率不断加入新的培养基，另一方面有以相同的速率流出培养物，以使培养系统中的细胞数量和营养状态保持恒定。
恒浊连续培养：根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养方法。
细菌计数方法
细菌计数1.计数器测定法：即用血细胞计数器进行计数。
取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。
由于计数室的容积是一定的，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。
本法简便易行，可立即得出结果。
本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法:电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。
因此，要求菌悬液中不含任何碎片。
3、活细胞计数法常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。
取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。
此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。
使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。
4、比浊法比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。
细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。
此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。
5、测定细胞重量法此法分为湿重法和干重法。
湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。
此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。
测菌体浓度的方法
测菌体浓度的方法
测菌体浓度的常用方法主要有以下几种：
1. 直接计数法：这是一种非常简单的检测方法，利用计数板或计数仪直接得出细菌数目。
首先制备细菌悬液，取一定体积的样品细菌悬液置于细菌计数板的计数池内，用显微镜观察计数。
根据计数室刻度内的细菌数，计算样品中的含菌数。
特点为所需设备简单，测定结果较准确，可迅速得到结果，而且在计数的同时能观察到所研究微生物的形态特征。
不能区分是否为细菌，不能区分活细菌和死细菌。
2. 电子计数器计数法：也属于直接计数法，其工作原理类似于血细胞分析仪，测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细菌，当一个细菌通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。
因此，要求菌悬液中不含任何碎片。
3. 活菌计数法：常用的有平板菌落计数法（cfu法），其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。
如需更多关于“测菌体浓度”的详情，建议查阅生物技术专业相关书籍或文献资料，也可咨询该领域专业人士获取帮助。
微生物计数法
微生物计数法1）血球计数板法:血球计数板是一种有特别结构刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表比两平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央0.1mm2面积上刻有400个小方格。
通过油镜观察，统计一定大格内微生物的数量，即可算出1毫升菌液中所含的菌体数。
这种方法简便，直观，快捷，但只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子进行计数，并且所得结果是包括死细胞在内的总菌数。
2）染色计数法：为了弥补一些微生物在油镜下不易观察计数，而直接用血球计数板法又无法区分死细胞和活细胞的不足，人们发明了染色计数法。
借助不同的染料对菌体进行适当的染色，可以更方便的在显微镜下进行活菌计数。
如酵母活细胞计数可用美蓝染色液，染色后在显微镜下观察，活细胞为无色，而死细胞为蓝色。
3）比例计数法：将已知颗粒（如霉菌孢子或红细胞）浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度。
这种计数方法比较粗放。
并且需要配制已知颗粒浓度的悬液做标准。
4）液体稀释法：对未知菌样做连续十倍系列稀释，根据估计数，从最适宜的三个连续的10倍稀释液中各取5毫升试样，接种1毫升到3组共15只装培养液的试管中，经培养后记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查最大或然数表MPN（most probablynumber）得出菌样的含菌数，根据样品稀释倍数计算出活菌含量。
该法常用于食品中微生物的检测，例如饮用水和牛奶的微生物限量检查。
5）平板菌落计数法：这是一种最常用的活菌计数法。
将待测菌液进行梯度稀释，取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在凝固前均匀混合，或将菌液涂布于已凝固的固体培养基平板上。
保温培养后，用平板上出现的菌落数乘以菌液稀释度，即可算出原菌液的含菌数。
一般以直径9cm的平板上出现50-500个菌落为宜。
但方法比较麻烦，操作者需有熟练的技术。
活菌计数的方法及在药典中的应用
活菌计数法在药典中的应用 平皿法 薄膜过滤法
用稀释液稀释成1∶10、1∶102、 1∶103 等稀释级的供试液。
一、 平皿法
方法 取供试液1ml，置直径90mm 的无菌平皿中，注入15～20ml 温
度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母 浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种 培养基至少制备2 个平板。 凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备2 个平板，均不得有菌 生长。
阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基， 培养和计数 除另有规定外，细菌培养3 天，霉菌、酵母菌培养5 天。
逐日观察菌落生长情况；点计菌落数。必要时，可适当延长培养时间 至7 天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点 计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报 告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的 菌落数不能相差1 倍或以上。
注
膜过滤法
膜过滤法是当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海 水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并 经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上 ( 或一定面积中 ) 的 细菌数
比浊法
比浊法原理是在一定范围内，菌的悬液中细胞浓度与混浊度成 正比。即与光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可以借 助于分光光度计，在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光 密度 (O ． D ． ) 表示菌量。实验测量时一定要控制在菌浓 度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。微生物计数法， 发展迅速，现有多种多样的快速、简易、自动化的仪器和装置 等方法。
基本操作：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。
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④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中 的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。
（四）统计菌落数目
计数法
显微镜直接计数 活菌计数法 比浊法 膜过滤法
• 土壤中分解尿素的细菌的分离 与计数过程 • 土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中，用无菌 小铁铲铲去表层土，迅速取土壤并装入无菌 信封密封 • ↓ • 制备培养基 准备选择培养基，以尿素为唯 一氮源制备9个平板培养基 • ↓
在做本课题实验时，利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍 数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。 1、A同学筛选出150个菌落。 2、B同学筛选出50个菌落。 B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分 解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，只是自己所用的土壤样品 不同，但此时也拿不出能令人信服的证据。 请你帮助A同学改进实验，提供具有说服力的证据。 分析：一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误 (或者是混入了其 他的含氮物质)。 究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。 一种方案是可以由其他同学用与 A同学一样的土样进行实验，如果结果与 A同 学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基 的配制有问题。 另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白 对照，以证明培养基是否受到污染。
培养观察 将培养基平 板倒置于30～37℃温室 中培养1～2天，每隔 24h统计一次菌落数目， 选取菌落数目稳定时的 记录作为结果。 ↓ 菌落计数 常用稀释涂 布平板法，设计如下表 格记录并计数
稀释 度
104
105
106
平 平均 平均 1 2 3 均1 2 3 12 3 值 值 值 菌落 数 /平板 菌数/ 克土 壤
能。只有产生脲酶的 细菌能利用尿素作为氮源而生 存。
将上述物质溶解后， 用蒸馏水定容到 1000mL。
缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长繁 殖，而受到抑制，所以用此培养基能够选择出分解尿素的微生物。
（四）统计菌落数目
1、显微镜直接计数：
（1）方法：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样 品中微生物的数量。 （2）缺点
1.怎样才能从土壤中分离出分解尿素的细菌呢？
二、研究思路Βιβλιοθήκη （一）筛选菌株a.提出的问题
—如何寻找耐高温的酶？
水生耐热细菌Taq ( Thermus aquaticus ) 耐高温的Taq DNA聚合酶 美国微生物学科布鲁克（T.Brock) 1966年发现耐热细菌
b.解决问题的思路
—寻找耐高温环境；
一、课题背景
1、尿素的利用
尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。 土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。
2、细菌利用尿素的原因
土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶
CO(NH2) +
H2O
脲酶
NH3 +
CO2
3、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒 状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分 解尿素。
专题2 微生物的培养与应用
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分 离与计数
1.分离微生物的原理
2.利用选择培养基分离细菌
3.统计细菌数目的方法
尿素的发现历史
1773年，伊莱尔· 罗埃尔（Hilaire Rouelle）发现尿素。1828年，德国化学家弗 里德里希· 维勒首次使用无机物质氰酸铵（NH4CNO，一种无机化合物，可由氯化铵和 氰酸银反应制得)与硫酸铵人工合成了尿素。本来他打算合成氰酸铵，却得到了尿素。 尿素的合成揭开了人工合成有机物的序幕，实际上开辟了有机化学。
c.原理
—高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，耐高温菌种提取耐高温酶。
寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 启示： 要求，到相应的环境中去寻找。
（二）实验室中微生物的筛选原理：
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、 温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 :要分离某种微生物，必须根据该微生物的特 点，包括营养、生理、生长条件等方法： ⑴抑制大多数微生物不能生长， ⑵造成有利于该菌生长的环境。
不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；
（四）统计菌落数目
1、显微镜直接计数： 2、活菌计数法（间接计数法) （1）操作方法： 稀释涂布平板→统计菌落数 （2）原理：
当样品的稀释度 足够高时，固体培养 基表面生长的一个菌 落，来源于样品稀释 液中的一个活菌。
样品的稀释 在火焰旁称取土壤10g，放入 盛有90mL无菌水的三角烧瓶中，振摇使土 样与水充分混合，将菌分散。制成101倍土 壤稀释液，用一支1mL无菌吸管从中吸取 1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水试管中， 吹吸三次，使充分混匀，制成102倍土壤稀 释液，以此类推制成103、104、105、106 倍土壤稀释液 ↓
（三）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需 培养基
KH2PO4 NaHPO4 MgSO4 H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 1.4g 2.1g 0.2g 10.0g 1.0g 15.0g
（1）该培养基的配方中，为微生物 的生长提供碳源和氮源的分别是什么 物质？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素 （2）此配方能否筛选出产生脲酶的 细菌？为什么？
1个菌落→1个活菌 （3）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实 际数目低，因此统计结果一般用菌落数表示。 每克样品中的菌株数=（C/V)* M 其中C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V:所用稀释液的体积； M:稀释倍数。
例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。 从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数 分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163 作为统计结果。
你认为这两位同学的作法正确吗？ 如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值
（四）统计菌落数目
2、活体计数法（间接计数法)
①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板 上进行计数。 ②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上 的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。 ③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。
结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板 稀释等方法对它进行纯化培养分离。
概念：选择培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长， 同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌
加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌
不加氮源的无氮培养基:分离自生固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞