活菌计数技术
活菌数的测定方法
活菌数的测定方法
一、直接计数法：
1.显微镜计数法：将样品通过适当稀释后涂布在平板上，然后在显微
镜下直接观察，将显示出的活菌数量进行计数。
2.罗氏计数室法：将适当稀释后的样品放在罗氏计数室中，通过显微
镜下观察菌落数并计数，然后根据稀释倍数计算活菌数。
3.涂布法：将稀释后的样品均匀涂布在琼脂平板上，在适宜温度下培
养一段时间，然后观察并计算菌落的数量。
二、间接计数法：
1.白细胞计数法：用白细胞计数板进行白细胞计数，由于白细胞数与
活菌数有一定的相关性，可以通过白细胞计数的结果进行推算。
2.生物标志物法：通过检测样品中特定的生物标志物，如ATP、葡萄
糖等，间接反映出活菌的数量。
3.代谢产物测定法：通过测定样品中的代谢产物（如氧气消耗量、二
氧化碳产生量等），间接推测出活菌的数量。
以上是常见的活菌数测定方法，不同的方法适用于不同的实际应用场景。
在选择测定方法时，需要考虑样品类型、检测目的、测定时间和精确
度等因素。
另外，为了提高测定结果的准确性，还需要严格控制实验条件，如温度、湿度、培养时间等。
最后，需要注意的是，活菌数的测定方法只能提供大致数量，无法直
接得到准确的数值。
因此，在进行活菌数测定时，需要结合其他的检测方
法和数据进行综合分析。
微生物活菌计数方法
杂菌数 亿/g
细菌杂菌 (亿 / g ) 10 8 19 .3 10 4
100 0.19 10 .10 0.1
重复 1 2 3 菌落 平均数
稀释倍数 （霉菌在马丁培养基 上） 103 104 105 6 / / 7 / / 8 / / 7.0 /
3
/
霉菌数 个/g 0.69×106
两个稀 释倍数 度菌落 数之比 / / / 1.1 2.5 / /
菌数 亿 /g,mL 25.3 3.2 0.38 0.30 / 0.032 0.015
无法数 无法数 无法数 313 289 无法数 32 15 315 38 32 136 5 3
3.2 标准差
标准差(Standard Deviation) ：各数据偏离平均数的距离 （离均差）的平均数，它是离差平方和平均后的方根。用δ表 示。标准差体现随机变量取值与其期望值的偏差。 标准 NY411-2000 固氮菌肥料的7.2.6.2。
浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正 比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表 示样品菌液浓度。根据浊度计算出细菌的数量。该方法一 般可以估计出细菌的数量级。
经常用于一些特殊的微生物的快速计数，如光合细菌和
藻类的测数。但是由于该方法仅能估测菌数，不能准确定 量，而且由于一些颗粒和添加剂的作用，不能正确反映该 样品的质量，所以在质检过程中不予采用。
微生物活菌平板计数方法和技术
微生物肥料和食用菌菌种质检中心 曹凤明
微生物计数方法种类
1. 2. 3.
直接计数法 核酸计数法 活菌计数法（培养法）
MPN（Most-Probable-Number ）最大可能数法 混菌法 平板技术法
活菌计数实验报告稀释蜂蜜
活菌计数实验报告稀释蜂蜜
1、直接计数法：
这是一种非常简单的检测方法，我们可以利用计数板或计数仪直接得出活菌数目。
2、活菌稀释蜂蜜计数板：
首先制备活菌悬液，蜂蜜取一定体积的样品活菌悬液置于活菌计数板的计数池内，用显微镜观察计数。
根据计数室刻度内的活菌数，计算样品中的含菌数。
特点：所需设备简单，测定结果较准确，可迅速得到结果，而且在计数的同时能观察到所研究微生物的形态特征。
不能区分是否为活菌，不能区分活活菌和死活菌。
单位：个/mL计算方法：
（1）25×16的计数板：
每毫升活菌数量=（100小格内的细胞数/100）×400×1000×稀释倍数。
（2）16×25的计数板：
每毫升活菌数量=（80小格内的细胞数/80）×400×1000×稀释倍数。
3、电子计数器计数法：
电子计数器也属于直接计数法，其工作原理类似于血细胞分析仪，测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个活菌，当一个活菌通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在
电子记录装置上。
计数单位：x个/mL。
特点：该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为活菌。
因此，要求菌悬液中不含任何碎片。
活菌计数操作方法
活菌计数操作方法
活菌计数是一种用于确定样品中活着的微生物数量的技术。
下面是一种常见的活菌计数操作方法：
1. 准备培养基：选择适当的培养基，根据需要添加适当的营养物质和抑制微生物生长的物质。
2. 取样：从样品中取一定量的液体或固体样品。
对于液体样品，可以直接取样；对于固体样品，需要将其加入适量的缓冲液中进行均匀分散。
3. 稀释：将取样的液体稀释为一系列不同浓度的溶液。
这样做是为了确保培养基中的微生物数量处于可计数范围内。
4. 接种：将已稀释的样品溶液分别加入培养皿或培养瓶中，然后将培养皿或培养瓶密封。
5. 培养：将密封的培养皿或培养瓶放置在适当的温度和湿度下进行培养。
不同的微生物需要不同的温度和环境条件。
6. 计数：在培养一定时间后，使用显微镜或其他计数装置进行活菌的观察和计数。
活菌通常会产生可见的生长。
7. 计算：根据每个培养皿或培养瓶中观察到的活菌数量，结合稀释倍数和取样量，计算出原始样品中的活菌数量。
注意事项：
- 操作过程需要做好无菌操作，以防止细菌的交叉感染。
- 操作要求精确和细致，避免误差的出现。
- 需要根据需要选择适当的物品和仪器来进行实验。
- 操作过程中应注意安全，避免对自身和他人造成伤害。
三种细菌计数方法的比较
三种细菌计数方法的比较细菌计数是微生物学中一项重要的实验技术，用于确定细菌菌群的数量。
在微生物学研究、医学和食品工业等领域中，细菌计数方法的准确性和可行性非常关键。
目前，常用的三种细菌计数方法包括直接计数法、密度计数法和滴定计数法。
本文将对这三种方法进行比较，包括原理、优缺点和适用范围。
直接计数法是通过显微镜观察，直接计算视野中的细菌数量来进行计数的方法。
该方法简单快捷，不需要进行培养过程。
其中，常用的直接计数方法有暗视野法、荧光显微镜法和流式细胞术。
这些方法可以直接观察到不同形态和大小的细菌，并且可以获得准确的结果。
此外，直接计数法还可以用于测定活菌和死菌的比例，对于评估细菌的生物活性非常有用。
然而，直接计数法对设备要求较高，需要专业的显微镜和技术操作，而且适用于底浓度的细菌样本。
与直接计数法相比，密度计数法是细菌计数中常用的一种方法。
该方法通过将细菌样本适当稀释至能观察到单个菌落形成的数量范围，并在琼脂培养基上培养并计数菌落的数量来确定细菌的数量。
密度计数法的优点是适用于各种样品类型，并且可以进行定量计数。
此外，该方法还可以通过调整稀释倍数来适应不同细菌的菌落形成能力。
但是，密度计数法需要进行培养过程，时间较长，并且无法区分活菌和死菌。
滴定计数法是通过逐渐稀释细菌悬液，将其滴定到琼脂培养基上，然后通过滴定液的颜色变化或者生长的细菌落的数量来确定细菌的数量。
与密度计数法类似，滴定计数法也需要进行培养过程。
但是，滴定计数法具有简单、快捷、经济的特点。
同时，滴定计数法可以通过改变滴定液浓度来适应不同样本中细菌的菌落形成能力，并且可以计算出细菌的最概然数。
然而，滴定计数法对于有颜色的样本适用性较差，因为颜色会干扰滴定液的颜色变化。
此外，滴定计数法无法区分活菌和死菌。
综上所述，三种细菌计数方法各自有其优点和局限性。
直接计数法可以获得准确的结果，适用于底浓度的细菌样本，但要求设备和技术较为专业。
密度计数法能够进行定量计数，适用于各种样品类型，但需要进行培养过程。
活菌计数法
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平板法
上述平皿法还可以将稀释的菌液取 0.2ml 加到已制备好的平板上，然后用无菌涂棒将 菌液涂布整个平板表面，放入适宜温度下培 养，计算菌落数，再按上公式计算出每毫升 原菌液的所含活菌总数。
薄膜过滤法
原理：将供试液通过已灭菌的膜过滤器。然后将滤 膜置于适宜培养基上培养，计算长出的菌落数。
操作：取相当于每张滤膜含1g、1ml 或10cm2 供试 品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤； 若供试品所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供 试液1ml 进行试验。用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓 冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜。冲洗后取出滤 膜，菌面朝上贴于适宜培养基平板上培养。
每毫升原菌液活菌数＝同一稀释度三个以上重复平皿
菌落平均数×稀释倍数× 5
❖ 注意： 此法可因操作不熟练造成污染，或因 培养基温度过高损伤细胞等原因造成结果不 稳定。但由于该方法能测出样品中微量的菌 数，仍是常用的一种测定细菌数的有效方法。 细菌、酵母、芽孢与孢子等的数量均可用此 法测定。但不适于测定样品中丝状体微生物。
活菌计数法
活菌计数的方法
❖ 平皿法 ❖ 平板法 ❖ 薄膜过滤法 ❖ 比浊法
平皿法
原理：每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条 件下可以通过生长形成菌落。
操作：将待测样品经一系列 10 倍稀释，然后选择 三个稀释度的菌液，分别取 0.2ml 放入无菌平皿， 再倒入适量的已熔化并冷至 45℃ 左右的培养基， 与菌液混匀，冷却、待凝固后，放入适宜温度的培 养箱或温室培养，长出菌落后，计数，按下面公式 计算出原菌液的含菌数：
平板分离技术与活菌计数
实验六平板分离技术与活菌计数实验报告一．实验目的1.掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化徽生物的基本操作技术。
2．初步观察来自土壤中的三大类群微生物的菌落形态特征。
3．学习平板菌落计数的基本原理和方法,并掌握其基本技能。
二．实验原理值得指出的是从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显徼镜检测个体形态特征等综合考虑。
有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
平板分离法主要有：①平板划线分离法，②稀释涂布平板法。
后者除能有效分离纯化微生物外，还可用于测定样品中活菌数量。
平板菌落计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上；经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。
统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。
由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个菌落不一定是单个细胞生长繁殖面成，有的可能来自2个或多个细胞。
因此，平板菌落计数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用菌落形成单位（colony-forming unit, CFU）取代以前用绝对菌落数来表示样品活菌含量的原因。
平板菌落计数法虽然操作较繁琐，结果需要培养一段时间才能获得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该方法能直接反映样品中活细胞数量，所以被广泛用于生物制品(如活菌制剂)、食品、饮料、水（包括水源水）以及多类产品等质量检测与控制的标准方法。
快速细菌自动稀释仪和自动菌落计数仪则提供快速准确的结果。
土壤是微生物生存的大本营，所含徼生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，人们可以从中分离﹑纯化获得许多有价值的菌株。
本实验将采用3种不同的培养基从土壤中分离不同类型的徽生物。
统计活菌数目的方法
统计活菌数目的方法
统计活菌数目是微生物学研究中的一项重要工作，它可以帮助
我们了解微生物在不同环境条件下的生长繁殖情况，为我们提供科
学依据，指导我们进行微生物的应用和管理。
下面将介绍几种常用
的统计活菌数目的方法。
首先，最常见的方法是平板计数法。
平板计数法是通过将待测
样品均匀涂布在琼脂平板上，然后进行培养，最后根据菌落的形成
情况来进行统计。
这种方法简单易行，可以直接得到微生物的数量，是实验室中常用的一种方法。
其次，滤膜法也是一种常用的统计活菌数目的方法。
滤膜法是
将待测样品过滤到滤膜上，然后将滤膜放置在含有适宜培养基的琼
脂平板上进行培养，最后进行菌落计数。
这种方法适用于含有大量
微生物的样品，可以避免样品中微生物的聚集现象，得到更加准确
的结果。
另外，流式细胞术也是一种现代化的统计活菌数目的方法。
流
式细胞术是通过将待测样品中的微生物染色，然后通过流式细胞仪
进行检测，最后得到微生物数量的统计结果。
这种方法操作简便，
速度快，可以对微生物进行快速准确的检测，适用于大批量样品的统计。
除了上述方法外，还有一些其他的统计活菌数目的方法，如膜过滤法、MPN法等。
这些方法各有特点，可以根据具体的实验要求和样品特点进行选择。
综上所述，统计活菌数目的方法有很多种，每种方法都有其适用的范围和特点。
在进行微生物统计工作时，我们应该根据具体的实验要求和样品特点，选择合适的方法进行统计，以保证结果的准确性和可靠性。
希望本文介绍的方法对大家有所帮助，谢谢阅读！。
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摘自《消毒技术规范》2002版（中华人民卫生部）第25-27页
2.1.1.3 活菌培养计数技术
2.1.1.
3.1 适用范围
测定细菌悬液、菌片、采样液等样本中含有活菌的数量。
2.1.1.
3.2 试验器材
（1）刻度吸管（1.0ml 、5.0ml ）。
（2）稀释液：见附录A 。
（3）营养琼脂培养基：见附录A 。
（4）电动混合器
2.1.1.
3.3 操作程序
本规范要求在杀菌试验中的活菌培养计数统一使用倾注法。
其操作程序如下。
（1）对菌悬液可直接进行培养计数。
对菌片、采样棉拭与小型固体样本等，应将其上的细菌洗下成为菌悬液后进行培养计数。
洗菌时，一般以稀释液为洗液。
具体方法如下: 取含 5.0ml 稀释液无菌试管，对菌片或小型固体样本直接投入即可，对棉拭则将其采样端剪入管内，每管一份样本。
而后，用电动混合器混合20s （或在手掌上用力振敲 80 次），将菌洗下形成菌悬液。
以上操作应严格按无菌要求进行。
（2）将试管按需要数量分组排列于试管架上， 每管加入 4.5ml 稀释液。
各组由左向右，逐管标上 10-1、10-2、10-3......等。
（3）将菌悬液样本在用电动混合器混合20s （或在手掌上用力振敲 80次），随即吸取 0.5ml 加至 10-1 管内。
（4）将 10-1 管依前法用电动混合器混合20s （或在手掌上用力振敲 80次），混匀，再吸取出0.5ml 加入10-2 管内。
如此类推，直至最后一管。
必要时，还可作某稀释度的1:1或1:4稀释。
（5）选择适宜稀释度试管（以预计生长菌落数每平板为 15cfu ～300cfu 者为宜），吸取其中混合均匀的悬液 1.0ml 加于无菌平皿内。
每一稀释度接种 3个平皿。
一般需接种2个～3个不同稀释度。
平皿加样前，应先按组编号，以免弄混。
（6）将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基，倾注于已加入样液的平皿中，每平皿15ml ～20ml 。
（7）将平皿盖好，即刻轻轻摇动混匀，平放于台上。
待琼脂凝固后，翻转平皿，使底向上，置37℃温箱内培养。
（8）每日观察细菌生长情况。
培养至规定时间（细菌繁殖体为 48h ，白色念珠菌与细菌芽孢为 72h ），计数最终结果的菌落数。
（9）对菌片和采样棉拭洗液的活菌培养计数，先按各试验要求处理（如去除残留消毒剂等），而后取其最终样液按上法进行培养计数。
（10）计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。
以菌落数在15cfu ～300cfu 的平板为准，每个稀释度 3 个平板生长菌落数全合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合上述标准，则以该合格的两个平板菌落的平均值为结果。
但对黑曲霉菌活菌计数及杀灭试验时，平板菌落数应在15cfu ～100cfu 之间。
对估计菌量极少的样本（如消毒处理后样本），在培养计数时可不作稀释，即使平板菌落数未达15时，亦可用其计算最终结果。
将求得的平均菌落值，再乘以稀释倍数，即得每毫升原样液中的菌量。
菌量单位为cfu 。
2.1.1.
3.4 活菌计数中技术操作误差的测定
试验者在活菌计数中因技术操作而引起的菌落数误差率（平板间、稀释度间）不宜超过10%。
对误差率的自检，可按以下公式计算。
（1）平板间误差率计算公式：
%100⨯=平板间菌落平均数
平板间菌落数平均差平板间误差率
平板数的绝对值之和各平板菌落数平板间菌落平均数平板间菌落数平均差)(-=
平板数
各平板菌落数之和平板间菌落平均数=
（2）稀释度间误差率计算公式：
%100⨯=
稀释度间菌落平均数
稀释度间菌落数平均差稀释度间菌落数误差率 稀释度数
的绝对值之和各稀释度菌落数稀释度间菌落平均数稀释度间菌落平均差)(=
稀释度数
和各稀释度平均菌落数之稀释度间菌落平均数=
2.1.1.
3.5 注意事项 （1）严格无菌操作，防止污染。
（2）认真检查试验器材有无破损（要特别注意试管底的裂痕和破洞），以防丢失样本和污染环境。
（3）注意菌液的均匀分散。
（4）稀释或取液时要准确，尽量减少吸管使用中产生的误差。
（5）每吸取一个稀释度样液，必须更换一支吸管，以减少误差。
（6）样液接种于平皿后应尽快倾注营养琼脂培养基，避免样液干燥于平皿上，影响结果的准确性。
（7）倾注时琼脂培养基温度不得超过45℃，以防损伤细菌或真菌。
倾注和摇动时，动作应尽量平稳，以利细菌分散均匀，便于计数菌落。
勿使培养基外溢，以免影响结果的准确性和造成环境的污染。
（8）为提高试验成功率，最好先用浊度计对原菌液含菌量做出估计，尽可能在首次试验时所取的有限稀释范围内（2个～3个 稀释度）即有长菌在 15cfu ～300cfu 之间的平板。
（9）结果计算时，必须弄清稀释倍数，以免计算错误。