瘤胃发酵试验方法
瘤胃微生物类群的多样性及其综合发酵的研究进展
ｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ） 在瘤胃中常被检测到。如降解淀粉为主的 Ｒ． ｂｒｏｍｉｉ（ Ｋｒａｕｓｅ 等， １９９９） ； 降解纤维为主的 Ｒ． ｆｌａｖｅ－ ｆａｃｉｅｎｓ 在孙 云章 （ ２００５） 的 研 究 中 占 测 序 克 隆 子 中 比 例 为 ２．０８％； 在 Ｋｒａｕｓｅ 等 （ １９９９） 报 道 中 占 有 ２．２％的 比例， 是以粗饲为主的反刍动物瘤胃中的常在菌类。
狭义遗传多样性是指种内基因的变化， 包括种内 Ｓｕｎｄｓｅｔ 等 （ ２００７） 对 ｒｅｉｎｄｅｅｒ 瘤 胃 微 生 物 １６Ｓ ｒＲＮＡ
ｇｅｎｅ 的测序结果表明 Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ 的比例为
王梦芝 ， 扬 州 大 学 动 物 科 学 与 技 术 学 院 ， 博 士 ， ２２５００９， 江 苏省扬州市文汇路东路 １２ 号。
用于构建系统树的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列 ６ ２０５ 个， 而随着 ｃｌｕｓｔｅｒｓ） （ Ｐｒｙｄｅ 等， ２００２） 。
研究的不断深入，还有新发现的序列不断上传，丰富瘤
瘤胃中除有种类繁多的革兰氏阳性菌外尚存在一
胃微生物的基因库，足以说明其遗传多样性的丰富。 定比例的同样种类繁多的革兰氏阴性菌（ 安登第，２００３） 。
和基因表达具有很大的差异。目前，据 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列 维二糖、蔗糖、淀粉和糖原等几种 ＣＨＯ， 主要产生或只 同源分析建立的核糖体小亚基 １６Ｓ ｒＤＮＡ 和 １８Ｓ ｒＤＮＡ 产生丁酸， 其 ＤＮＡ 的 Ｇ＋Ｃ 摩尔百分比是 ４２．３％。据
体外法研究米曲霉培养物对瘤胃发酵参数及微生物酶活性的影响
Ｄ Ｎ Ｓ 法ｌ ８ ｌ 测定 ； 剩余 培养 物 于４ ５ ￣ Ｃ 下 烘 干备 用 。选取 酶 活性 最高 的Ａ Ｏ Ｃ 用 于瘤 胃体 外产 气试 验 。 １ ． ２ 米 曲霉 培养 物 的体外 产 气试 验 １ ． ２ ． １ 瘤 胃液 来 源 瘤 胃液 取 自３ 头装 有 永 久性 瘤
米 曲霉 （ Ａ ｓ ｐ ｅ ｌ ｌ ｕ ｓ ｏ ｒ ｙ ｚ ａ ｅ ）是一 种好气性 丝状真
１ ． １ ． ３ Ａ Ｏ Ｃ ￥ ￣ 备
取培 养 基 １ ０ ｇ ／ 份 放入 ２ ５ ０ ｍ Ｌ 锥 形
菌， 在 食 品发酵 工业 中应 用历史 悠 久 ， 被美 国食 品与
药 物管 理局 （ Ｆ Ｄ Ａ） 列 为 安全 性 菌种 【 ｌ ｌ ， 其 安全 性 也受 到世 界卫生组织 的公认Ｉ ２ Ｉ 。米 曲霉 是一类 产复合 酶 的
２ Ｏ １ ３ 年 第４ ９ 卷 幕１ １ 期
Ｎ ｕ ｔ ｒ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ Ｆ ｅ ｅ ｄ ｓ ｔ ｕ ｆ ｆ ｓ・营 荠 饲 烈
体 外法研究米 曲霉培养物对 瘤 胃发酵 参数及微生物酶活性的影响
孙 华 ， 吴跃 明 ， 李亚学， 杨 凡 ， 彭永佳 ， 刘 建 新
瓶， 加入 １ ０ ｍ Ｌ 蒸馏水 ， 于１ ２ １ ℃下 高压 灭 菌 ２ ０ ａ ｒ ｉ ｎ ， 冷 却 至 室温 后按 １ Ｘ １ ０ ６ ／ ｇ 接 种 米 曲霉 孢 子 悬 浮液 ， 于
３ ０ ￣ Ｃ 培养 箱 中培养 ，培养 ２ ４ ｈ 开始至 １ ２ ０ ｈ 每隔１ ２ ｈ
酶特 性为标 准研 制米 曲霉 培养 物 ， 体 外 法研 究Ｏ 、 ３ 、 ６ 、 １ ２ ｍ ｇ 米 曲 霉 培 养 物 对 瘤 胃发 酵 和 微 生 物 酶 活 力 的 影 响
牛粪便筛分析
牛粪便筛分析
1、通过感官了解粪便中未消化的饲料颗粒的多少来分析饲料的消化率，判断瘤胃的发酵情况。
2、原理
用三层筛(表2)将粪便过滤，未消化的饲料颗粒因大小不同而分布于不同层的筛上，颗粒大的在上层。
3、方法
取样(要求有代表性，至少占牛群头数的10%)—冲洗—涮洗(要求最后流出的水接近清水)—分层比较(整理成厚度一致的圆饼形，比较面积)
4、感官评定
各层的存留物及比例(顶层：完整的谷物颗粒，大的粗料颗粒;中层：破碎的谷物颗粒，中等大小的粗料颗粒;底层：细小饲料残渣等。
5、结果分析
粪便中颗粒的粒度不应超过7毫米，如果粪便中颗粒粒度过长，表明瘤胃通过率太高。
各层达理想比例时，瘤胃效率高，瘤胃养分达最佳平衡，可以作为评估副产品的快速通过率，评估奶牛生产性能的有力工具。
奶牛粪便的分析评判虽不能对营养问题提供确定的回答。
但它的确是一个很有用的诊断工具，对许多营养问题的发生，它能给予很多的暗示和问题解决的启示。
结合其他的诊断工具，可帮助解决营养问题。
瘤胃微生物体外发酵过程与注意事项
瘤胃微生物体外发酵过程与注意事项瘤胃微生物体外发酵过程通常由以下步骤组成：1. 选择合适的培养基：瘤胃微生物在体外培养需要合适的培养基来提供必要的营养物质和生长因子。
常用的培养基包括Ruminal Fluid Medium和Grain Medium等。
2. 收集瘤胃液：可以通过手术方式或经皮逆行注射等方法收集健康反刍动物的瘤胃液作为发酵的种子物质。
收集过程中需要注意避免污染，确保瘤胃液的质量。
3. 调整酸碱度和温度：瘤胃微生物主要在弱酸性条件下进行发酵，一般采用pH 6.5-7.0的培养条件。
此外，适宜的温度也是促进微生物生长和发酵的关键因素。
4. 添加底物和营养物质：添加适量的底物（如纤维素、淀粉、蛋白质等）和营养物质（如维生素、无机盐等）是瘤胃微生物体外发酵的必要步骤。
不同的瘤胃微生物有不同的营养要求，因此需要根据具体情况进行配方。
5. 保持氧气供应：瘤胃微生物主要是厌氧生物，因此在培养过程中需要注意排除氧气的影响。
可以通过使用密闭容器或添加还原剂等方法来维持适宜的厌氧条件。
6. 监测发酵过程：通过定期取样分析微生物数目、发酵产物和代谢产物的变化等指标，来监测瘤胃微生物体外发酵的进展和效果。
在进行瘤胃微生物体外发酵时，需要注意以下事项：1. 严格控制实验条件：如pH、温度、厌氧条件等，确保实验结果的准确性和可重复性。
2. 避免污染：在采集瘤胃液和进行发酵过程时，要避免外界杂质的污染，以避免对实验结果的影响。
3. 合理选择培养基和底物：根据瘤胃微生物的特点和需求，选择合适的培养基和底物，以提供必要的营养和生长因子。
4. 注意安全问题：一些瘤胃微生物可能产生有害物质或是具有致病性，因此在操作过程中需要注意个人安全保护，如戴手套、口罩等。
总之，瘤胃微生物体外发酵是一项复杂的实验操作，需要严格控制实验条件，避免污染，并注意安全问题，以确保实验的成功实施和准确性。
奶牛瘤胃发酵及调控
食 物 。 对地不 与人类 竞争食 物 。奶 牛瘤 胃中栖居 着 相
大 量 的 微生 物 ， 料 中 的 营 养 成 分 在 瘤 胃 中 可 被 微 生 饲
中营养物 质 的利 用率或 提 高生奶 质量 ， 奶 牛发酵有 使 利 方 面达 到最 佳 ， 发酵 损失 降 到最 小 ， 内外 动 物 营 国
养 学 家 、 物 化 学 家 和 微 生 物 学 家 对 瘤 胃发 酵 进 行 了 生
果 是脂 类 的质 和量 发生 明显变 化 ： 大部 分不饱 和脂 ①
肪 酸 经 微 生 物 作 用 变 成 饱 和 脂 肪 酸 。 必 需 脂 肪 酸 减 少 。瘤 胃是 一 个 高 度 还 原 的 环 境 ， 物 氢 化 是 瘤 胃 脂 生 肪 消 化 的 一 个 重 要 过 程 。 粮 中 ９ ％以上 的 含 多 个 双 饲 ０ 键 的 不 饱 和 脂 肪 酸 被 氢 化 ， 化 作 用 必 须 在 脂 类 水 解 氢
２ 瘤 胃发 酵 调 控 方 法
２１ 通 过 饲 喂方 式 来 调 控 瘤 胃 发 酵 ． ２１ 增 加 饲 喂 次 数 ．． １ 维 持 瘤 胃 内 稳 定 而 又 有 规 律 的 发 酵 是 提 高 养 分
碳 水化 合物 在瘤 胃内 的降解 产物为 乙酸 、 酸 和 丙
丁酸等挥 发性 脂 肪酸 （ Ｆ 。淀粉 、 类等 非结 构性 利 用效 率 ， 别是提 高微 生物 菌体 蛋 白（ Ｃ ） 成 的 Ｖ Ａ） 糖 特 Ｍ Ｐ合 碳 水化 合物 在 细菌 和真 菌作 用 下 ， 降解 较 快 ， 产物 中 关 键 ， 喂次 数影 响采食 和瘤 胃内乳 酸浓度 。每 天饲 饲 丙酸 比例较 高。 而结构 性碳水 化合物 （ 主要指粗 纤维 ） 降解 较慢 ， 以细 菌和真 菌消化 为 主。细菌 和真 菌伏贴
连续培养瘤胃模拟发酵的工作参数设置研究进展
连续培养瘤胃模拟发酵的工作参数设置研究进展伍梦楠;沈维军;张佩华;陈东【摘要】体外培养法作为反刍动物营养学研究的重要方法，主要有批次培养法和连续培养法两种。
由于连续培养法能够更好地模拟瘤胃内发酵情况，其应用也更为广泛。
但连续培养瘤胃模拟装置的主要运行参数多，如温度、pH、稀释率、缓冲液与瘤胃液接种比、搅拌速率与方式等，且不同运行参数设置以及参数的组合对试验结果影响较大，因此作者在总结前人研究结果的基础上，就不同工作参数对连续培养瘤胃模拟发酵过程中挥发性脂肪酸、干物质消失率、pH、酶活、原虫数量、微生物蛋白等指标的影响进行了综述。
%In vitro culture method is an important way to research in ruminant dietetics,including batch and continuous culture methods.Because the continuous culture method can better simulate the conditions of fermentation in rumen,it was applied more widely.There are many operation parameters of rumen simulation technique involved in continuous culture,such as temperature, pH,dilution rate,the proportion of buffer to rumen fluid,stirring rate andway,meanwhile,dif-ferent operation parameters and their combinations will have a great influence on the fermentation results.On the basis of summarizing the results of previous studies,the authors review the effects of different parameters on volatile fatty acid,dry matter disappearance rate,pH,enzyme activity,number of protozoa and microbial protein,in dual-flow continuous culture system in this paper.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2017(044)001【总页数】7页(P106-112)【关键词】体外培养;连续培养系统;运行参数【作者】伍梦楠;沈维军;张佩华;陈东【作者单位】湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410000;湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410000;湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410000;湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410000【正文语种】中文【中图分类】Q482反刍动物营养传统研究方法主要有体内法或半体内法，均需要利用活体动物进行试验。
体外法研究植物精油对瘤胃体外发酵和甲烷生成的影响
体外法研究植物精油对瘤胃体外发酵和甲烷生成的影响体外法研究植物精油对瘤胃体外发酵和甲烷生成的影响植物精油对瘤胃体外发酵和甲烷生成的影响是近年来的热点研究领域。
瘤胃是许多反刍动物消化系统中的特殊部位，其内部含有大量的微生物群落。
这些微生物通过一系列的发酵作用帮助动物消化木质纤维素等难以降解的物质，并产生甲烷气体作为代谢产物。
然而，甲烷气体的排放是温室效应的一个重要因素，因此，寻找能够有效抑制瘤胃甲烷生成的方法对环境保护和畜牧业发展具有重要意义。
植物精油是从植物中提取的挥发性油状物质，具有广谱的生物活性。
许多研究表明植物精油具有抗菌、抗氧化、抗炎等多种药理作用。
近年来，越来越多的研究开始关注植物精油对瘤胃微生物群落和甲烷生成的调节作用。
这些研究主要通过体外实验方法，模拟瘤胃内环境，研究植物精油对瘤胃微生物的生长、代谢产物的生成以及甲烷生成的影响。
第一步，研究人员需要收集瘤胃液样本，这些样本可以从宰杀的反刍动物胃部获取。
然后，研究人员将瘤胃液与培养基混合，在体外条件下模拟瘤胃发酵过程。
接下来，研究人员将不同浓度的植物精油添加到体外培养体系中，观察其对瘤胃微生物的生长繁殖的影响。
为了进一步研究植物精油对甲烷生成的调节作用，研究人员可以使用气相色谱等技术测定体外发酵液中甲烷的生成量。
研究结果表明，不同类型的植物精油对瘤胃微生物的生长和代谢产物的生成具有不同的影响。
例如，茴香精油和柠檬精油被发现具有较强的抑制作用，可以有效地降低瘤胃甲烷生成。
这是由于茴香精油和柠檬精油中的化合物具有抗菌作用，可以抑制瘤胃内甲烷产生菌的生长和代谢活性。
而其他类型的植物精油则可能对瘤胃微生物的生长产生促进作用，增加发酵液中挥发性脂肪酸等代谢产物的生成。
值得注意的是，体外法研究植物精油对瘤胃微生物群落和甲烷生成的影响只是一种初步的研究方法，研究结果可能与实际动物体内情况存在一定的差异。
此外，植物精油的添加浓度、种类和使用方法等因素都会影响研究结果的可靠性和实用性。
牛胃生理实验报告
一、实验目的1. 了解牛胃的结构及其生理功能。
2. 掌握牛胃消化过程中的重要环节。
3. 分析牛胃对不同饲料的消化能力。
二、实验原理牛胃分为四个室：瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃。
瘤胃和网胃是反刍动物特有的胃室，主要负责发酵和软化食物。
瓣胃和皱胃则与单胃动物的胃相似，负责分泌胃液进行消化。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜牛胃、饲料（如草料、精料等）、生理盐水、pH试纸、试管、滴管等。
2. 实验仪器：解剖显微镜、天平、温度计、计时器等。
四、实验步骤1. 解剖牛胃：将新鲜牛胃取出，沿胃大弯切开，观察瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃的结构特点。
2. 瘤胃发酵实验：取一定量草料，加入瘤胃，观察瘤胃内微生物发酵情况，记录pH值变化。
3. 网胃软化实验：取一定量精料，加入网胃，观察网胃对精料的软化作用，记录软化程度。
4. 瓣胃和皱胃消化实验：取一定量草料和精料，分别加入瓣胃和皱胃，观察胃液分泌情况，记录pH值变化。
五、实验结果与分析1. 瘤胃发酵实验：瘤胃内pH值在发酵过程中逐渐降低，说明瘤胃内微生物对草料进行了发酵。
2. 网胃软化实验：网胃对精料的软化作用明显，说明网胃在反刍动物消化过程中起到了重要作用。
3. 瓣胃和皱胃消化实验：瓣胃和皱胃内pH值在消化过程中逐渐升高，说明胃液分泌有助于食物的消化。
六、讨论与结论1. 牛胃是反刍动物特有的消化器官，其结构复杂，功能多样。
2. 瘤胃和网胃是反刍动物消化过程中的关键环节，负责发酵和软化食物。
3. 瓣胃和皱胃与单胃动物的胃相似，负责分泌胃液进行消化。
4. 本实验结果表明，牛胃对不同饲料的消化能力较强，为反刍动物提供了丰富的营养来源。
七、注意事项1. 实验过程中要严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性。
2. 注意实验材料的新鲜度，避免影响实验结果。
3. 实验过程中要密切观察实验现象，做好记录。
八、实验体会与建议1. 通过本次实验，我们对牛胃的结构和生理功能有了更深入的了解。
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瘤胃体外发酵方法绞股蓝皂甙对山羊瘤胃菌群及微生物发酵特性和甲烷产量的影响_王新峰1.2瘤胃液的采集和培养基制备瘤胃液来自4头装有永久性瘤胃屡管的波尔山羊与本地山羊的杂交成年公山羊,日粮以羊草为主,每日补饲1509精料(精料组成,玉米:豆粕=2:1),自由饮用清洁水。
于晨饲前采集瘤胃液,用4层纱布过滤,与培养基按1:2混合,在39℃培养箱中培养30分钟,并充分通入CO2,进行厌氧分装,每瓶60mL。
每升培养基中含有15.71mg CaCl2·2H2O,11.90mg MnCl2·4H2O, 1.19mg CoCl2·6H2O, 9.52mg Fe Cl3·6H2O, 0.143g MgSO4·7H2O, 76.2mgNaOH, 0.95gNH4HCO3, 8.33g NaHCO3, l.36g Na2HPO4, 1.48g KH2PO4, 2.98g Na2S·9H2O和0.298g盐酸半肌胺(Menke等,1979)1.3试验设计试验根据绞股蓝皂试添加量(0、5、10、20和40 mL /60mL)分为5组,对照组不加皂试,实验组分别加入5,10,20和40mg皂试。
取60mL瘤胃液与培养基混合液(瘤胃液:培养基二1:2)分装于160mL的发酵瓶中,每瓶含0.69底物"底物由精料和粗饲料组成(3:7),精料为玉米和豆粕,分别为0.126和0.054g,粗饲料为0.42g羊草草粉(过1mm筛)。
发酵瓶封盖!气压平衡后置于39℃培养箱中培养,并定时摇匀,培养24h。
第二次发酵培养120h,分别在0,1,2,4,6,8,12,24, 48,72,96,120h, 计算出累积产气量;测定120h后干物质消失率。
1.4指标测定1.4.1产气量的测定根据Theodorou等(1994)的方法,使用气压转换器(IGER,UK)定时测定厌氧瘤胃微生物发酵产气量。
根据各产气量和气压进行校正,除去空白发酵瓶产气量,计算出累积产气量。
4.3挥发性脂肪酸的测定取发酵液样品lmL加25%偏磷酸和巴豆酸(内标法,100mL溶液中含巴豆酸0.6464g)混合液0.2mL,-20℃冰箱保存。
测定前解冻,12,000rpm离心lomin,取上清液0.6uL测定。
优化胡伟莲方法测定VFA(胡伟莲,2005),柱温130℃,进样器温度为180℃,检测器温度为180℃)。
高纯氮总流量30.2mL/min,柱流l.7mL/min,氢气流量40mL/min,空气流量4O0mL/min。
4.4氨态氮浓度测定将样品与0.2N盐酸等体积混合,于-20℃保存。
测定前解冻,于4℃条件下,10,000rpm离心l0min,取上清液采用比色法进行测定分析(weatherburn,1967)"4.5微生物蛋白浓度测定取瘤胃内容物7ml保存在-20℃冰箱"测定前解冻,取3ml混匀样品在1,000rpm/min,离心8分钟去除原虫和饲料残渣。
取2ml上清液在25,000Xg离心20分钟(Makkar等,1982)。
取10ul上清液加入到5ml考马斯亮蓝溶液中,在595nm波长下读取吸光度值,以牛血清蛋白为标准溶液计算样品微生物蛋白含量。
1.4.6原虫计数将混匀发酵液4层纱布过滤后与9%甲醛等比例混合避光保存,用改装的血细胞计数板计数。
改装后计数板的计数室高度为0.25mm,以确保较大体积原虫也能被计数(Newbold 等,1987。
4.7氢的还原力根据Demeyer(1991)挥发性脂肪酸和CH4产量计算,计算公式:2Hr(%)=(4M+2P+2B)*100/(1A+P+4B)其中,A,乙酸;P,丙酸;B,丁酸;M,C执(以上均为净摩尔产量)。
对瘤胃微生物发酵参数的影响1材料与方法1.1试验动物、日粮组成与试验设计试验动物为4只1岁左右、体重在30士2.3kg波尔山羊与本地山羊杂交的一岁阉公羊采用4x4拉丁方设计,日粮组成为70%的羊草,20%的玉米及10%的豆粕(代谢能,2742.5kcal/kg;粗蛋白,12.96%;粗纤维,22.33%)。
每期为16天,适应期H天,采样时间为5天,共4期。
两次于8:00和17:00点等量瘤胃灌注。
对照组以与试验组相同体积生理盐水灌注,自由饮用清洁水。
2样品采集与分析饲料采食量分别在每期的11-13天测定。
记录每日饲料添加量和剩余料量,以干物质为基础计算采食量"饲喂后第14天,分别在采食前0h和采食后2,4和8h利用负压通过瘤胃痰管采集瘤胃内容物,用四层纱布过滤去除大的饲料残渣后,迅速测定瘤胃内容物的pH值,将过滤后瘤胃液分成4份。
取上述过滤的瘤胃液一份,将瘤胃液与25%偏磷酸溶液按5:1比例进行混合-20℃冷冻保存,以备vFA测定(Jouany,1982),其中25%的偏磷酸溶液中含有6.4g/l的巴豆酸(内标测定vFA)(Cottyn和Boucque,1968).冷冻瘤胃液解冻后于12,ooo×g/min在4℃条件下离心l0min,取上清液0.6u上气相测定vFA含量。
气相色谱仪(岛津,GC-14B,日本)具有氢离子火焰检测器,毛细柱为No.34292-07B,30m×0.32rnm×0.25四膜(Supelco,美国)。
汽化室温度为180℃,柱温135℃,检测室温度180℃，高纯氮总流量30.2mL/min,柱流1.7mL/min,氢气流量40mL/ min,空气流量400mL/ min。
根据Demeyer(1991)的方程计算CH4产量和氢利用率。
方程如下:瘤胃可发酵有机物(FOM)gmol-1 vFA=162(0.5A+0.5P+B) vCH4产量(Lkg-1FOM)=(1.8A一l.1P+l.61B)×l000×22.4(4×v)2Hr(%)=(4M+2P+2B)×100/(2A+P+4B),其中A,乙酸;B,丁酸;P,丙酸;M,CH4。
.以上均为净摩尔数。
第二份取4ml瘤胃液样品加入等量的0.2mol/L的盐酸-20℃冷冻,用比色法测定氨态氮浓度,波长为625nm。
样品解冻后在4℃条件下15,000×g离心15min,上清液用来测定氨态氮浓度(Chaney,1962)"第三份取7ml样品-20℃保存用于微生物蛋白的测定"室温解冻,取3ml混匀样品,1,000r/min离心8min除去原虫和饲料残渣.取上清液2ml在25,000×g离心20min,去除上清液,沉淀中加入0.5mL0.25N氢氧化钠溶液,100℃煮沸10min，取100ul上清液加入到5ml 考马斯亮蓝溶液中,在595nm条件下比色读取吸光度值。
以结晶牛血清白蛋白为标准品做标准曲线计算样品微生物蛋白含量。
对原虫、产甲烷菌及细菌区系的影响1材料与方法1.1动物、试验设计及采样同本章第一节。
1.2用于原虫PCR/DGGE分析的样品保存及引物比较比较-20℃冷冻保存和液氮保存PCR/DGGE的样品效果及两对常用瘤胃原虫PCR/ DGGE 引物的筛选.2.1实验动物和瘤胃内容物的收集随机选取4只(A、B、C和D)装有永久性瘤胃瘩管的波尔山羊与本地山羊杂交后代,自由采食全粗料。
实验期间分别于饲喂前0h和饲喂后1、2、4和8h从山羊瘤胃采集瘤胃内容物,4层纱布过滤,迅速投入液氮和-20℃保存以备瘤胃微生物基因组DNA的提取。
1.2.2瘤胃内容物总DNA的提取参照Zoetendal等(1998)方法,将液氮和-20℃保存样品室温解冻,取解冻后混匀的瘤胃内容物样品1.smL,珠磨法机械破碎内容物后,用酚和氯仿/异戊醇提取瘤胃内容物总DNA。
1.2.3PCR扩增反应以瘤胃内容物总DNA为模板,两对原虫特异性引物进行比较,对原虫的185rRNA进行特异PCR扩增扩增"引物序列见表2-2。
1.3山羊瘤胃微生物基因组DNA提取本章第一节所采集瘤胃液样品迅速保存在液氮中以备基因组DNA提取（DNA提取效果优于冷冻,见原虫DGGE方法优化部分)(Zoetendal等,1998)。
所提取基因组DNA用于原虫、细菌和产甲烷菌区系及微生物的定量分析。
1.4瘤胃微生物的DGGE引物表2-2试验中使用的PCR引物Table 2-2 The primers used in the experiment使用特异的原虫、细菌和产甲烷菌DGGE引物(表2-2)扩增原虫18srDNA、细菌和产甲烷菌16srDNA。
使用Bio-Rad Dcode系统进行DGGE电泳,8%的丙烯酸胺溶液制成30-50%的梯度凝胶对原虫区系分析,8%的丙烯酞胺溶液制成38-53%的梯度凝胶对细菌区系分析,6%的丙烯酞胺溶液制成30-70%的梯度凝胶对产甲烷菌区系分析。
先200V预电泳10min,然后85V电泳16h。
对DGGE胶进行银染(Muyzer,1993)。
DGGE胶上主要的和特异的条带用洁净的刀片和枪头切下移入。
1.5ml离心管中,37℃或室温过夜再进行PCR扩增,纯化PCR产物后测序,在GenBank上比对寻找最相似菌。
对山羊瘤胃微生物数量的影响1材料与方法1.1试验设计本章第一节山羊在体试验不同时间点的DNA样品进行分析研究,以山羊瘤胃总细菌为参照,对瘤胃中methanogens,fungi,R.flavefaciens和F.succinogenes的相对数量进行定量分析。
1.2仪器设备!试剂与耗材实时定量PCR仪(ABI7300,美国)如图2-12。
实时定量PCR反应采用SYBR Green染料法,荧光染料预混试剂为SYBR Green Realtime PCR master Mix with ROX(TOYOBO,Japan)。
实时定量PCR反应在八联管上进行(Axgen,USA)表2-4 定量PCR引物Table 2-4 PCR Primers for qPCR assay1.3原虫计数取瘤胃液与等量9%的甲醛溶液混合,于4℃保存用于原虫计数。
样品需进一步稀释以便于计数,原虫总数和五种原虫在显微镜下计数(Newbold,1987)。
为保证所有个体大小不同原虫都能被准确计数,对计数板进行了改装,使计数室高度增加为0.25mm。
1.4定量PCR反应体系与扩增条件使用上述DNA样品对瘤胃微生物进行了定量分析(如总菌,真菌,产甲烷菌,黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌),以上微生物的特异性引物见表2-4(Denman等,2006)。
使用荧光染料SYBR Green进行标记,使用瘤胃微生物特异性引物,对微生物进行PCR扩增,根据定量PCR 的循环数对微生物进行相对定量分析(ABI 7300,USA)(Denman等,2006;Chen等,2008)。