真菌多糖药理作用及其提取_纯化研究进展

第29卷第2期河南工业大学学报(自然科学版)Vol .29,No .22008年4月Journal of Henan University of Technol ogy (Natural Science Editi on )Ap r .2008收稿日期:20080227基金项目:河南工业大学引进人才专项(2007BS023)作者简介:李磊(1985),男,河南平舆人,硕士研究生,研究方向为微生物与生化药学3通讯作者文章编号:16732383(2008)02008706真菌多糖药理作用及其提取、纯化研究进展李　磊,王卫国3(河南工业大学生物工程学院,河南郑州450001)摘要:真菌多糖由于其独特的生理活性及结构,有望成为保健食品与药品行业重点开发的新资源之一.本文综述了近年来国内外关于真菌多糖药理作用的研究现状及其提取与纯化的基本方法与过程,并结合当前实际分析了真菌多糖在医疗保健、动物养殖及其他行业的应用与发展前景.关键词:真菌多糖;药理作用;发酵;提取;纯化中图分类号:TS201.2 文献标识码:B0　前言多糖也称聚糖,是一类广泛存在于动物细胞膜、植物及微生物细胞壁中,由醛糖或酮糖通过糖苷键连接在一起的天然高分子化合物.多糖是自然界中糖类的主要存在形式,根据生物来源的不同,可将其分为植物多糖、动物多糖、微生物多糖,其中微生物多糖(尤其是真菌多糖)是至今研究的较为深入和广泛的一类多糖.真菌多糖系真菌中分离出的由10个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子聚合物,是从真菌子实体、菌丝体或发酵液中分离出的,可以控制细胞分裂、分化,调节细胞生长和衰老的一类活性多糖[1].研究表明,真菌多糖具有非常广泛的生物学活性,如免疫调节、抗肿瘤、降血压、降血脂、降血糖、抗衰老、抗氧化、抗病毒、抗辐射、抗血栓和抗凝血等作用.因此,真菌多糖的药理作用及其提取、纯化技术已成为国内外众多学科领域研究的热点之一,本文就真菌多糖在该方面的相关研究进行了综述.1　真菌多糖的主要药理作用自1958年B rander 报道了酵母细胞壁多糖(Zy mosan )具有抗肿瘤作用以来,人们对真菌多糖产生了浓厚的兴趣,并对真菌多糖的化学结构、生物活性进行了深入细致的研究,取得了丰硕的成果[2-3].目前,对于真菌多糖的药理作用的研究报道主要集中在以下几个方面:1.1　免疫调节作用研究表明,真菌多糖主要是通过对淋巴细胞、巨噬细胞、网状内皮系统等的作用来调节机体的免疫功能.作为生物反应调节剂,它不仅能够激活T 、B 淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK )等免疫细胞,还能活化补体,促进细胞因子的生成,全面发挥对机体的调节作用[4].Nanba [5]曾研究了灰树花多糖(PGF )D -组分对各种免疫细胞的激活作用,结果发现小鼠i p0.5mg/kg 或ig1.0mg/kg 灰树花D -组分10d 后,自然杀伤细胞(NK )、细胞毒T 细胞、迟敏T 细胞分别增至1.5～2.2倍,白介素-1和超氧负离子的量也得到了提高,白介素-2提高至1.7倍.另外,李海花[6]在实验中发现灰树花多糖在180mg/kg 和120mg/kg 剂量下,可明显增强小鼠吞噬细胞的吞噬功能,增强小鼠的体液免疫能力,并能提高小鼠免疫器官的重量;而Fang 等[7]研究发现金针菇多糖也能增加荷瘤小鼠脾脏重量、NK 细胞活性和淋巴细胞转化刺激指数,恢复和增强小鼠的免疫功能.1.2　抗肿瘤作用实验表明,大多数真菌多糖的抗肿瘤作用是通过增强宿主免疫调节功能来实现的,它可以从根本上提高机体免疫功能,如能激活机体的免疫88　河南工业大学学报(自然科学版)第29卷细胞并促进其增殖与分化,增加效应免疫细胞的数量,从而达到抗肿瘤作用.从自古就有“仙草”之称的灵芝中提取得到的活性成分灵芝多糖(G LP)便很具有这类抗肿瘤真菌多糖的代表性.CHE N J ian2J i等[8]曾利用灵芝多糖40mg/(kg・d)×17d对小鼠肉瘤(S-180)和宫颈癌(U-14)进行实验,结果得到其平均抑瘤率分别为43%和51%,从而说明G LP有很好的抗肿瘤作用.Bao2Mei Shao等[9]研究发现灵芝多糖可通过增强机体免疫力,从而显示出抗肿瘤细胞的活性,它能活化BALB/c鼠的B细胞和巨噬细胞;而L I U Gao2Q iang等[10]则发现灵芝多糖除通过免疫介导作用发挥抗癌作用外,其抗癌的可能机制还包括活化促分裂原活化蛋白(MAP)激酶,以及抑制肿瘤血管新生等.1.3　抗衰老作用真菌多糖主要是通过清除体内自由基、提高抗氧化酶活性而起到抗衰老作用的,其中超氧化物歧化酶(S OD)和谷胱甘肽过氧化物酶(2 PX)是机体内清除有害自由基的重要抗氧化酶,可保护细胞免受损伤,延缓细胞衰老.研究表明,灵芝多糖的抗衰老作用与抗自由基氧化的功能是密切相关的,它能阻止自由基损伤,终止脂质过氧化,保护细胞、延缓衰老[11];而黑木耳多糖能不同程度的增加衰老小鼠血浆中S OD、GSH2PX活性,降低MDA(丙二醛)含量,从而表现出较好的抗衰老作用[12].1.4　降血脂、降血压、降血糖作用真菌多糖能有效增强冠状动脉机能、扩大冠体流量,增强心肌供氧能力,降低血脂,预防动脉硬化,改善血液循环,在降低血压、血脂、血糖等方面有显著作用[13].Kubo等[14]曾进行了灰树花多糖治疗高血脂症大鼠的实验,发现剂量组大鼠血液中胆固醇、甘油三酯和磷脂含量比对照组下降0.3～0.8倍,接近正常对照组水平,肝重和皮脂层降低0.6～0.7倍,血脂与肝脂水平下降,胆固醇排泄增加1.8倍,说明灰树花多糖具有明显的降血脂和增加脂肪代谢的能力;另外,研究发现[15-16],灰树花多糖还可有效降低遗传性高血压小鼠的血压;Kiho等[17]实验观察到银耳多糖能增加葡萄糖激酶、己糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性,降低葡萄糖-6-磷酸酶活性,加速葡萄糖代谢从而降低血糖水平.1.5　其他药理作用及其发展趋势除上述药理作用外,真菌多糖的药理作用还表现在抗病毒作用(灰树花多糖[16]、裂褶菌多糖[18])、抗氧化作用(云芝多糖[19])、抗辐射作用(灵芝多糖[20])、抗血栓和抗凝血作用(灵芝多糖[8])等.同时,现有研究结果表明,单一真菌多糖有走向复合真菌多糖的发展趋势.将某些真菌多糖按照一定的比例混合制成复合真菌多糖,在等剂量的情况下可明显提高其在某些方面的药理作用,佐证了不同来源的同一药理作用的多糖有效成分间的相互配伍、相互协同的重要性.唐省三等[21]利用复合真菌多糖(猴头菇、香菇、茯苓真菌多糖)研究对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞活性的影响,发现复合多糖各组可明显升高S-180肉瘤小鼠腹腔巨噬细胞的活性.Lonseny T.等[22]通过研究也发现复合真菌多糖(香菇多糖∶灵芝多糖∶灰树花多糖=0.5∶0.5)S-42.2%和.,NK细胞和巨噬细.2　真菌多糖的提取与纯化2.1　真菌多糖提取纯化的一般工艺流程真菌多糖的来源一般主要有3种途径:从天然真菌子实体中提取;从人工培养的真菌子实体中提取;从发酵培养的菌丝体和发酵液中提取.其一般工艺流程如下图所示:图1　真菌多糖提取纯化的一般工艺流程2.2　真菌多糖的发酵真菌多糖的发酵生产一般有固态发酵和液态第2期李　磊等:真菌多糖药理作用及其提取、纯化研究进展89发酵两种,工业上常采用液态发酵(表面发酵和深层发酵),即采用液体培养基的发酵技术.与固态发酵相比,液态深层发酵有很多优点[23]:液体悬浮状态是很多微生物的最适生长环境;在液体中,菌体及营养物、产物(包括热量)易于扩散,使发酵可在均质或拟均质条件下进行;液体输送方便,可进行工业化连续生产,便于机械化操作和自动化控制;产品质量稳定,易于提取、精制等.在生产上,真菌多糖的液态发酵一般要经过斜面菌种培养、摇床培养、种子罐扩大培养、发酵罐培养等工艺流程;并且根据其工艺可将其培养基分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基,以便在菌丝体生长的不同阶段为其提供良好的营养.汪维云等[24]采用液体发酵法对灰树花菌丝体进行培养:试管菌种经过活化,接入300mL三角瓶(培养基装量100mL)在来复式摇床中培养,转速为180r/m in,培养温度为25℃;摇瓶培养48 h,待形成菌丝球并均匀分散在培养液中时转入种子罐(装料量50L)中培养,培养温度为25℃,通气量1.4∶1(V/V),培养36h,再转入发酵罐(装料量500L)中培养72h.曾晓希等[25]通过研究发现,灵芝多糖液体发酵的最佳碳源、氮源和生长因子分别是葡萄糖、酵母膏和维生素B1,最适温度、起始pH值和摇床转速分别为28℃、515和160r/m in.2.3　真菌多糖的提取真菌多糖存在于真菌的菌丝体和子实体中,菌丝体在进行液态发酵时,可形成胞外多糖或胞内多糖.对于胞外多糖直接对发酵液进行后处理即可;而对于胞内多糖,还要根据多糖的不同性质采用适当的方法对菌丝体进行浸提.大多数真菌多糖可溶于冷水,在热水中呈黏液,遇乙醇能沉淀,故传统的浸提方法多为热水提取法(适用于水溶性多糖),然后用乙醇等低级醇进行沉淀;另外还有稀酸提取法(适用于酸溶性多糖)与稀碱提取法(适用于碱溶性多糖).但是,热水浸提法较费时且效率低,而酸碱提取法又较易破坏多糖的空间结构及活性,故目前多采用酶法[26]及方兴未艾的超声波提取法[27-28]等.刘宁等[26]采用混合酶解法提取香菇多糖,并与传统水浴提取法进行分析比较,结果发现前者的最高提取率为12.90%,比后者高出6.26%,而在时间上仅用了后者的1/3,其产品在进行紫外吸收检测时,发现产品杂质含量少,比后者更接近标准品;Tabata等[27]在应用超声波提取法提取姬松茸多糖时,也发现其浸提率要明显高于传统的热水浸提法.另外,胡斌杰等[28]通过实验确定了传统热水提取法提取灵芝多糖的最佳工艺条件为:料液比为1∶20,提取温度为90℃,提取时间2 h,粒度为80目;而超声波法的最佳工艺条件为:料液比为1∶15,提取温度为60℃,超声时间25 m in,粒度为60目,且多糖提取率较传统热水提取法提高30%以上.由此可见,新方法与传统方法相比具有省时、条件温和、操作简便、提取率高、杂质含量少等优点.2.4　真菌多糖的纯化由上述方法得到的真菌多糖均为多糖粗提物,要得到纯化多糖甚至单一多糖还要经过一系列的纯化步骤.2.4.1　真菌多糖粗提物的除杂多糖粗提物中常含有杂蛋白、色素、低聚糖及一些小分子化合物等杂质,真菌多糖纯化的过程中应首先将其除去.2.4.1.1　去蛋白质经典的去蛋白质方法是Sevag法[29]:即用氯仿、正丁醇或正戊醇按5∶1混合后,加到样品水溶液中振摇,离心法除去形成凝胶状的蛋白质,反复多次至蛋白质除尽为止.该方法在实验室中最为常用,但是,其不足之处在于它的工艺流程较长、多糖损失多且有机溶剂消耗量大.朱美静等[30]实验发现三氯乙酸(TCA)法对猴头多糖脱蛋白的效果较好,且多糖损失较少;而谢红旗等[31]采用阴离子交换树脂对香菇多糖中蛋白质进行分离也取得了较好的效果.2.4.1.2　去色素有些真菌子实体或菌丝体中含有大量色素,这就给真菌多糖提取液的纯化带来很大困难,不仅对分光光度计的准确度有很大影响,而且还严重影响成品的品质.色素的去除常采用吸附法(纤维素、硅藻土、高岭土、活性炭等)、氧化法(H2O2)、离子交换法(DEAE2纤维素离子交换柱或Duolite A27)、金属络合物法(费林试剂)等.2.4.1.3　其他杂质的去除去除蛋白质和色素后的多糖液还含有较多其他杂质,可通过柱层析等方法进一步除去;而对于低聚糖、氨基酸等小分子化合物,可采用半透膜逆向流水透析法将其除去.2.4.2　真菌多糖的分离精制经除杂后得到的多糖液一般是由不同相对分子质量大小或不同成分的多糖混合物所组成,欲90　河南工业大学学报(自然科学版)第29卷得到单一多糖就要对多糖液进行分级分离.常用于分级分离的方法主要有乙醇分级沉淀法、季铵盐沉淀法、纤维素阴离子交换柱层析、凝胶柱层析、膜分离法等[32].李小定等[33]取纯化后的灰树花多糖(PGF) 20mg上DEAE2Sephadex A225柱,分别用水、2 mol/L尿素和2mol/L尿素+0.2mol/LNaCl阶段洗脱,分步收集洗脱液,用硫酸苯酚法检测多糖,合并多糖高峰部分,浓缩后透析,冻干,得4个多糖级分.王蕾等[34]将水提醇沉后得到的蛹虫草多糖(CPS)经Sephadex G2100柱色谱层析,分步收集后,采用苯酚-硫酸法进行检测,结果分离得到CPS1、CPS2、CPS3三种多糖.2.4.3　真菌多糖的纯度鉴定多糖的纯度鉴定一般可采用纸层析法、比旋度法、凝胶柱层析法、高压电泳法、超离心分析法、高效液相色谱法和光谱扫描法等[35].“多糖纯度”不能用通常化合物的纯度标准来衡量,的纯度标准是建立多项指标,每一项指标测定一种不同的特性[36].一般要有3种以上方法测定的结果,才能对某一多糖的均一性做出结论.李小定等人[33]分别采用了纸层析、Sephadex G2200凝胶柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法对经纯化得到的4种灰树花多糖级分进行纯度鉴定,结果显示4种多糖级分经纸层析鉴定均为单一斑点,经Sephadex G2200凝胶柱层析法鉴定均为单一对称峰,经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示为单一谱带,表明4种级分为均一多糖.缪建等[37]则分别采用旋光度法、Sephar ose4B柱层析、红外光谱等方法对香菇多糖的两组分Len12A、Len22A进行了纯度鉴定,最终确定其为均一多糖组分.3　真菌多糖的应用与展望作为一种重要的生物效应调节剂,真菌多糖具有非常重要而广泛的药理作用,尤其在抗肿瘤、免疫调节、延缓衰老等方面,人们已越来越重视其在医疗保健行业的开发.目前,真菌多糖已被开发成许多产品,如香菇多糖注射液、羧甲基茯苓多糖注射液、猪苓多糖片、猴头冲剂、云芝泰康冲剂等,显示了广阔的发展前景;在临床上,真菌多糖现已被广泛应用于免疫缺陷性疾病、自身免疫疾病和肿瘤等疾病的治疗;并且随着生物药剂学及微胶囊、纳米粒等制药新技术的发展,真菌多糖新剂型药物的研究与开发已引起人们的广泛关注.另外,研究表明真菌多糖还可被开发成一种全新的绿色饲料添加剂[38]:在动物养殖中,抗菌、抗病毒一直是困扰养殖行业的一大问题,由于真菌多糖具有高效、无毒、提高免疫力、抗菌抗病毒、无残留等特点,符合绿色饲料及绿色养殖的要求,因此开展真菌多糖应用于饲料添加剂的产品研究是非常有意义和具有市场潜力的.总之,随着分子生物学、医学、多糖制药工艺学、现代分析技术的发展以及对真菌多糖构效关系的进一步研究,可以预料真菌多糖今后将在许多行业以及人们的日常生活中起着越来越重要的作用.参考文献:[1]　朱建华,杨晓泉.真菌多糖研究进展———结构、特征及制备方法[J].中国食品添加剂,6):7580.]Mao P H,J in X,et al.Study onfr om edible and medicai fun2 gus[J].Che m&B i oengineering,2004(1):1416.[3]　Q in J Z,Chen M,Chen H,et al.Pr os pectand current studies on edible and phar maceu2tical fungi polysaccharides[J].Edible Fungiof China,2004,23(2):610.[4]　欧阳天贽,李小定,荣建华.真菌多糖抗肿瘤及免疫调节作用研究进展[J].天然产物研究与开发,2006,18:524528.[5]　Nanba H.Maitake mushr oom2i m mune thera2py t o p revent fr om cancer gr owth 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