教你辨析标记基因和报告基因
分子育种题库
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分子育种题库一、名词解释：分子育种：根据育种目标，通过在DNA分子水平上的操作，对植物基因组进行改良（如：引入外源基因和改良内源基因),创造符合人类需求的新性状(如：抗虫、抗病、抗除草剂等)，具有新性状的植物,或通过适当的选择和繁殖直接形成一个新品种,或用它作为种质通过杂交育种途径育成一个新品种.植物育种:根据育种目标，用育种技术，诱导、创造和重组遗传变异，选育出符合育种目标（高产、优质、抗逆）的在遗传上稳定一致的优良新品种(基因型），并繁殖出足够量的种子或种苗供生产应用。
分子标记辅助育种：利用分子生物学技术，对一个目标性状（如抗病、抗虫）进行分子标记（如RFLP、SSR、RAPD)，当分子标记与性状有连锁时,根据分子标记表型从DNA水平上直接选择目标性状。
这种高效和精确地选取目标性状的技术称为分子标记辅助育种。
转基因育种：根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经 DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体,并经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源.基因组：单倍体生物中所含的遗传物质（DNA 或RNA）总和。
基因组学:启动子:DNA分子上被RNA聚合酶、转录调节因子等,识别并结合,形成转录起始复合物的区域。
终止子：内含子：DNA与成熟RNA 间的非对应区域。
外显子:DNA与成熟RNA 间的对应区域。
DNA的变性和复性：转化体：转化受体:是指将接受外源目的基因的植物细胞、组织、器官乃至植株。
转基因植物安全评价指南
附件1转基因植物安全评价指南（试行）农业部农业转基因生物安全管理办公室2007年9月目录前言................................................................................. 错误！未定义书签。
一、总体要求................................................................ 错误！未定义书签。
（一）分子特征...................................................... 错误！未定义书签。
1. 表达载体相关资料 ....................................... 错误！未定义书签。
2. 目的基因在植物基因组中的整合情况........... 错误！未定义书签。
3. 外源插入片段的表达情况............................. 错误！未定义书签。
（二）遗传稳定性 .................................................. 错误！未定义书签。
1. 目的基因整合的稳定性 ................................ 错误！未定义书签。
2. 目的基因表达的稳定性 ................................ 错误！未定义书签。
3. 目标性状表现的稳定性 ................................ 错误！未定义书签。
（三）环境安全...................................................... 错误！未定义书签。
1. 生存竞争能力 .............................................. 错误！未定义书签。
植物基因工程
1．植物基因转移的病毒载体
植物病毒跟其它病毒一样，离开植物细胞后表现出休眠状 态。一旦感染植物并进入植物细胞，立即就依靠寄主进行基因 的复制和表达，合成出成熟的病毒。植物病毒感染效率高，将 其作为载体既可以获得较高的基因转化效率，又可以使感染的 外源基因随着病毒基因组的复制而扩增，因此植物病毒可以被 发展成为很有价值的克隆载体。
TL GGCACGATATATTCAATTGTAAAT
TR GGCACGATATATCGAGGTGTAAAA T-DNA上编码基因主要有两类：第一类为编码冠瘿碱合成酶 及分解代谢基因，另一类为诱发肿瘤的基因。 冠瘿碱合成酶的基因具有真核生物的转录信号， T-DNA整 合到植物基因组后，他们能够在植物体内表达。合成冠瘿碱， 植物不能利用，农杆菌却能利用。
（4）工程化Ti质粒转入根癌农杆菌
a.直接转化 从大肠杆菌中分离重组的质粒，以质粒DNA直接 转化根癌农杆菌。 对数生长期的根癌农杆菌离心收集后以CaCl2
悬浮，置液氮中冷冻5min，加入1μg的质粒DNA，再冻5min，迅速
37摄氏度熔化，促进DNA进入细胞。
b.三亲交配法 利用细菌质粒的转移特性进行三亲交配的转移
目前正在研究并发展作为植物基因克隆载体的病毒有三种不同 的类型，即单链RNA植物病毒、单链DNA植物病毒和双链DNA植 物病毒。
目前已经建立的CaMV DNA克隆载体主要有三类：
（1）由有缺陷的CaMV DNA病毒分子与另一个辅助性的病毒分子 组成一个互补的载体系统。辅助性的病毒分子给缺陷性的CaMV DNA病毒分子提供所缺乏的功能。这两种分子单独都不表现出活 性。
可使矮牵牛、烟草、油菜等多种植物对氨甲喋呤产生抗性。氨 甲喋呤对植物具有很强的毒性。
西南大学基因工程名词解释
α-互补：人工突变使大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因（lacZ）缺失N-端的第11-41位氨基酸，而载体则携带有lacZ基因的N-端140个氨基酸和编码区段（lacZ’），二者单独存在时均无功能，但共存于一个大肠杆菌细胞时则发生功能互补，形成具有完整活性的lacZ酶。
报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。
标记基因：是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用。
选择标记基因用于鉴别目的DNA的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来；筛选标记基因：将携带了外源DNA片段的重组子挑选出来。
cDNA文库：将生物某一组织细胞中的总的mRNA分离出来作为模板，在体外用反转录酶合成互补的双链cDNA，然后连接到合适的载体上，并转入宿主细胞。
这种方法所形成的所有克隆的集合体叫cDNA文库。
侧翼序列：一条核酸单链上位于某一特定位置的5’或3’方向的序列。
Ct值：荧光信号达到阈值所对应的PCR循环数，它具有极好的重复性。
插入失活：当一段足够长的外源DNA片段插入到一个功能基因的编码区后，导致ORF移码或提前终止，严重破坏原基因的编码能力而使该基因失活。
插入型λ载体：通过特定的酶切位点允许外源DNA片段插入的载体。
穿梭载体：能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。
主要是质粒载体，至少有2套复制单元和2套选择标记，相当于两个载体的联合。
DNA聚合酶：是指以脱氧核苷三磷酸作为底物催化合成DNA的一类酶，它的主要活性是在具备模板、引物、dNTPs等情况下催化DNA的合成及其相辅的活性。
DNA连接酶：DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5′-磷酸根和3′-羟基生成磷酸二酯键。
这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA 连接酶以NAD作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。
多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。
筛选标记和目的基因PPT课件
基因作为筛选标记基因遗传转化得到的转基因植株能够种植在重金
属污染的土壤中。
第7页adA) 双子叶植物叶绿体转化多采 用 aadA 基因， 用壮观霉素(spectinomycin)进行筛选， 获得同质 叶绿体转化细胞的筛选周期不同受体材料差异很大， 分化植株的前 期筛选一般 2 ～8 个月， 甜菜叶绿体转化筛选8 个月后才分化植株 。 棉花叶绿体转基因从枪击受体胚性愈伤到获得同质叶绿体转基因植 株则长达 18 个月 。单子叶禾本科植物对壮观霉素具有天然抗性， 因此， 水稻叶绿体转化时 aadA 基因的筛选采用链霉素， 链霉素的 作用机理主要抑制非转化细胞分化绿苗和根的形成， 愈伤组织阶段 筛选效果很不明显， 后期分化绿苗以及生根阶段效果才体现出来， 其作为禾本科作物的筛选标记， 效果并不理想。
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1.4 荧光蛋白基因 荧光蛋白家族是从水螅虫纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质
量为 20~30 kD 的同源性蛋白，包括绿色、 红色、 黄色和青色荧 光蛋白等。 绿色荧光蛋白 （GFP ） 是其中应用的最多的一种，最 初是从维多利亚发光水母 （Aequorea victoria ） 中分离得到. 下 村修在研究水母的发光机制时发现腔肠素 （coalenterazine ） 和 钙离子与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白发蓝色荧光，同时激 发 GFP，使其发绿色荧光GFP 是一条由 238 个氨基酸所组成的单 体蛋白，相对分子质量为 27kD，用 395 nm 的紫外光和 475 nm 的蓝光激发， 可在 508 nm 处自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底物.
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2.3 报告基因在微生物学研究中的应用 生物环境工程研究的重要工具. 微生物环境工程研究中使用的报告 基因有对有毒化学物质苯喃 （Benzofurans ） 响应的 SOS 细胞分 离抑制基因 ，钴离子诱导的半乳糖苷酶基因和钙离子调节的荧光素 酶基因等。操纵子参与嗜酸氧化亚铁硫杆菌的硫氧化代谢过程，并 通过特异性调控蛋白对底物 Na 2 S 2 O 3 的诱导作用产生响应 . 作为一种简便有效的方法，报告基因在微生物检测和调控研究中正 发挥着越来越重要的作用.
基因工程导论考点整理
专业重点整理09级亲测可用课程: 基因工程导论团队: 南农爱整理团队学院: 农学院专业: 农学班级: 农学9*指导教师: 曹爱忠职称: 教授2012 年7 月7 日南京农业大学教务处制基因工程导论生物技术可以分为传统生物技术、工业生物发酵技术和现代生物技术。
现代生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等五大工程技术。
1、基因工程含义概念：是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，利用分子生物学的手段，在体外操纵、改造、重建细胞的基因组，从而使生物体的遗传性状发生定向变异，获得人们所需的性状，并能稳定地遗传给后代。
特点：基因工程能够打破种属的界限，在基因水平上改变生物遗传性。
2、DNA重组利用供体生物的遗传物质，或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物。
3、基因工程的理论依据1）同基因具有相同的物质基础2）基因是可以切割的3）基因是可以转移的4）多肽与基因之间存在对应关系5）遗传密码是通用的6）基因通过复制可以把信息传递给下一代4、基因工程的实施步骤：1）取得符合人们要求的DNA片段2）目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA3）把重组DNA引入某种细胞4）把目的基因能表达的受体细胞挑选出来5）形成新的目标产品基因的概念基因：DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷段序列，是遗传物质的最小功能单位。
外显子：能够编码蛋白质的序列叫做外显子。
内显子：不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA 。
原核生物的基因组结构特点特点：1）染色体数量少；2）DNA大多为双螺旋结构，少数以单链形式存在；3）结构简单，基因组小，DNA一般只有单一复制起点，基因的编码通常是连续的，中间无非编码成分；4）转录单元，基因组中功能相关的基因常集中在基因组的一个或几个特定部位，形成一个功能单位或转录单元，其活性受到同步调控，它们可被转录为多个mRNA分子，叫多顺反子；5）存在重叠基因。
基因工程名词解释
变性：在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基之间的氢键断裂，使DNA分子双螺旋结构松散，变成单链。
复性：高温变性的DNA逐渐冷却后，分开的两条单链重新结合成双链DNA退火：热变性的DNA经缓慢的冷却后，复性的过程PCR聚合酶链反应，是模仿体内细胞DNA复制的过程的体外DNA快速扩增方法。
以DNA互补链聚合反应为基础，通过DNA变性，引物与模板一侧的互补序列复性杂交，耐热DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，获得待扩增的特异性DNA片段。
模板：一条单链DNA片段，其3'上具有与引物杂交的序列引物：与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段，其3'端必须具有游离的-0H基团。
限制核酸内切酶：能专一性的识别双链DNA上的特殊核苷酸序列，并使每一条链的一个磷酸二酯键断开。
DNA连接酶：催化DNA链的相邻3'羟基和5'-磷酸基团发生缩合反应，形成磷酸二酯键，分为ATP依赖型和NAD依赖型。
Klenow片段：是大肠杆菌DNA聚合酶I的羧基端片段,长度为全酶的70 %。
具有5' 3'聚合酶活性及3 ' t 5 '外切酶活性。
限制性图谱：DNA分子上的限制性内切核酸酶的识别序列的分布图同裂酶：即从不同的原核生物中分离出来，具有相同识别序列的限制性核酸内切酶。
切割的位点可以相同，也可以不相同。
同尾酶：来源不同，识别序列也不同，但切割DNA分子所得到的DNA片段具有相同的黏性末端，这样一组限制性核酸内切酶称为同尾酶。
黏性末端：大多数断裂的结果形成的DNA片段,具有互补碱基的单链延伸末端.这种末端叫黏性末端。
酶活性单位：某种限制性核酸内切酶在最适反应条件下,60min内完全切割lug入DNA所需要的酶活性定为1酶活性单位（unit 或U）容积活性：1ul 酶液中具有的酶活性单位，即U/ul缺口：在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂。
报告基因名词解释
报告基因名词解释常见的报告基因常见的报告基因报告基因必须具备的特点：①由原核基因编码的基因产物必须与同转染前真核细胞内任何相似的产物相区别；②细胞内其他基因产物不会于扰报告基因产物的检测；③报告基因编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高，而且重现性好。
到目前为止，报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被检测基因序列相连，先让质粒在大肠杆菌中进行增殖，再提取质粒，转染人感兴趣的真核细胞中。
与此同时还要将有真核启动子和增强子的另一种报告基因质粒共转染同一细胞，作为转染率的内对照。
(1)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)：该报告基因来源于大肠杆菌转位子9，是第1个用于检测细胞内转录活性的报告基因。
氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素解毒。
CAT在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定，半衰期较短，适于瞬时表达研究。
可用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定(enzyme—linkedimmunosorbantassay，ELISA)检测其活性，也可进行蛋白质印迹(Westernblotting)和免疫组织化学分析。
CAT与其他报告基因相比，线性范围较窄，灵敏性较低。
(2)β半乳糖苷酶：β半乳糖苷酶由大肠杆菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解。
最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一。
以邻—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物可用标准的比色法检测酶活性，其检测动力学范围为6个数量级。
氯酚红—β—D—半乳吡喃糖苷(CPRG)是另一个可用比色法检测酶活性的底物，其灵敏度比ONPG高近10倍。
以MUG和荧光素二半乳糖苷(FDG)为底物则可用荧光法检测其活性。
此法可检测单个细胞的酶活性，并可用于流式细胞学(FACS)分析。
如以二氧杂环丁烷为底物，可用化学发光法检测酶活性，其检测动力学范围最大，灵敏度最高，与用生物发光法检测荧光素酶活性的灵敏度相似。
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教你辨析标记基因和报告基因
一、标记基因和报告基因的概念
标记基因(marker gene)，是一种已知功能或已知序列的基因，能够起着特异性标记的作用。
标记基因是选择标记基因的简称，是指其编码产物能够使转化的细胞、组织具有对抗生素等的抗性，或者使转化细胞、组织具有代谢的优越性。
在培养基中加入抗生素等选择试剂的条件下，非转化的细胞死亡或生长受到抑制，而转化的细胞能够继续存活，从而将转化的细胞、组织从大量的细胞或组织中筛选出来的一类基因。
在基因工程意义上来说，它是重组DNA载体的重要标记，通常用来检验转化成功与否；在基因定位意义上来说，它是对目的基因进行标志的工具，通常用来检测目的基因在细胞中的定位。
报告基因(reporter gene)，是指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入受体细胞、组织或器官，并检测其表达活性的一类特殊用途的基因，主要用于判断目的基因是否成功导入到受体细胞，并在其中表达。
故当报告基因被用来区分转化和非转化细胞、组织、器官时，也可将其称为标记基因。
报告基因不仅能作为标记基因，此外，报告基因还能用于研究基因的表达调控，检测启动子的活性，发现新的启动子，观察报告基因和目的基因的融合蛋白在细胞内的位置等。
二、标记基因和报告基因的区别与联系
二者的联系在于：报告基因都可以看做是标记基因。
报告基因也有标记的作用，标记目的基因是否成功转化的作用，但是它们又有着各自的特点。
标记基因通常用来检验重组DNA载体转化成功与否，或者检测目的基因在植物细胞或组织中的定位。
常用的标记基因是一些抗生素抗性基因，如卡那霉素抗性基因、潮霉素标记基因等。
而作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：1）已被克隆和全序列已测定；2）表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；3）表达产物唯一，对受体细胞无毒，并且能进行定量测定。
目前常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、荧光素酶基因(luc)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、分泌型碱性磷酸酶基因(seap)、绿色荧光蛋白基因(gfp)等。