8.核酸扩增技术
核酸扩增技术的金标准
核酸扩增技术的金标准核酸扩增技术（Nucleic Acid Amplification Technology，简称NAAT）是一种分子生物学技术，可在体外复制DNA或RNA分子，使其在数量上增加。
这项技术被广泛应用于生物学研究、疾病诊断和基因治疗等领域，可帮助实现精准医学和个性化治疗。
在NAAT中，最常用的方法是聚合酶链式反应（PCR，Polymerase Chain Reaction），其核心是通过特定引物对目标DNA区域进行扩增，反复进行加热、退火和延伸过程，最终得到大量的目标DNA片段。
PCR的主要优点是高灵敏度、高特异性和快速反应时间。
此外，PCR还可以进行定量PCR（qPCR），通过监测荧光信号来精确测定反应体系中的DNA数量。
PCR虽然是NAAT的一种重要工具，但它也存在一些局限性，例如在复杂的生物样本中（如血液或组织样本）进行检测时可能会产生假阳性结果。
因此，科学家们开发了更复杂的NAAT方法，如逆转录PCR （RT-PCR）、荧光PCR（Fluorescent PCR）和病毒样本放大（Viral Sample Amplification）等技术。
近年来，NAAT技术的发展颇受关注，一个出色的例子是基于CRISPR-Cas的检测技术。
这种技术利用Cas9等“基因剪刀”将引物结合到目标DNA上，然后通过酶作用产生荧光信号，从而完成检测过程。
此外，基于PCR扩增和荧光检测的LAMP技术被广泛应用于疟疾、寄生虫感染和HIV等病毒感染的诊断。
总体来说，NAAT作为分子生物学的一个关键技术，在许多领域中都已证明其不断扩展的作用。
它不仅可以用于食品和环境监测，还可以用于病毒和疾病的诊断和治疗。
随着NAAT技术不断发展，我们可以期待更多创新应用的出现，这将不断推动医学、生物学和其他学科的发展。
核酸扩增技术
ATGC最好随机分布，避免连续4个以上相同核苷酸
2021/8/21
Logistics University of Chinese People’s Armed Police
31
Force
引物设计的原则
④避免引物内部出现二级结构 避免引物内部互补， 特别是2个引物间3’端的互补
⑤引物的特异性
与其它基因无明显同源性，3’端的碱基要求严格配对。
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PCR的基本原理
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
DNA模板 DNA引物
dNTP TaqDNA聚合酶
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PCR的基本原 理
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
Polymerase Chain Reaction
1993年
Karry Mullis
1985年发明PCR, 1993 年获诺贝尔化学奖
2021/8/21
2
PCR技术
（聚合酶链式反应, Polymerase Chain Reaction）
应用：DNA体外快速扩增技术，可将微量的目 的DNA在体外扩增100万倍以上。
⑥引物5 ’端可加上合适的酶切位点或修饰成分
扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分
子克隆很有好处
2021/8/21
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核酸扩增方法
核酸扩增方法
核酸扩增方法是一种将DNA或RNA复制成大量拷贝的技术，这些拷贝
可以用于科学研究、临床实验和工业生产等领域。
以下列举一些常见的核
酸扩增方法：
1.PCR（聚合酶链式反应）：PCR是最常见的核酸扩增技术，它利用DNA聚合酶在模板DNA上进行多轮反应，每一轮都会产生两倍的DNA拷贝。
PCR广泛应用于DNA测序、基因诊断、病毒检测、DNA重组等领域。
MP（环介导等温扩增）：LAMP是一种无需恒温器的核酸扩增技术，它利用DNA聚合酶在恒温条件下进行反应，在短时间内产生大量DNA
拷贝。
LAMP广泛应用于病原体检测、食品安全检测等领域。
3.NASBA（核酸序列基于扩增）：NASBA是一种RNA扩增技术，它利
用RNA聚合酶在恒温条件下进行反应，产生大量RNA拷贝。
NASBA广泛应
用于病毒检测、RNA表达分析等领域。
4.RCA（循环扩增反应）：RCA是一种DNA扩增技术，它利用DNA聚
合酶和DNA环化酶在恒温条件下进行反应，产生大量DNA环状结构。
RCA
广泛应用于DNA纳米技术、DNA分子计算等领域。
核酸扩增法检测方案
核酸扩增法检测方案引言核酸扩增法是一种常用的生物学技术，用于检测和分析特定DNA或RNA序列的存在和数量。
它是基于聚合酶链式反应（PCR）的原理，通过在特定的实验条件下，复制和扩增目标序列。
本文将介绍核酸扩增法的基本原理、实验方法和应用。
基本原理核酸扩增法基于聚合酶链式反应的原理，该反应是通过DNA聚合酶酶的作用，将DNA单链模板复制成双链DNA的过程。
聚合酶链式反应需要引物（primer），引物是由约20个核苷酸组成的寡核苷酸序列，能够与目标序列的两个端部的互补序列结合。
在PCR反应中，引物起到定向复制的作用，将目标序列的两端延伸复制。
通过反复进行PCR循环，可以从少量的起始DNA模板扩增出大量DNA产物。
实验方法核酸扩增法的实验方法通常包括以下步骤：1.样品处理：将待检测的样品进行前处理，如细胞裂解、DNA/RNA提取等，以获取目标DNA/RNA。
2.引物设计：根据待检测的目标序列设计引物。
引物应能够与目标序列的两端互补，且长度约20个核苷酸。
3.PCR反应体系准备：根据实验需求准备PCR反应的体系，包括DNA模板、引物、聚合酶、核苷酸和缓冲液等。
4.PCR程序设置：根据目标序列的特性以及实验需求，设置PCR反应的循环条件、温度和时间等参数。
5.PCR循环扩增：将PCR反应体系放入热循环仪中进行PCR扩增。
每个循环包括三个阶段：变性、退火和延伸。
6.PCR产物分析：通过凝胶电泳等方法对PCR产物进行分析，以确定目标序列是否扩增成功。
应用核酸扩增法在许多领域都有广泛的应用，包括：1.疾病诊断：核酸扩增法可以通过检测特定病原体DNA/RNA来进行疾病的早期诊断，例如新型冠状病毒的核酸检测。
2.遗传学研究：核酸扩增法可以用于检测基因突变、基因多态性等遗传学研究。
3.法医学：核酸扩增法可以用于法医学领域，对犯罪现场的DNA进行鉴定和分析。
4.生物工程：核酸扩增法在生物工程领域的应用较多，可以用于构建重组DNA、合成基因等。
核酸等温扩增技术
核酸等温扩增技术
核酸等温扩增技术是一种核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速核酸扩增的目的。
该技术具有与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足快速简便的需求等优点。
核酸等温扩增技术是一类技术的统称，包括但不限于LAMP、NASBA、RCA、SAT、IMSA、RPA、SPIA等多种具体方法。
请注意，核酸等温扩增技术虽然具有诸多优点，但也有其局限性，例如可能存在交叉污染的风险，影响检测的准确性。
因此，在使用该技术时，需要采取有效的措施来避免这些问题。
核酸等温扩增技术及其应用
核酸等温扩增技术及其应用一、引言核酸等温扩增技术是一种新兴的分子生物学技术，其在生物医学研究、临床诊断和基因工程等领域具有重要应用价值。
本文将详细介绍核酸等温扩增技术的原理、方法和应用。
二、核酸等温扩增技术的原理核酸等温扩增技术是一种在恒温条件下进行的核酸扩增方法，通过利用逆转录酶和DNA聚合酶的活性，实现核酸的扩增。
其基本原理是通过逆转录酶将RNA模板转录成互补的DNA链，然后利用DNA聚合酶在恒温条件下合成新的DNA链。
这种等温扩增方法不需要复杂的温度变化，且具有较高的特异性和敏感性。
三、核酸等温扩增技术的方法核酸等温扩增技术主要包括RT-LAMP（逆转录环介导等温扩增法）和RPA（等温扩增法）。
RT-LAMP方法利用4-6个特异性的引物，在同一温度下通过逆转录酶和DNA聚合酶的协同作用，在短时间内扩增目标核酸。
RPA方法则利用DNA聚合酶和DNA单链结合蛋白在等温条件下，通过引物结合、DNA解旋、DNA聚合等步骤，实现核酸的扩增。
四、核酸等温扩增技术的应用1. 医学诊断：核酸等温扩增技术在医学诊断中有广泛应用。
例如，可以通过核酸等温扩增技术检测病毒、细菌和真菌等病原体，快速确认感染病原体的种类和数量，为临床治疗提供依据。
此外，核酸等温扩增技术还可以用于检测肿瘤标志物、遗传病突变等，为早期癌症和遗传病的筛查提供技术支持。
2. 食品安全检测：核酸等温扩增技术可以应用于食品安全检测领域。
例如，可以利用核酸等温扩增技术检测食品中的病原菌、转基因成分和食品中的传染性病毒等。
这种技术具有快速、灵敏和高效的特点，可以为食品安全监管提供重要依据。
3. 环境监测：核酸等温扩增技术在环境监测中也有广泛应用。
例如，可以利用核酸等温扩增技术检测水体、土壤和空气中的微生物，了解环境中的微生物多样性和污染程度。
此外，核酸等温扩增技术还可以用于环境污染源的追踪和监测。
4. 生物工程：核酸等温扩增技术在生物工程领域也有重要应用。
核酸的体外扩增概述
核酸的体外扩增概述核酸体外扩增，也称为聚合酶链式反应（PCR），是一种重要的分子生物学技术，用于扩增和复制特定DNA或RNA序列。
PCR技术的广泛应用和成功应用于许多领域，例如基因检测、疾病诊断、法医学、基因工程等。
本文将对PCR技术进行概述。
PCR技术的原理是依靠DNA的双链结构，通过循环变性、引物结合和DNA合成三个步骤，实现对特定DNA序列的放大。
这三个步骤分别是变性步骤、退火步骤和延伸步骤。
变性步骤：PCR反应开始时，DNA双链被加热至95°C以上，使两个DNA链分离，并形成两个单链DNA（ssDNA）。
高温对DNA的作用是破坏氢键，导致核苷酸碱基对之间的结合断裂。
退火步骤：PCR反应降温至50°C-60°C，引物（primer）结合到目标DNA的末端，引物是DNA聚合酶所需要的模板以及DNA链延伸的起始点。
延伸步骤：PCR反应在60°C-75°C下进行，加入了一种DNA聚合酶，如热稳定的Taq聚合酶。
该酶识别引物，并根据引物上的信息开始合成新的DNA链。
在延伸步骤中，引物结合到目标DNA的3'末端，DNA聚合酶沿着模板链合成新的DNA链，通过碱基配对法则，以模板链作为基础合成新的互补链。
这个过程重复多次，每次延伸都以新合成的DNA链的3'末端为起始点，最终在特定的PCR循环中产生大量的复制DNA。
PCR技术可分为传统PCR和实时定量PCR两种方法。
传统PCR是利用热循环PCR仪进行多个PCR循环，每个循环包括变性、退火和延伸步骤。
由于PCR是在反应管中进行的，所以扩增产物只能通过凝胶电泳进行检测，不能实时监测。
实时定量PCR是在PCR反应中添加一种荧光信标，通过检测荧光信号的强度来实时监测扩增过程。
实时定量PCR具有高效、快速、准确的优点，能够定量测量样本中起始模板的数量。
同时，实时定量PCR还具有多样性，可用于各种样品，包括基因型分析、基因表达分析、病原体检测等。
分子诊断学之核酸扩增技术-荧光定量PCR技术
荧光实时定量PCR技术是1992年Higuchi第 一次报告提出的，当时的标记染料就是EB，检 测掺入到双链核酸中EB的含量就能实时监控 PCR反应的进程。
PCR反应的数学函数关系，结合相应的算 法，通过加入标准品的方法，就可以对待测样 品中的目标基因进行准确定量。
4
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国 Applied Biosystems公司推出，该技术实现 了PCR从定性到定量的飞跃，克服了常规PCR 技术的诸多问题，为PCR技术进入临床应用打 开了成功之门。 与常规PCR相比，它具有特异 性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度 高等特点，目前已被广泛应用。
不能做多重检测：每孔只能检测一个目标基因 灵敏度低：适合于5000 拷贝以上的基因定量
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2. 荧光标记探针法
5' 3'
R
Q
5'
3'
3'
5'
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什么是CT值
荧光信号有统计学意义显著增长（即穿过阈值 线）时的循环次数
从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数
线性图谱
半对数图谱
CT值
CT值
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什么是阈值（threshold）
• PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本
底信号
• 荧光阈值是3-15个循 环的荧光信号的标准 偏差的10倍，即： threshold = 10 ´ SDcycle 3-15
N: 扩增子数量 N0: 起始模板数量 E： 扩增效率 n: 循环数
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PCR方程只在指数期成立
线性增长期
平台期
Log [DNA]
指数增长期 y = x(1+e)n
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基 本
N= N0(1+E)c
原
理
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PCR反应体系、条件及其优化
n PCR反应体系
引物过短会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必 要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在 人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ). 而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有 1/400个.
较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序 列或者使用于产生一些突变位点
模板（template） 引物（primers） DNA 聚合酶 (DNA polymerase)
dNTP PCR缓冲液（PCR buffer）
n PCR反应条件
变性 退火 延伸 循环
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模板（template ）
DNA
基因组DNA
RNA：总R质粒NDAN、A mRNA、tRNA、 rRNA、 病毒RNA
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引物（primers)
n 引物是人工合成的两段 寡核苷酸序列，一个引 物与感兴趣区域一端的 一条DNA模板链互补， 另一个引物与感兴趣区 域另一端的另一条DNA 模板链互补。
对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数， 从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有 的引物设计软件最常用的计算方式。
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
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GC含量太高也易于引发非特异扩增。
同一碱基连续出现不应超过5个
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引物Tm值
一般要求：55℃-65℃。 计算：
对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据 Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算
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碱基分布的均衡性
GC含量一般40-60%，推荐45-55%或50-60%。 上下游引物的GC含量不能相差太大。
GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火 温度不利于提高PCR的特异性
→ Sense primer
3’ 5’
5’
← 3’
Antisense primer
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引物的重要性
在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地 位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异 结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的 灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效 的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密 切相关。
引物设计一般原则
引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端 引物的内部稳定性 引物的保守性与特异性 扩增区域的二级结构
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引物长度
一般为15-30个核苷酸，常用的是18-24 bp。在做长片段 PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超 过50个核苷酸。
一、 PCR技术发展简史 二、 PCR技术原理 三、 PCR反应体系、条件及其优化 四、扩增产物检测及分析 五、 PCR常见问题与原因分析 六、PCR衍生技术
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PCR技术发展简史
Korana于1971年最早提出核酸 体外扩增的设想。
1985年Mullis等发明了具有划 时代意义的聚合酶链反应，使 用的DNA聚合酶是Klenow片段。
(1993年诺贝尔化学奖获得者)
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PCR技术发展简史
1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR。 1988年Saiki 发现Taq DNA聚合酶，从此PCR技术得
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引物设计总原则
引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹
结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反
应(即错配)。
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主要内容
第一节 聚合酶链反应技术 第二节 荧光定量PCR技术 第三节 其他核酸扩增技术 第四节 临床基因扩增实验室的管理与质量控制
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第一节 聚合酶链反应技术 polymerase chain reaction, PCR
引物二级结构
引物二聚体
尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基 互补
发夹结构
尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严 重影响DNA聚合酶的延伸。
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引物3’端
引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需 严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸， 甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3’ 端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。引物3’端不 要出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，否则会使错误 引发机率增加。