杂交瘤细胞的培养,保存和复苏
单克隆抗体制备方法(全)
单克隆抗体制备方法1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。
主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。
其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。
此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。
方法动物的选择与免疫1. 动物的选择BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2. 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
杂交瘤技术流程
杂交瘤技术流程
杂交瘤技术是一种通过融合两种不同细胞类型创建一个具有双亲特性的细胞的方法。
下面是一般的杂交瘤技术流程：
1. 收集要进行杂交的两种细胞，称为亲本细胞。
2. 准备培养基，供细胞生长和融合使用。
3. 在培养皿中培养亲本细胞，并使其达到适当的密度。
4. 收集亲本细胞，将其洗涤以去除培养基中的杂质。
5. 将两种亲本细胞混合在一起，使其发生融合。
常用的融合方法包括利用化学物质（如聚乙二醇）或电融合。
6. 将融合的细胞分散到含有致瘤因子的选择性培养基中，以消灭没有融合的亲本细胞。
7. 将培养皿放置在恒温孵育箱中，让融合细胞进行增殖。
8. 通过观察和筛选，找到具有所需性状的杂交瘤细胞。
9. 将杂交瘤细胞进行分离、传代并保存，以便进一步研究和应用。
值得注意的是，杂交瘤技术可能需要根据具体的实验目的和要求进行一些修改和优化。
杂交瘤细胞培养方法
杂交瘤细胞培养方法
杂交瘤细胞培养方法：
1. 杂交瘤的制备：
将骨髓瘤细胞与抗原刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞。
2. 细胞培养：
将杂交瘤细胞接种于含有高浓度鸟嘌呤或潘孔霉素的无血清培养基中进行培养。
3. 无血清培养基的制备：
取无血清培养基中所需的基础培养液（例如：DMEM、RPMI 1640等），添加必要的生长因子、维生素、矿物质和氨基酸等，经过过滤和灭菌处理即可。
4. 细胞培养条件：
培养杂交瘤细胞时，需保持其在适宜的温度、CO2浓度和湿度下生长，通常在37℃、5% CO2气氛下进行培养。
5. 细胞检测：
在培养过程中，需定期检测细胞形态、增殖情况、表达抗原的能力等，以确保细胞的纯度和功能性。
注意事项：
为避免污染和交叉感染，需采取有效的无菌技术和严格的操作规范；同时，在培养过程中应注意细胞的生长情况和营养状况，及时调整培养条件以保证细胞的最佳生长状态。
杂交瘤细胞培养及其注意事项
杂交瘤细胞培养及其注意事项单克隆抗体的应用是一项迅速发展的技术。
本文阐述了单克隆抗体制备前杂交瘤细胞的培养条件和应用，包括细胞的培养、培养基的选择，融合时期的选择，从而指导和优化实验室中杂交瘤的培养，促进融合细胞的融合率和后继单克隆抗体筛选实验的顺利进行。
标签：杂交瘤；细胞培养；单克隆抗体随着杂交瘤细胞株不断的建立和生产单克隆抗体的日益广泛应用，杂交瘤细胞的培养和优化不断得到改善，但是国内实验室设备和条件有限，多数的单克隆抗体的筛选还是应用基础的免疫抗原包被，结合Elisa方法联合有限稀释法来筛选单克隆抗体。
为了获得特异性较强的杂交瘤细胞株，融合前后细胞的培养以及杂交瘤的培养和储存，仍是基础实验室中必须注意和重视的技术。
1杂交瘤的起源和生产1.1杂交瘤所用的骨髓瘤细胞系1966年Petingel等在体外培养小鼠浆细胞成功。
Milstein等1972年由P3中用20μg 8-氮杂鸟嘌呤（8-azaguanine）筛选出缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）的新细胞系，称之为P3-X63-Ag8。
由于X63本身分泌IgG1，形成的杂交瘤除分泌B细胞的特异性抗体外，同时分泌X63产生的抗体，因其抗体不纯，现多改用不分泌型骨髓瘤细胞系。
国内现已引进NS-1，SP2/0，FO，X63-Ag8-653等小鼠骨髓瘤细胞系。
最常使用的是SP2/0及NS-1[1]。
1.2人骨髓瘤细胞系为产生稳定的人免疫球蛋白的杂交瘤，需要人的缺某种酶的骨髓瘤细胞系。
国外已筛选了一些人骨髓瘤细胞，但融合率不高，还没有推广使用。
目前人一人杂交瘤技术仍存在着杂交瘤在不同培养基中的生长速度问题。
细胞生长缓慢，抗体分泌力弱及效价较低，且难于克隆化等困难[2]，限制了人骨髓瘤细胞的应用。
1.3淋巴细胞和骨髓瘤细胞的关系B淋巴细胞容易与浆细胞瘤融合，而T细胞则需要同胸腺淋巴肉瘤融合（Kohler，et al. 1977；Schwaber，1977）。
杂交瘤细胞培养注意事项
杂交瘤细胞培养注意事项1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。
此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。
如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）选择进口产品。
3. 离心前须加入少量培养液。
细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。
4. 离心问题：目前主要有两种见解。
一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第2天换液。
因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。
此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。
另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。
我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无有异常。
5. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。
6. 复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。
7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。
所以如果你的冻存液的浓度是10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。
杂交瘤细胞的培养方法
杂交瘤细胞的培养方法嘿，咱今儿个就来讲讲杂交瘤细胞的培养方法。
这可真是个神奇的领域呢！你想想啊，杂交瘤细胞就像是一群被精心呵护的宝贝。
要让它们茁壮成长，那可得下一番功夫。
首先呢，得给它们准备一个舒服的“家”，这就是培养环境啦。
温度啦、湿度啦，都得恰到好处，不然它们可不乐意待着呢。
就好像咱人一样，太冷太热都难受，它们也有自己的小脾气。
然后呢，就是营养啦。
它们得吃得饱饱的，才能有力气长大呀。
这就需要合适的培养液，里面各种成分都不能少，这可都是它们的“美味佳肴”。
接着说，培养的过程就像是照顾小婴儿。
得时刻关注着它们的状态，看看有没有啥不对劲的地方。
要是有个头疼脑热的，那可得赶紧想办法解决。
还有啊，细胞们也会有竞争呢。
就像咱在社会上一样，都想争个好位置。
所以得注意观察，让它们都能健康地发展。
培养杂交瘤细胞可不能马虎，每一个环节都得细心对待。
这可不是随便搞搞就能行的事儿。
要是不小心出了差错，那之前的努力可就白费啦，这多可惜呀！你说这杂交瘤细胞的培养，是不是挺有意思的？就像一个小小的世界，有它自己的规则和规律。
咱得好好研究，才能让它们发挥出最大的作用。
咱再想想，要是没有好好培养它们，那很多研究不就没法进行啦？很多疾病的治疗方法不就没办法找到啦？这后果可严重了呀！所以呀，对待杂交瘤细胞的培养，咱可不能掉以轻心。
得认真、仔细、负责任地去做。
这样才能让它们为我们的科学研究和医学事业做出贡献呀！总之呢，杂交瘤细胞的培养可不是一件简单的事儿，但只要我们用心去做，就一定能做好。
让我们一起加油，为了科学的进步而努力吧！。
杂交瘤细胞制备流程
杂交瘤细胞制备流程
杂交瘤细胞制备流程简述如下：
1. 免疫动物：首先将特定抗原注射到小鼠体内，激活其免疫系统产生特异性抗体的B淋巴细胞。
2. 细胞融合：从小鼠脾脏中分离出已免疫过的B淋巴细胞，与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞在特定条件下（如聚乙二醇诱导）进行融合。
3. 选择培养：将融合后的细胞接种于选择培养基上，如HAT培养基，该培养基可使非融合细胞和自身融合的骨髓瘤细胞死亡，仅允许杂交瘤细胞存活及增殖。
4. 单克隆筛选：通过有限稀释法或克隆环等方法进一步筛选单个杂交瘤细胞克隆，确保每个克隆来源单一，能稳定分泌目标抗体。
5. 抗体检测与鉴定：对获得的单克隆杂交瘤细胞株进行抗体特性分析，确认其分泌的抗体具有所需特异性和亲和力。
6. 扩增保存：成功筛选出的杂交瘤细胞株进行大量扩增，并长期冷冻保存以供后续研究和生产使用。
杂交瘤细胞的复苏与冻存
杂交瘤细胞的复苏与冻存一． 杂交瘤细胞的复苏杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。
复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过最易受损的-5℃—0℃，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。
通常情况下，冻存时细胞数量多，生长状态好的杂交瘤细胞系以及其他细胞的复苏可采用以下方法，这也是各个实验室普遍采用的程序。
不过，冻存的细胞并不都能100%复苏成功，其原因较多，如冻存时细胞数量少或生长状态不良，或复苏时培养条件改变或方法不当，也可能细胞受细菌或支原体污染，以及液氮罐保管不善等。
在出现上述情况时，可采用一些补救方法复苏这些细胞，如小鼠皮下形成实体瘤法，脾内接种法，小鼠腹腔诱生腹水和实体瘤法，以及96孔板培养法等。
二 杂交瘤细胞的冻存细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度（0℃- -20℃，每分钟下降1℃；-20℃--40℃每分钟下降2℃），可在-196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。
下面的细胞冻存方法，细胞复苏存活率均在80%以上。
1.材料：带盖吸管筒一只（铝质或洋铁皮制），内壁（包括筒底和盖）衬1-2层石棉纸或石棉布； 含10-20%血清、5-10% DMSO 的HT 培养基，冰浴降温至0℃左右（用作冻存液）；灭菌安瓶或带盖小瓶；-70℃冰箱；液氮及液氮罐；处于对数生长中期、健康而活力好的杂交瘤细胞。
方法：复苏时，从液氮中取出安瓶，立即在37℃水浴融化，待最后一点冰块快要融化时，从水浴中取出，置冰浴上。
用5-10ml HT 培养基稀释，1000r/min 10分钟，弃上清，再悬浮于适量HT 培养基中，转入培养瓶或24孔板，置37℃，7.5% CO2培养。
如果细胞存活力不高，死细胞太多，可加104-105/ml 小鼠腹腔细胞进行培养。
2、方法：（1）. 将杂交瘤细胞（或其他细胞）离心，重新悬浮于预冷的冻存液中，浓度为106-107左右/ml ，分装安瓶，每瓶1ml ，置冰浴上；安瓶上标明细胞名称、冻存日期、批号等。
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杂交瘤细胞培养冻存与复苏
杂交瘤细胞适用于无血清的培养基，无血清培养的基础培养基和添加物质杂交瘤细胞的无血清培养基通常是在标准的基础培养基中添加小分子和大分子物质，以代替血清的各种功能。
不同基础培养基对细胞的无血清培养有一定的影响。
不同细胞系对基础培养基也有选择性。
最常用的基础培养基有RPMI 1640，F12，IMDM，DMEM+F12,DMEM+F12+RPMI 1640。
形成的无血清培养基常能支持杂交瘤细胞在分批培养中生长到1×106细胞/ml以上，最终的单抗浓度可达10 μg/ml~100 μg/ml。
基本上你说的那两种都有可能，你可以参考以下操作：
【转贴】细胞融合和杂交瘤细胞培养用试剂的配制
①RPMI-1640基础培养液，1 000ml
RPMI-1640粉
10.4g
丙酮酸钠
0.11g
用900ml三蒸水(或无离子水再经过双蒸)，通CO2搅拌溶解。
称取1.8g NaHCO3，用少量三蒸水溶解，边搅拌边加入1640液中。
补足1 000ml，通过0.22μm滤膜正压过滤除菌(用CO2钢瓶加压)，分装，置30℃，菌检48小时4℃存放。
效期不超过三个月。
②RPMI-1640完全培养液，100ml
双抗(青、链霉素)
0.1ml
3％L-谷氨酰胺
2.5ml
犊牛血清
15.0ml
1640基础培养液
81.5ml
用时现配，4℃下存放不超过一周，用于细胞融合和克隆化培养的全培养液，可将小牛血清增至20％。
③200mmol/L(3％)L-谷氨酰胺溶液
L-谷氨酰胺
5.846g
三蒸水
200ml
加热至50℃使全溶，0.22μm膜滤除菌，按每管4ml分装，-20℃保存。
④双抗溶液
青霉素(钠盐)
100万iu
链霉素(硫酸盐)
1g
溶于100ml灭菌三蒸水中，小量分装，-20℃冻存。
杂交瘤细胞的保存
当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。
另外在长期的培养过程中，难免
不发生污染以至于毁灭。
所以必须冷藏保存一部分。
保存方法如下：
1．材料
(1) 细胞：取对数生长期的细胞。
(2) 10％二甲基亚砜保护液（二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒。
其本身就是毒品，无菌）：含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％RPMI—1640液。
(3) 20％FCS—1640培养液：含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。
(4) 灭菌的2ml安瓶等
2．操作方法
(1) 去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FCS—1640液，使细胞悬浮。
(3) 1 000r/min离心10min，去上清。
细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×107细胞／ml。
(3) 取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。
(4) 用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml～1.0ml，熔封安瓶。
(5) 放4℃2h。
(6) 放液氮罐气态部分（-70℃）15h。
(7) 转入液氮部分。
杂交瘤细胞的复苏
1．从液氮罐中取出安瓶立即放37℃水浴中速溶。
2．无菌操作打开安瓶，取出细胞悬液，转入组织培养瓶。
3．逐滴缓慢加入20％FCS－1640培养液3.5ml，这个过程延续3min。
4．5％CO2饱和湿度，37℃培养。
5．4h后弃去培养液上清，加入新鲜的20％FCS－1640培养液。
6．继续培养，换液，以至形成单层。