筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选
单克隆抗体制备中筛选杂交瘤细胞的原理
单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞(用选择培养基）,第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞.第一次筛选的原理和方法：细胞融合后,杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。
普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。
其一居室细胞中的DNA合成油两条途径：一条途径是生物合成途径(“D途径”)，即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。
再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。
另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。
因此，在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断,随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。
对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞,因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡.只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性,因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖.第二次筛选的原理和方法：在单克隆抗体的生产过程中,由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。
筛选杂交瘤细胞细胞培养筛选
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附法是一种常用的免疫学检测方法，用于检测细 胞表面抗原或分泌型抗原。该方法的基本原理是将特异性抗 体与酶结合，然后与细胞表面抗原或分泌型抗原结合，最后 通过酶反应显色来检测抗原的存在。
克隆化培养
克隆筛选
通过有限稀释法或流式细胞术等 方法，将杂交瘤细胞克隆化培养 ，以获得单克隆杂交瘤细胞。
培养条件
提供适宜的培养条件，如适宜的 培养基、温度、气体等，以保证 杂交瘤细胞的生长与繁殖。
抗体检测与筛选
抗体筛选
通过抗原结合试验进一步筛选出具有 高亲和力和特异性的杂交瘤细胞克隆。
抗体纯化
对筛选出的杂交瘤细胞克隆产生的抗 体进行纯化，以提高抗体的纯度和特 异性。
荧光激活细胞分选法的优点是灵敏度高、分辨率高、操作自动化，适用于大量细 胞的筛选。但是，该方法需要使用
细胞融合
选择合适的骨髓瘤细胞与免疫细胞融合
01
选择具有高免疫反应的骨髓瘤细胞系，如SP2/0、X63-
Ag8.653等，与免疫细胞融合，以产生杂交瘤细胞。
生物制品生产
抗体生产
杂交瘤细胞可以作为生产抗体的重要来 源，用于生产治疗性抗体或诊断试剂。
VS
细胞培养技术
通过筛选高表达量的杂交瘤细胞，可以优 化细胞培养技术，提高生物制品的生产效 率和质量。
05
杂交瘤细胞筛选的挑战与解决方案
克隆不稳定问题
克隆不稳定是指杂交瘤细胞在培养过程中出现生长缓慢、 停滞甚至死亡的现象，导致难以获得稳定表达抗体的细胞 株。
克隆扩大培养与建株
杂交瘤细胞筛选原理
杂交瘤细胞筛选原理
杂交瘤细胞筛选原理是一种常用的实验方法，用于筛选具有特定功能的细胞株。
其基本原理是将转录有特定功能的基因（例如抗体基因）与癌细胞融合形成杂交瘤细胞，通过筛选和鉴定，最终得到具有所需功能的细胞株。
具体步骤如下：
1. 提取源细胞：从目标细胞（例如淋巴细胞）中提取RNA，
并提取通过免疫化学等方法获得的抗体。
2. 合成cDNA：使用逆转录酶将RNA转录成相应的cDNA，
得到基因的mRNA序列。
3. 构建DNA片段：将合成的cDNA与表达载体连接，构建一
个含有抗体基因的DNA片段。
4. 转染杂交瘤细胞：将构建的DNA片段转染至癌细胞中，使
之融合形成杂交瘤细胞。
5. 筛选与鉴定：在适当的培养条件下，对杂交瘤细胞进行筛选和鉴定，通常会使用抗体特异性分析、流式细胞术等方法。
6. 克隆化：从筛选并鉴定出具有所需功能的杂交瘤细胞中选择单个细胞克隆并扩大培养。
7. 检测功能：对所得的单克隆细胞株进行进一步的功能检测，
以确认其具备所需的功能。
通过以上步骤，可以筛选出具有特定功能的杂交瘤细胞株，常用于生产大量的抗体或进行其他特定功能的研究。
筛选杂交瘤细胞的方法
如何筛选杂交瘤细胞？教学中经常有学生问：如何筛选杂交瘤细胞？浙科版选修3教材中有筛选杂交瘤细胞的内容，但没有如何筛选的方法，以下的上海高考试题可以在教学中作为一个情境感知。
单克隆抗体制备示意图情境导入：已知细胞合成D N A有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。
人淋巴细胞中有D N A合成的S途径，但一般不分裂增殖，鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加入聚乙二醇促进融合，获得杂种细胞（一般只考虑细胞两两融合）。
细胞存在情况分析：骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合形成3种杂种细胞，则试管中有5种细胞，即B淋巴细胞自身融合的细胞、骨髓瘤细胞自身融合的细胞、杂交瘤细胞、B淋巴细胞和骨髓瘤细胞；鼠骨髓瘤细胞能不断分裂增殖，因此骨髓瘤细胞自身融合的细胞、杂交瘤细胞和骨髓瘤细胞能增殖。
设计方法：在培养液中添加入氨基嘌呤再收集增殖的细胞。
原理分析：加入氨基嘌呤后，使D合成途径阻断，仅有该合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的瘤细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞可以利用淋巴细胞中的S途径合成D N A而增殖。
NO.2HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞的机理首先，在已免疫过的B淋巴细胞（即效应B细胞）和骨髓瘤细胞进行杂交时，可能出现的情况应该先弄清楚。
如果只考虑两两融合，可能的情况有：（1）（效应）B淋巴细胞和（效应）B淋巴细胞的融合；（2）（效应）B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合（即杂交瘤细胞）；（3）骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合（即瘤瘤细胞）。
第一类细胞在体外培养的条件下，因为无法无限增殖，最终死亡，因此，筛选的关键是限制第二类细胞的增殖。
科学家在设计实验时，已经考虑到这方面问题，所以他们选择的瘤细胞是有遗传缺陷的，即胸腺嘧啶核苷激酶缺陷（T K－）或者次黄嘌呤磷酸核苷转移酶（H G P R T－）缺陷。
筛选的目的：获得杂交瘤细胞。
筛选的方法：用选择性培养基来完成，即H A T培养基。
96孔板培养和筛选杂交瘤细胞原理
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杂交瘤细胞筛选实验报告
一、实验目的本实验旨在通过细胞融合技术，获得具有无限增殖能力和特异性抗体分泌能力的杂交瘤细胞。
通过筛选和克隆化，最终获得纯化的单克隆抗体。
二、实验原理杂交瘤细胞筛选技术是利用细胞融合技术，将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的淋巴细胞融合，形成杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有肿瘤细胞无限增殖的特性，同时保留淋巴细胞分泌特异性抗体的能力。
通过筛选和克隆化，获得纯化的单克隆抗体。
三、实验材料1. 试剂：聚乙二醇（PEG）、HAT培养基、抗原、酶联免疫吸附剂（ELISA）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠lgG抗体、包被液、脱脂奶粉、洗涤液、底物显色液、终止液等。
2. 仪器：倒置显微镜、细胞培养箱、超净工作台、冰箱、酶标仪、微量移液器、恒温箱、96孔板等。
3. 实验动物：小鼠。
四、实验步骤1. 细胞融合：将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞按照一定比例混合，加入PEG诱导细胞融合。
2. 细胞培养：将融合后的细胞接种于含有HAT培养基的培养瓶中，在细胞培养箱中培养。
3. 细胞筛选：经过1-2周的培养，筛选出能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。
4. 特异性抗体筛选：采用ELISA方法，将抗原固相在微孔板上，将杂交瘤细胞培养上清加入微孔板中，检测抗体与抗原的结合情况。
5. 克隆化：将筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，确保获得纯化的单克隆抗体。
6. 阳性杂交瘤细胞筛选：利用间接ELISA方法，检测克隆化后的杂交瘤细胞是否产生特异性抗体。
五、实验结果1. 细胞融合：成功将骨髓瘤细胞和分泌某种抗体的淋巴细胞融合。
2. 细胞培养：在HAT培养基中，杂交瘤细胞能够存活并无限增殖。
3. 细胞筛选：经过筛选，获得能够存活并无限增殖的杂交瘤细胞。
4. 特异性抗体筛选：ELISA结果显示，部分杂交瘤细胞能够产生特异性抗体。
5. 克隆化：对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，获得纯化的单克隆抗体。
6. 阳性杂交瘤细胞筛选：间接ELISA结果显示，克隆化后的杂交瘤细胞均能产生特异性抗体。
杂交瘤细胞的筛选方法和原理
杂交瘤细胞的筛选方法和原理
杂交瘤细胞是肿瘤研究领域中使用最广泛的，表征多种癌症类型的家族。
这种细胞的重要作用体现在它们可以用来模拟癌症在体内发生的过程。
因此，有效、快速地筛选杂交瘤细
胞非常重要，可以加速癌症研究的进展。
杂交瘤细胞的筛选分为两种：物理筛选和生物筛选。
物理筛选基于杂交瘤细胞的物理特性，例如悬浮性、浮力、颗粒形状和粒径。
常见的物理筛选方法包括离心筛选、穿孔筛选、磁
珠捕集和称重筛选等。
生物筛选基于杂交瘤细胞的生物特性，包括细胞表面标志物表达和细胞周期等。
其中，常见的细胞表面抗原检测的方法有流式细胞术、免疫组化和免疫复合等。
而在细胞周期筛选方面，常采用的方法有图像分析、培养前和培养后碘吸附筛选、周期蛋白检测和DNA染
色检测。
杂交瘤细胞的有效筛选，有助于临床实验室精准定位合适的杂交瘤细胞和相应基因，更好地进行肿瘤研究。
因此，不同的筛选方法对于快速筛选高质量的杂交瘤细胞至关重要。
总之，杂交瘤细胞是肿瘤研究领域中最普遍使用的家族，它们可以模拟癌症在体内发生的过程，增强癌症研究的可行性。
因此，物理筛选和生物筛选方法都可以有效快速地筛选高质量的杂交瘤细胞，为肿瘤的研究和治疗提供重要指导。
杂交瘤细胞的筛选方法
杂交瘤细胞的筛选方法杂交瘤细胞是一种重要的细胞系，它具有细胞免疫特性和高效的抗体分泌能力，因此在生物医学研究和生物制药领域有着广泛的应用。
在进行杂交瘤细胞的筛选时，需要注意一些关键的方法和步骤，以确保获得高质量的杂交瘤细胞系。
本文将介绍杂交瘤细胞的筛选方法，希望对相关研究工作有所帮助。
首先，进行细胞融合。
细胞融合是获得杂交瘤细胞的第一步，通常采用多种方法进行细胞融合，如聚乙二醇法、电脉冲法和病毒介导法等。
在进行细胞融合时，需要注意细胞的状态和融合条件的选择，以确保融合效率和细胞存活率。
其次，进行细胞筛选。
细胞融合后，需要对细胞进行筛选，以筛选出具有杂交瘤特性的细胞。
通常可以采用细胞培养基中添加抗生素的方法进行筛选，如添加含有肿瘤细胞毒素（如HAT）的培养基，以选择出对抗生素敏感的杂交瘤细胞。
接着，进行单克隆细胞的筛选和鉴定。
在获得杂交瘤细胞系后，需要进行单克隆细胞的筛选和鉴定，以确保所得到的细胞具有单一的抗体分泌能力。
通常可以采用限稀释法或流式细胞术等方法进行单克隆细胞的筛选和鉴定，以获得高效的抗体分泌细胞系。
最后，进行细胞的保存和扩增。
在获得理想的杂交瘤细胞系后，需要进行细胞的保存和扩增，以确保细胞系的长期稳定和高效的抗体分泌能力。
通常可以采用液氮保存和定期传代扩增的方法进行细胞的保存和扩增，以满足不同实验和生产的需要。
总之，杂交瘤细胞的筛选是一个关键的步骤，需要注意细胞融合、细胞筛选、单克隆细胞的筛选和鉴定，以及细胞的保存和扩增等关键方法和步骤。
希望本文介绍的方法对相关研究工作有所帮助，也希望在未来的研究和应用中能够取得更好的效果。
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5、过程：
3、过程：
病毒表面含有的糖蛋白和一些 酶能够与细胞膜的糖蛋白发生 作用，子和 脂质分子重新排布
细胞膜打开
细胞发生融合
6、优点：
突破了有性杂交的局限， 使远缘杂交成为可能
7、应用： 用于研究细胞遗传、细胞免 疫、肿瘤和生物新品种培养等的重 要手段。 最重要的用途：制备单克隆 抗体
BB
B瘤
瘤瘤
瘤
筛选杂种细胞
杂交瘤细胞 ２、制备过程中应用哪些细胞工程技术手段？ 细胞融合技术、细胞培养技术
3、单克隆抗体的概念： 化学性质单一，特异性强的抗体
4、单克隆抗体的优点：
特异性强，灵敏度高，并可大量制备。
（三）单克隆抗体的应用
①诊断疾病（识别作用，如 同位素标记单克隆抗体，
可诊断肿瘤、心血管畸形
.
.
问题讨论
1、如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？
提示： 1 .什么样的细胞可以产生抗体？
2 . 什么样的细胞可以无限增殖？ 2、瘤细胞和癌细胞有何区别？ 共同点：两者都有无限增殖的能力 不同点：瘤细胞不能转移
（二）单克隆抗体的制备
1、设计方案： 一个B淋巴细胞－－只分泌一种特异性抗体 小鼠骨髓瘤细胞－－能无限增殖 杂种细胞
c
f 乙
（5）在产生多莉羊时，需将e 细胞形成的早期胚胎移入另一 头母羊（f）子宫里，这种技术 胚胎移植 在细胞工程中叫——————
f 乙
(2)产生 甲和乙的过程分别 有性生殖 克隆 是—————和————
a
b
d
（3）在形成乙是的过程中， 需要将d的细胞核取出，将c 细胞核移入d细胞内，此技术 e 核移植。所需的受体细胞 叫——— 大多采用动物卵细胞的原因 卵细胞大，易于操作；卵细 是——————————— 甲 胞具有继续分化的潜能。 ———————————— —（4）绵羊的白色对黑色为 显色。若甲是白色绵羊，要 判断它是否纯合体，选用与 黑毛 它交配的绵羊最好是———
问题讨论
１、植物体细胞杂交最终得到的是完整的植物个 体，动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗？ 不能，只能得到杂交细胞 2、动植物细胞在结构上有何区别？这与它们 杂交或融合过程有什么影响？ 动物细胞无细胞壁，动物细胞融合过程中 不须去除细胞壁和再生出细胞壁。 3、植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的 方法有哪些？ 离心、振动、电激等物理方法；PEG等化学方法
优点：准确、高效、简易、快速
②用于治疗疾病和运载药物（主要用于癌症 治疗，也可运载药物，如 “生物导弹”） （导向作用，作为载体，生物导弹 =单克隆抗体+药物，用于治疗肿瘤）
等）
（位置准确、疗效高、副作用小）
单克隆抗体
小结
两个过程
动物细胞培养过程 单克隆抗体制备过程 一个诱导细胞融合的新方法 ——灭活病毒
2、单克隆抗体制备过程
注射抗原 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 细胞融合、筛选
（选择性培养基）
诱导其融合的 方法有哪些？
杂交瘤细胞
细胞培养
筛选，继续培养 足够数量的、能产生 特定抗体的细胞群 体外培养 注射到小鼠腹腔
单克隆抗体
单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备
思考：
１、细胞融合后培养液中有几种细胞？
B
二、单克隆抗体
？
1.抗体是由何种细胞产生的？ 2.抗体是如何产生的？
（一）获得抗体的传统方法
1、方法： 向动物体内反复注射某种抗原，使动 物产生抗体，从动物血清中分离所需抗体。
2、缺点： 产量少、纯度低、特异性差
.
.
3、解决问题的设想: 免疫反应过程中，每一个B淋巴 细胞只分泌一种特异性抗体。 克隆单一的B淋巴细胞，形成细 胞群，获得大量的单一抗体。 4、面临的新问题： 一个B淋巴细胞不可能在体外培养 条件下无限增殖的。
2.2.2
动物细胞融合与单克隆抗体
一、动物细胞融合 1、概念 动物细胞融合也称细胞杂 交，是指两个或多个动物细 胞形成一个细胞的过程
2、原理： 膜的流动性
一、动物细胞融合
3、结果：形成杂交细胞。 杂交细胞：融合后形成的具 有原来两个或多个细胞遗传信息的 单核 细胞。 4、诱导方法： 聚乙二醇（PEG）、 灭活的病毒、电激等。
问题讨论
4、动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还 有其他方法吗？ 能，还可以利用灭活的病毒（生 物方法）进行诱导 ５、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本 原理是否相同？ 相同，都是细胞膜的流动性
问题讨论
6、为什么要用灭活的病毒？ 病毒一般对生物体是有伤害的。 丧失感染活性 物理或 仙台病毒 化学方法 保留融合活性
8、植物、动物细胞融合的比较
比较项目 融合的原理 步骤 诱导方法 植物体细胞杂交 动物细胞融合
细胞膜的流动性 细胞膜的流动性 去除细胞壁后诱 导原生质体融合 使细胞分散后诱 导细胞融合
物理（离心、振 物理、化学方法 荡、电激） （同左）
化学（聚乙二醇） 灭活的病毒
用途
获得杂种植株
主要用于制备 单克隆抗体
• 世界上第一只克隆羊 “多莉”的培育过程如 图所示，请据图回答：
a
b
d
c
(1)图中的甲为苏格兰绵羊， e 乙为多莉羊。那么，a和b 减数 是通过_______ 分裂形成的， 甲 其DNA含量是体细胞的 _______ 一半 ；c肯定是__ 细 体 胞，乙的遗传性状与提供 ___________ 的绵羊 一致. 细胞核
三个“一” 一个新细胞——杂交瘤细胞 一个优势——单克隆抗体特异 性强、灵敏度高的优势
下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的抗 体实验方案 A 制备单克隆抗体 1、该实验方案的目的是__________ 2、该方案能达到预期效果吗？为什么？ B 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞
C 3、A是从小鼠的脾脏中取得 抗体 _______, B细胞 该细胞能够产生______ 细胞融合过程，常用 足够数量的细胞群 4、图中B为________ 灭活病毒 _________作为诱导剂，该细胞继 双亲细胞 的遗传特性，既能 承___________ 体外培养 注射到 分泌抗体 无限增殖 __________,又能___________。 小鼠腹腔 5、C过程指细胞培养，该过程包括 原代 传代培养两个阶段，其 _____培养和_____ 50 代以内的的细胞属于细胞株。 中_____