质粒dna的提取步骤
质粒DNA的提取
4. 向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不 应超过5min，以免质粒受到破坏。如果菌液没有变清亮，可能是由于菌体过多，裂解不彻底，应减 少菌体量。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大 影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降 低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了增加质粒的回收效率，可将得到的 溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，1200rpm离心2 min，将质粒溶液收集到离心管中。
7.向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW (请先检查是否已加入无水乙醇)12,000 rpm 离 心30-60s，倒掉收集管中的ห้องสมุดไป่ตู้液，将吸附柱CP3放入收集管中。 8. 重复操作步骤7。 9. 将吸附柱CP3放入收集管中，12,000 rpm离心2 min，目的是将吸附柱中残余的 漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留 乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10. 将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000 rpm离心2 min将质粒溶液收集到离 心管中。
5.向离心管中加入350 μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色 絮状沉淀。12,000 rpm 离心10 min。
质粒DNA的提取
质粒DNA的提取方案一常规小量提取(碱裂解法)【实验目的】(1)掌握碱裂解法小量提取质粒DNA的原理及操作过程。
(2)掌握微量加样器的使用方法。
【实验原理】在NaOH存在的碱性环境(pH值12.0～12.6)中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA由于分子量小且缠绕紧密，仍为自然状态。
将pH值调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA恢复可溶状态的。
通过离心，去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质等物质，上清液中的质粒DNA可用酚/氯仿抽提。
【实验试剂】(1)溶液I:50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-HCl(pH值8.0)10mmol/LEDTA(pH值8.0)溶液I可成比配制，每瓶约100ml,在6.9×10°Pa(10lbf/in²)高压下蒸汽灭菌15min,贮存于4℃下。
(2)溶液Ⅱ:0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L贮存液稀释)1%SDS(3)溶液Ⅲ:5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml(4)酚(pH值7.8～8.0)。
(5)氯仿。
(6)TE缓冲液。
(7)6×DNA上样缓冲液。
(8)0.8%琼脂糖。
(9)无水乙醇。
【实验器材】(1)低温高速离心机。
(2)旋涡振荡器。
(3)Eppendorf管(EP管)。
(4)微量移液器。
(5)移液器头。
(6)电泳仪与电泳槽。
(7)紫外透射仪。
【实验样本】细菌(含某种质粒)。
【实验步骤】(1)将5ml菌液分次装入同一1.5mlEP管中，3000r/min离心5min,以收集菌体。
(2)将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡5min。
(3)加200μl新配制的溶液Ⅱ,盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，不可强烈振荡，放置于冰上3min左右。
提取质粒dna的方法
提取质粒dna的方法提取质粒DNA的方法是一种从生物样品中提取DNA的方法，用于分析基因组学、遗传学或其他基因相关的研究。
它是所有DNA技术的基础。
提取质粒DNA的方法主要包括三个步骤：破解细胞壁、提取DNA片段和提取DNA片段。
第一步，破解细胞壁。
为了提取细胞内的DNA，必须先破坏细胞壁。
这一步可以通过使用植物激素、酶和其他破坏细胞壁的物质来完成。
第二步，提取DNA片段。
在破坏细胞壁之后，生物样品中的DNA就可以从细胞内被提取出来。
这一步通常是将样品加入一定的溶液，如洗涤溶液，然后用放大器去提取DNA片段。
第三步，提取DNA片段。
在提取DNA片段之后，必须对其进行纯化处理，以便提取的DNA片段不会受到其他物质的干扰。
一般情况下，这一步是通过使用离心机将DNA 片段从溶液中分离出来，然后用水冲洗去除其他物质，最后得到纯净的DNA片段。
提取质粒DNA的方法也可以用来提取植物细胞内的DNA。
与提取动物细胞中的DNA不同，植物细胞内的DNA要更加困难，因为植物细胞周围可能有多层细胞壁，而这些细胞壁很难被破坏。
因此，植物细胞内的DNA提取一般都是采用化学方法，即使用碱性有机溶液，以破坏细胞壁，然后再用放大器提取DNA片段。
此外，还有一些无细胞DNA提取的方法，如PCR法、小RNA测序、质粒提取等。
PCR法是用来检测和检验DNA的一种技术，可以扩增微量DNA，从而获取充足的DNA材料进行检测。
小RNA测序是一种新型的基因测序技术，可以检测植物和动物体内特定的RNA，检测特定靶基因的表达。
最后，质粒提取是一种从生物样品中提取DNA质粒的技术，可以用于分子生物学研究，如基因克隆、DNA测序等。
总之，提取质粒DNA的方法是一种常用的DNA提取技术，也是所有DNA技术的基础。
它可以用于从动物和植物样品中提取DNA片段，以及从无细胞DNA中提取DNA质粒，以用于各种基因组学、遗传学和分子生物学研究。
质粒dna的提取
质粒DNA的提取1. 引言质粒DNA提取是在分子生物学研究中常用的实验操作之一。
质粒是一类圆环状的DNA分子，存在于原核生物中。
质粒DNA提取的目的是为了获取纯度高的DNA样品，以便进行后续的实验操作，如聚合酶链式反应（PCR）、限制性酶切、测序等。
2. 实验材料在进行质粒DNA提取实验前，需要准备以下实验材料：•细菌培养液：含有所需质粒的培养液。
•碱裂解液：用于裂解细胞并释放质粒DNA的实验液。
•高盐含量的溶液：用于提取DNA。
•蛋白酶K：用于消化蛋白质。
•硅胶粉末：用于吸附DNA。
•乙醇：用于沉淀DNA。
•TE缓冲液：用于溶解和储存提取的质粒DNA。
3. 实验步骤3.1 细菌培养与收获首先，需进行细菌培养和收获，以获取含有所需质粒的培养液。
培养液中的细菌应为含有目标质粒的菌株，如大肠杆菌。
3.2 细胞破碎与质粒DNA释放将收获的细菌培养液进行离心，去除培养液并沉淀细胞。
然后将细胞重悬于碱裂解液中，用震荡器在适当的温度和时间条件下裂解细胞，释放质粒DNA。
3.3 蛋白质消化为了去除细胞中的蛋白质，加入适量的蛋白酶K，进行蛋白消化。
消化的时间和温度应根据实验要求进行调整。
蛋白消化完成后，通过离心将蛋白质沉淀分离。
3.4 DNA提取将消化液中的DNA溶液转移到其它离心管中，并加入高盐含量的溶液。
通过离心将DNA与其他杂质分离。
此步骤中，DNA会被溶液中的硅胶粉末吸附，以去除杂质。
3.5 DNA沉淀将去除杂质的DNA溶液转移到新的离心管中，加入冰冷的乙醇。
通过离心，将沉淀的DNA分离出来。
注意，在沉淀过程中，应避免DNA的过度离心，以免损坏DNA分子。
3.6 DNA溶解和储存将DNA沉淀后，溶解在适量的TE缓冲液中。
TE缓冲液具有适当的pH值和离子浓度，能够稳定DNA分子，并提供良好的保存条件。
4. 实验注意事项在质粒DNA提取实验中，需要注意以下几点：•操作过程应严格遵守无菌操作，避免外源性DNA的污染。
质粒dna提取步骤
质粒dna提取步骤
质粒 DNA 提取是分子生物学实验中的一项基本技术，用于从细菌细胞中分离出质粒DNA。
以下是一般的质粒 DNA 提取步骤：
1. 收集细菌培养物：将含有质粒的细菌培养在适当的培养基上，直到培养物达到合适的密度。
可以使用离心或过滤的方法收集细菌细胞。
2. 细胞裂解：将收集的细菌细胞加入裂解缓冲液中，通过物理方法（如搅拌、超声处理等）或化学方法（如加入裂解酶等）使细胞破裂，释放出质粒 DNA 和其他细胞成分。
3. 去除细胞碎片：将裂解后的混合液通过离心或过滤的方法去除细胞碎片和其他杂质。
4. 沉淀 DNA：向裂解液中加入乙醇或异丙醇等沉淀剂，使质粒 DNA 沉淀。
通过离心将沉淀收集。
5. 洗涤沉淀：用 70%的乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐分和杂质。
6. 干燥沉淀：将洗涤后的沉淀离心，并去除上清液。
然后将沉淀在室温下干燥，以去除残留的乙醇。
7. 溶解 DNA：将干燥的沉淀加入适当的缓冲液中，使质粒 DNA 溶解。
可以在缓冲液中加入 RNA 酶以去除 RNA 杂质。
8. 纯化和浓缩 DNA：可以使用柱层析、电泳或其他方法对提取的质粒 DNA 进行进一步的纯化和浓缩。
9. 质量检测：使用琼脂糖凝胶电泳或其他适当的方法检测提取的质粒 DNA 的质量和完整性。
需要注意的是，具体的质粒 DNA 提取步骤可能因使用的试剂盒或实验条件而有所不同。
在进行质粒 DNA 提取之前，应仔细阅读所使用的试剂盒说明书或相关实验方案，并根据实际情况进行适当的调整和优化。
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。
以下是具体的实验原理和操作步骤。
实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。
接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。
最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。
操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。
在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。
2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。
使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。
将上清液倒掉，保留菌体沉淀。
3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。
4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。
这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。
5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。
上清液中含有蛋白质和其他污染物。
6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。
7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。
将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。
8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。
9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。
注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。
2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。
3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。
4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。
总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。
质粒DNA的提取实验报告
质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。
3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。
质粒DNA的提取——碱变性提取法
姓名系年级学号科目分子生物学实验题目质粒DNA的提取——碱变性提取法组别周一一、实验目的1．掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。
2．掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。
二、实验原理碱变性提取质粒DNA一般包括三个步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分解和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
三、实验仪器和材料试剂仪器：恒温振荡培养箱，高温冷冻离心机，漩涡振荡器，水浴锅，1.5ml离心管，不同型号吸头，微量移液管，三角瓶等菌体：含质粒puc19菌株 E.coli DH5α受体菌试剂：LB培养基，氨苄青霉素AP，溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液1X，上样缓冲液。
四、实验步骤1.含质粒puc19菌株的培养及收获E.coli DHSα（puc19）→LB培养基+AP→37°c 12~16h→LB培养基+AP→37°c 4~6h→500μl管称重(14.239g) →取菌液300μl→配平离心6000转5min→弃清→加5ml Sol I混匀→6000转5min→弃清→称重(菌体与离心管总重量为14.425g)→菌体称重（0.187g）2. 细胞裂解提取质粒DNA加Sol I 2ml 菌体漩涡混匀，冰浴5min加Sol II 2ml 轻柔颠倒混匀，冰浴5min加Sol III 1.5ml轻柔颠倒混匀，冰浴5min平衡，12000转15min→转上清至新50ml管（V1=8.8ml）加（2V1=17.6ml）冰乙醇，颠倒混匀→-20°c 30min12000转15min→弃上清→5ml 70%乙醇洗涤12000转2min→弃上清→重复洗涤一次→37°c 5min1mlTE溶解→粗提物3.质粒DNA的纯化1.0ml粗提物+100μg RNaseA→37°c 1~2h→等分500μl x2份→加等体积分液，混匀→12000转姓名系年级学号科目分子生物学实验题目质粒DNA的提取——碱变性提取法组别周一5min→转上清至新管→加等体积酚，氯仿异戊醇→12000转5min→转上清至新管→加等体积氯仿异戊醇混匀→12000转5min→转上清于新管→加1/10体积=22.0μl 3M NaAc，混匀，此时两管中液体体积均为242μl→加2倍体=484μl的积冰乙醇混匀→-20°c 30min→12000转15min→弃上清→70%乙醇500μl洗涤→12000转2min→弃上清→重复洗涤一次→37°c 5min→25μl TE管溶解→共50μl质粒DNA/组4. 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA五、实验结果1.本次试验电泳条带还算清晰，点样处有亮带，说明有杂蛋白2.染色体DNA条带比较暗，说明含量很低，提取样品纯度还算理想3.与marker比较我们提出的质粒分子量在范围之内4.与未添加RNase相比较，我们未出现模糊条带，证明RNase效果明显且操作方法正确5.出现RNA条带可能的原因是RNase反应时间不够或者反应混合不充分造成六、注意事项1.酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。
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质粒dna的提取步骤
质粒DNA的提取步骤
质粒DNA是细菌中的圆形DNA分子，与细胞染色体不同，可以在细菌
中自主复制。
质粒DNA的提取是一项常规实验，可用于高效地分离纯
化质粒。
在进行质粒DNA提取之前，需要准备一些必要的试剂和设备。
材料和试剂：
1.细菌培养物
2.经过钙离子或热处理的TTES缓冲液（10mM Tris-HCl [pH8.0]，1mM EDTA [pH8.0]，25%蔗糖溶液）
3.蛋白酶K处理缓冲液（50mM Tris-HCl [pH8.0]，100mM NaCl，10mM EDTA [pH8.0]）
4.醇
5.异丙醇
6.以太
7.加拿大CFII列的紫外灯
8.恒温振荡器
步骤：
1.收集培养物
将培养物用无菌工具收集到1.5毫升离心管中。
通过离心将细胞沉淀
到离心管底部。
2.细胞溶解
添加500 μl TTES缓冲液到离心管中，并用Vortex或20号钢珠打破
细胞壁。
将离心管放在水浴中恒温振荡器中，30分钟以70 rpm。
3.移除细胞碎片
离心管离心2分钟，将浮于上层的无菌细胞断片去除（上清），移至
另外的离心管。
4.蛋白酶K处理
向上清中加入100 μl蛋白酶K处理缓冲液和15μl蛋白酶K，室温下静置10分钟，然后加入200 μl醇混合液（3：7乙醇：异丙醇），与上清混合均匀。
5.沉淀DNA的制备
离心管离心2分钟，然后将上清倒出。
沉淀物将采用70%的醇作为清洗液，在沉淀物上滴入1 ml的70%醇，在打破后的沉淀物中短暂的搅拌。
离心管轻轻晃动，浮于上层的除去，再加1ml的70%酒精，将沉淀物中混合在一起。
6.沉淀物最佳溶解
将沉淀物在无尘工作台上空气干燥（大约10~15分钟），直到酒精挥
发。
将沉淀物用10毫升 TE缓冲液（10mM Tris-HCl [pH8.0]，1mM EDTA [pH8.0]）悬浮，经缓慢抽气镇静。
7.检测提取的DNA
通过紫外光下的可见目标，如果质粒DNA等目标脱胶，就可以看到了。
通常设定为 OD260/OD280值为1.8-2.0。
总结：
通过上述步骤，我们可以提取到高品质的质粒DNA。
同时，我们需要注意，这个实验其实非常容易受到外界中细菌、皮肤上的人体细胞污染，需要注意操作的环境清洁，最好在无菌条件下进行操作。
另外，使用
蛋白酶K处理缓冲液和醇等试剂时，也需要格外小心。