质粒DNA的小量制备
质粒三种提取方法的比较(精)
（三）小量一步提取法
1.取0.5ml细菌过夜培养物，置1.5ml的Eppendolf管中 2.加入0.5ml的氯仿：异戊醇，用振荡器最大速度振荡1min， 充分混匀。 3.12000g，离心5min，取上清移至另一个Eppendolf管中， 加入500µl异丙醇混匀，立即12000g，离心5min。 4.弃上清，加入500µl70%乙醇漂洗沉淀，短暂离心。 5.弃上清，室温干燥沉淀2min，然后加入20μl无菌水溶解 DNA。
材料、设备及试剂
一ห้องสมุดไป่ตู้材料
含卡那酶素的E. coli DH5α，1.5ml塑料离心管(又称 eppendorf管), 离心管架。
二、设备
微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒 温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器， 电 泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。
[注意]
1. 提取过程应尽量保持低温。 2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/ 氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量 除干净需多次抽提。 3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时 间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA 可用异丙醇(一 般使用等体积), 无水乙醇（2-2.5倍体积），区别？。
DNA双链
变性 强碱 中性 复性 DNA单链
闭合环状的质粒DNA，在变性后不会 分离，复性快；
染色体线性DNA和或有缺口的质粒 DNA变性后双链分离，难以复性而形成 缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结 合在一起，在离心的时候沉淀下去。
变性
煮沸法：
将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁 的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100℃使其裂 解。加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开 DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体 DNA变性。但是，闭环质粒DNA彼此不会分 离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相 缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA 的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心 除去变性的染色体核蛋白质，就可从上清中 回收质粒DNA
实验一、质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳
三、仪器、材料与试剂
(一)仪器 1．恒温培养箱 2．恒温摇床 3．台式离心机 4．高压灭菌锅 (二)材料 1．含连接外源基因质 粒的E. coli 2．1.5mL Eppendorf管 3．吸头、微量移液器
(三)主要试剂
溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl度,减少抽提过程中的 机械剪切作
四、实验步骤
• (一)、称取0.5g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入50 mL 0.5xTAE 缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，温度降至60 ℃左 右时加入少许EB溶液，摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。 • (二)胶板的制备
1．将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。 2．将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，加入EB后，缓缓倒入有 机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(不要形成 气泡)。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操 作，并小心污染环境。
Solution III
5mol／L 乙酸钾 冰乙酸 水 60 mL 11．5mL 28．5mL
TE缓冲液 10mmo1／L Tris· HCl 1mmo1／L EDTA(pH8.0) 胰RNA酶溶液
将RNA酶溶于10mmo1/L Tris· HCl(pH7．5)和 15mmo1/L NaCl中，配成10mg/mL的浓度，于100℃加热 15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。
3．待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。
4．加入电泳缓冲液至电泳槽中。
• (三)加样 • 用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品 加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。 • (四)电泳
1．接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极， DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速 度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。
质粒提取原理及步骤
For personal use only in study and
research; not for commercial use
质粒提取原理及步骤
一、导论
已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：
1. 细菌培养物的生长。
2. 细菌的收获和裂解
3. 质粒DNA的纯化。
（一）细菌培养物的生长
从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续
培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不
同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的
操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
质粒DNA的碱裂解法提取与纯化
质粒DNA的碱裂解法提取与纯化一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。
2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。
使用前临时配置。
3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。
5M KAc 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O 至500ml。
4℃保存备用。
4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。
1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA （pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。
15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7. 5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。
15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。
8．溴化乙锭（EB）：10mg/ml9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。
10. 6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。
11. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。
质 粒 提 取 原理及步骤
质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。
2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳一、前言质粒质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。
大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。
然而，1984年，在Streptomyces coelicoler(天蓝色链霉菌)等放线菌以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质粒。
天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。
质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。
质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可能。
有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒)。
有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。
一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。
它是基因工程最常见的运载体。
质粒在细胞的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞只含有一个或几个质粒分子，如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。
细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。
质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。
质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。
内蒙古大学基因工程大实验思考题
内蒙古大学基因工程大实验思考题本科生基因工程实验(记录及课后思考题)姓名:学号:专业:完成日期:2012年9月9日指导老师:一、质粒DNA的小量制备1.影响最终质粒产量的主要因素有哪些？①与菌的生长状况有关②和提取时的温度有关，需要低温③加溶液Ⅱ、Ⅲ时操作要温和④要用酚和氯仿的混合液多次抽提去除蛋白质⑤要用冰乙醇沉淀2.提取到的质粒纯度将直接影响到以后的酶切效果，如何操作才能尽可能的避免蛋白质的污染？加入酚：氯仿：异戊醇去除蛋白质，氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。
二、质粒DNA电泳鉴定1.泳道的质粒DNA有几条带？为什么？质粒可能会有超螺旋构型，环状构型和线性构型。
这三种构型中，迁移率最快的应该是超螺旋的，其次是线性和环状。
通常观察到的是超螺旋和环状质粒。
2.溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA？在0.7%、1%、1.4%、2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1000bp、600bp、200bp、150bp的双链线性DNA片段大致相同3.影响本实验结果的因素有哪些？DNA的长度，结构，胶的浓度，电压等会对实验结果造成影响。
三、质粒DNA的酶切1.酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？有影响加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。
大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。
2.如何估计DNA用量和酶的用量？DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/10001U酶切割1ug的质粒，酶的量不要超过酶切体系的1/10。
3.在吸取内切酶的时候如何操作才能避免浪费？将枪头不要插入液体很深部位，刚过液面且可以吸取所需的体积的液体。
四、PCR扩增制备目的基因1.复性温度是根据什么确定的？可以根据公式：2（A + T）+ 4（C + G），再减5-10度,一般为55℃-60℃当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR 退火温度是必需的。
质粒
1.3.3 凝胶的制备 以稀释的电极缓冲液为溶剂,用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶,灌入水 平胶框或垂直胶膜，插入梳子,自然冷却。
1.1.3 琼脂糖透明无紫外吸收,电泳过程和结果可直接用紫外光灯检 测及定量测定
1.1.4 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干 膜可长期保存
.
1.2 DNA的琼脂糖凝胶电泳
核酸相对分子量质量及分子构型 凝胶的浓度
1.2.1 核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系
DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对 的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的 移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大 小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁 移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时， 分子大小不宜超过此值。
载体(Vector)： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制 与表达的质粒(运载工具)。
具备的条件： • 易于鉴定； • 在受体细胞中可以独立复制； • 易于筛选； • 易于导入受体细胞。
载体的结构：
1. 抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene)
1.4 结果分析
1.4 结果分析
1.DNA 相对分子量标准物（marker); 2.pUC19 质粒 DNA 经EcoRⅠ 完全酶切； 3.pUC19 质粒 DNA 经EcoRⅠ 部分酶切； 4.自提pUC19 质粒 DNA （此效果提得较好，为1带，以超螺旋质粒DNA 为主。有时是3条带，分别为超螺旋质粒，线状质粒和开环质粒。还有时 结果为2条带）
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实验一质粒DNA的小量制备（碱裂解法）一、实验原理所有分离质粒DNA的方法都含有以下3个步骤：①细菌培养物的生长；②细菌的收获和裂解；③质粒DNA的提取与纯化。
本实验以碱性SDS快速法小量制备pUC质粒。
碱裂解法对于以前应用的所有大肠杆菌均卓有成效。
该方法的特点是：加溶菌酶可破坏菌体细胞（小量制备可省略不用溶菌酶），去污剂SDS可使细胞裂解，并使蛋白质变性，在碱性条件下，破坏碱基配对，可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而彼此不分开。
当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。
细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来而质粒DNA则留在上清液中，乙醇沉淀后可得到质粒DNA。
如需进一步纯化，可应用聚乙二醇沉淀或氯化铯一溴化乙锭梯度平衡法。
环状双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：当其两条多核苷酸链均保持着完整的环行结构时，称之为共价闭合环状DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋SC 构型；如果两条多核苷酸中只有一条保持着完整的环形结构，另一条出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（oc DNA），此即OC构型；若质粒DNA经过适当的核酸内切限制制酶切割之后，发生双链断裂而形成线性分子（LDNA），通称L构型。
质粒DNA M r一般在106～107之间，常以kb表示（l kb双链DNA=6.6×105）,如质粒pUC19的M r为1.8×106(2.69kb)。
在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管M r相同，仍具有不同的电泳迁移率，其中走在最前沿的是scDNA，其后依次为LDNA和ocDNA。
二、实验材料与设备1、用品与仪器可调微量取样器（20 μl、l 000 μl），移液吸头，1.5 ml Eppendorf管，常用玻璃仪器，恒温空气摇床，台式高速离心机，旋涡振荡器。
实验材料：含pUC19质粒DNA的大肠杆菌。
2、试剂LB（Luria-Bertani）培养基：每升含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCI 10g，用10mol/LNaOH调pH至7.0。
高温高压灭菌。
溶液I：50mmol/L葡萄糖/25mmol/L Tris·HCl（pH8.0）/10 mmol/L EDTA(pH8.0), 高温高压灭菌(60895×104Pa)15min,贮存于4℃。
溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH/1％SDS（临用时配制，可不用灭菌）。
溶液Ⅲ：pH4.8乙酸钾溶液（60mL 5mol/L KAC，11.5mL冰醋酸，28.5mL H2O），钾离子浓度为3 mol/L，醋酸根离子浓度为5 mol/L。
高温高压灭菌。
V（酚）：V（氯仿）=1∶1：酚需在180℃重蒸，加入抗氧化剂8–羟基喹啉，终浓度为0.1﹪，并用Tris·HCI缓冲液平衡至pH＞7.6。
氯仿中加入异戊醇［V（氯仿）∶V （异戊醇）=24∶1］。
1×TE/RNaseA：10 mmol/L Tris·HCI，pH8.0/1mmol/L EDTA/20μg/mL RNaseA。
无水乙醇，70％乙醇，氨苄青霉素贮存液50 mg/ml。
三、实验操作程序1、细菌的生长与收获（1）将3~5 ml含氨苄青霉素（50 μg/m l）的LB加入到容量为15 ml、通气良好的长玻璃试管中，接入一单菌落，于37℃振荡（350 r/min）培养过夜。
（2）取1.5mL细菌培养物加入Eppendorf管中，以5 000r/min离心2min去掉上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。
2、碱裂解法提取质粒DNA（1）将细菌沉淀重悬于100 μl预冷的溶液Ⅰ中，充分分散混悬细菌。
（2）加入200 μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒数次，充分混合，要确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触，冰浴放置5min。
（3）加入150 μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒数次使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，冰浴放置5min。
（4）10 000 r/min离心5min，转移上清液到另一个Eppendorf管中。
（5）向上溶液加入等体积/酚/氯仿，振荡混匀，以10 000r/min离心2 min，转移上层水相至新的Eppendorf管中。
（6）向水溶液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置5 min，以10 000 r/min离心5min，倾去乙醇液，将离心管倒置于吸水纸上，吸干液体。
（7）加入1 ml 70％乙醇洗涤质粒DNA沉淀，按步骤（6）所述方法弃上清，于空气中或用电吹冷风使质粒DNA沉淀干燥。
（8）用20~30 μl含RNaseA酶（20 μg/m l）的TE溶解沉淀，4℃贮存备用。
3、讨论（1）．细胞的裂解作用是分离质粒DNA实验操作的关键步骤。
通常是加入溶菌酶或SDS来促使大肠杆菌细胞裂解的。
如果寄主细胞没有完全裂解，就会显著降低质粒DNA的回收率。
理想的状况是使每一个细胞都充分破裂到能使质粒DNA顺利溢出，而又没有污染过多的染色体分子。
（2）．提取过程中，除规定的实验条件外，应尽量保持低温，避免过酸过碱，操作中手法要温和，防止机械剪切，尽可能避免脱氧核糖核酸酶对质粒DNA的降解和破坏。
（3）．采用酚/氯仿去除蛋白的效果较单独使用酚或氯仿好。
一般来讲，要将蛋白质尽量除干净，需多次抽提一次，已能达到实验要求。
注意在吸取上层水相时勿吸入下层有机相混于其中。
（4）．乙醇沉淀质粒DNA是最常用的沉淀方法，通常采用冷乙醇（无水乙醇贮存于-20℃），沉淀条件为-20℃，1 h。
因本实验为微量快速，室温下数分钟DNA即可沉淀，虽然DNA量少，但纯度相对高（因为低温长时间杂质也一并沉淀下来），有利于以后的酶切及电泳结果。
沉淀方法也可用乙丙醇，只需0.54倍体积常温下即可将DNA完全沉淀出来，这对于大体积的质粒DNA沉淀十分有效。
但缺点是常将盐等亦同时沉淀出来，因此需要用70％乙醇很好地洗涤。
一般来讲广泛应用的沉淀试剂还是乙醇。
四、结果与分析：1、在提取过程中，溶液出现什么变化（混浊或澄清，是否分层）？有无沉淀产生？2、提出的质粒DNA是什么颜色？外观质量如何？3、实验操作过程中需要注意哪些问题才能得到质量较好的质粒DNA？实验二质粒DNA的酶切一、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类：Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。
Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。
Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：5'-G↓AATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5'-CCC↓GGG-3')；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端：5'…G↓AATTC…3' 5'… G AATTC…3'3'…CTTAA↑G …5' 3'… CTTAA G…5'DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。
采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。
酶切可以是单酶切也可以是双酶切。
单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。
具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星活力。
二、材料、试剂和仪器1 材料：质粒DNA2 试剂：限制性内切酶、ddH2O3 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅，电泳仪，紫外透射观测仪实验程序：取2只清洁、干燥、无菌的Eppendorf管，编号，按照限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ试剂盒说明书用量，用微量注射器加入各种试剂，最后用双蒸水补足至10μL，小心混匀。
37℃水浴保温1—2h，然后各小管内加入1μL的酶反应终止液，混匀，终止酶促反应，冰箱内保存备用。
操作前各试剂用量要反复核对，保证准确无误，所加试剂用量很少，必须认真操作。
I. .单酶切：（1）在一灭菌的1.5 ml 离心管中依次加入：质粒DNA 5 ulddH2O 3 ul10×buffer 1 ul限制性内切酶 1 ul（约10U）总体积10 ul（2）混匀，稍离心（3）37℃水浴1~3hr（4）70℃水浴10min，中止酶切反应（5）电泳检测酶切效果II. 双酶切：（1）在一灭菌的1.5 ml 离心管中依次加入：质粒DNA 5 ul（约1ug）ddH2O 3 ul10×buffer 1 ul限制性内切酶1 0.5 ul限制性内切酶2 0.5 ul总体积10 ul（2）混匀，稍离心（3）37℃水浴1~3hr（4）70℃水浴10min，中止酶切反应（5）电泳检测酶切效果注：酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA 或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1μg/10U;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4-5 hr，甚至过夜。
限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。
三、结果与分析假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果, 则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。
如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。
如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。
M1 1 2 3 4 5 6 M2图4 重组质粒HindIII+XbaI双酶切琼脂糖凝胶电泳分析：M1: λ DNA/ HindIII, M2: DL2000, 1 - 6: 重组质粒HindIII+XbaI. 重组质粒用HindIII+XbaI双酶切后释放出插入片断，因此空载体处于同一水平位置，而插入片断长度分别为0.8 ,2.1 ,1.6 ,1.2 ,0.7和0.3kb。