质粒DNA的小量制备

闭合环状的质粒DNA：
在变性后双链不分离、复性快。
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染色体线性DNA、有缺口的质粒DNA：
变性后双链分离、难以复性而形成缠绕结 构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起，离心时 沉淀。
强碱性
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本实验的目的
掌握质粒DNA提取的碱裂解方法。
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实验试剂
1）LB培养基：
10g/L 胰蛋白胨
5g/L 酵母提取物
7.加入500ul Buffer HB 去洗HiBind柱，室温，10000xg，1min离心。
8.加入700ul DNA Wash Buffer（已加入无水乙醇），室温，10000xg，1min离 心。 9.Repeat8 10.空柱，≥13000xg，2min离心。 11.室温晾柱1-2min，加入30ul-50ul Elution Buffer（注意要加到白膜上），将 柱子放到1.5ml离心管，≥10000xg，1min离心收集DNA。
出或取液不准。 2、要保证在整个吸液过程中，吸头尖端要一直处于
液面之下，即防止吸空造成吸样不准确。 3、吸取液体完成后排出液体之前，一定要擦去吸头 四周的液体，特别是在取液量较少时尤其要注意这
一点，但要防止接触吸头尖端。
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4、吸取液体和排出液体动作都一定要慢，因为动 作过快时，液体因表面张力吸附在吸头壁上，造 成移液不准。所取液体的粘度越高，越应该注意 这个问题。
器液面的近上方。轻轻压下按钮至第一停点位置，
让液体缓缓流出。待液体将流尽时，继续将按钮下
压至第二停点位置，并让吸头尖部轻轻接触液面上
方的容器壁，以免产生气泡。 5、继续按住按钮，撤出加样枪，将吸头弃于特定的 盛污染吸头的器皿中，松开按钮至起始位置，将加 样枪竖直悬挂在加样枪架上。
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注意事项：
1、加样前，一定要检查吸头是否上紧，以免液体漏
10g/L NaCl 用5N NaOH调pH至7.0，121℃高压灭菌20min。
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2）Amp贮存液：
用无菌H2O配置100mg/ml ，-20℃保存； 在LB中的终浓度为100 g/ml。
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3）TE： 10mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 1mmol/L EDTA
4）STE：
2、将按钮压至第一停点位置（有明显的阻滞感）并 保持，以挤出吸头内空气，形成吸头内负压。 3、将吸头浸入待移取的液体液面下2-3mm处，慢慢 松开按钮，液体在大气压的作用下进入吸头内。待 吸入要求量的液体后，将加样枪撤离液面，擦去吸 头外侧的液体，注意不能接触吸头尖部。
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4、将加样枪移至待加入液体的容器，让吸头位于容
多用各种商l含 100g/ml的 LB 中，
37℃振摇过夜。 2 ）取 1.5ml 培养物于 1.5ml Eppendorf 管中， 于4℃离心12000rpm1min，弃上清。 3 ） 将 细 菌 沉 淀 重 悬 于 0.5ml STE 中 ，
基因工程实验模块
一、质粒DNA的提取和鉴定
二、目的基因的获得和重组载体的构建
三、感受态细胞的制备、转化及重组子筛选 四、目的基因在E.coli中表达与SDS-PAGE鉴定
一、质粒DNA的提取和鉴定
实验一、质粒DNA的小量制备 实验二、质粒DNA的电泳鉴定 实验三、质粒DNA的酶切
背景知识复习
质粒(plasmid)的基本概念：
质粒的基本特征：
自主复制性
不相容性 可转移性 携带特殊的遗传标记
自主复制性：
质粒能利用寄主细胞的 DNA 复制系统， 进行自主复制。 根据在每个细胞中的分子数(拷贝数)多 寡，质粒可分为： 严紧型质粒
松弛型质粒
1）严紧型质粒(stringent plasmid)：
1-3拷贝/cell，复制受细胞核控制，伴 随染色体DNA复制而复制。
5、排出液体时，在液体将排尽时，要轻轻让吸头 尖端接触容器壁，以免在加样的容器中形成气泡。
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6、加样完成后，应在弃去使用过的吸头后，方 才松开按钮至起始位置，以免吸头内的残留液体 回吸到枪头，造成交叉污染。 7、注意使用一次性吸头，避免交叉污染。 8、如不使用，要把加样枪的量程调至最大值的
刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。。
12000rpm离心1min，弃上清。
4）将细菌沉淀重悬于100l 4℃预冷的溶液I中，
盖紧管口，vortex剧烈振荡，使细菌沉淀完全
分散，放置5-15min。 5 ） 加 200l 溶 液 II ， 盖 紧 管 口 ， 快 速 颠 倒
Eppendorf管5次，使管整个内表面均与溶液II
接触（不要振荡），冰上放置5-10min。
降解残留的RNA，以免提取后的DNA 中含有小分子RNA。
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7）TE缓冲液：
DNA保存液，由Tris-HCl和EDTA配制。 Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲
液或硼酸缓冲液），利于以后操作。
EDTA抑制DNase，防止DNA被酶降解。
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8）酚-氯仿-异戊醇
蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的 蛋白质，使蛋白质沉淀。 但苯酚会残留在DNA溶液中（现已少用，
1）是生物细胞内固有的、
能独立于染色体而自主复
制、并被稳定遗传的核酸
分子。
2 ）存在于细菌、真菌、 蓝藻、酵母等细胞中。
3）绝大多数质粒是DNA型的，但酵母的“杀伤 质粒”是RNA。 4）绝大多数的天然 DNA 质粒具 有共价、闭合、环状的双链结构 (covalently closed circular DNA, cccDNA)，以超螺旋形式存在。 5）分子大小：1-300 kb。
12 ）用含 RNase 的 TE 或 H2O 溶解 DNA ，贮存
于-20℃。
许多公司都研制出成套的商品化质粒
提取试剂盒，原理大都依照碱裂解法，但
在纯化步骤上采用柱层析，实验步骤参考 相应的Protocol。
微量加样器的使用方法
1、将加样枪刻度或读数调至所需定量吸取的液体量
值，并装上合适的吸头。
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2）EDTA
Mg2+ 、 Ca2+ 螯合剂，抑制 DNase 活性， 防止DNA被降解。
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3）NaOH-SDS
NaOH是强碱，提供pH>12的碱性条件， 使DNA双链变性。 SDS是离子型表面活性剂，溶解细胞膜蛋
白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白质-SDS”复
合物，使蛋白质（包括DNase）变性沉淀。
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4）NaAc-HAc缓冲液
用来中和NaOH变性液，使DNA复性。 高 浓 度 的 NaAc 有 利 于 变 性 的 大 分 子
（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。
5）乙醇
用于沉淀DNA。
DNA 分子以水合状态“溶于”水里，乙
醇能夺去DNA分子的水环境。 一般使用2倍体积的无水乙醇。
6）RNaseA
0.2 mol/L NaOH 1% SDS
注意：配0.2mol/L NaOH时，临用前用 10mol/L贮存液现用现稀释。
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7）溶液 III： 5mol/L NaAc 冰HAc H2O 60ml 11.5ml 28.5ml
pH为4.8，4℃保存。
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8）25:24:1 酚:氯仿:异戊醇 9）氯仿 10）无水乙醇
10mmol/L Tris-HCl（pH8.0）
1mmol/L
0.1mol/L
EDTA （pH8.0）
NaCl
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5）溶液 I：
50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 10mmol/L EDTA（pH8.0） 121℃高压灭菌20min，4℃保存。
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6）溶液 II：
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实验报告的内容
一、实验目的及要求
二、实验设备及要求 三、实验内容与步骤
四、实验结果与数据处理
五、分析与讨论
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提质粒步骤 1.室温10000xg 1min 离心收集菌体 2.加入250ul SolutionI/RNase A 充分重悬菌体 3.加入250ul SolutionⅡ并轻柔颠倒混匀多次直到液体清亮。2min室温孵育。 4.加入350ul SolutionⅢ并颠倒离心管多次使充分混匀，直到有白色絮状沉淀产 生。 5.室温，≥13000xg，15min离心 6.小心吸取上清到HiBind柱中（每次700ul），室温，10000xg，1min离心，直 到所有上清都过了柱
15000rpm2min，将上清转移至另一 EP管中。
10）加入2倍体积无水乙醇，振荡混匀，室温 放置 5min （或 -70℃放置 30min ）， 4℃离心 15000rpm10min，小心吸去上清，将附于管 壁的液滴除尽。
11 ）用 4℃预冷的 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀 1-2 遍，按上述方法除尽上清，37℃干燥5-10min。
11）70% 乙醇
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10）RNase： 10mmol/L Tris-HCl（pH7.5） 15mmol/L NaCl
10mg/ml
RNase
11）质粒贮存液： 含20g/ml RNase的TE或H2O
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各种试剂的作用： 1）葡萄糖
增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA
受机械力的作用而降解（震荡）。
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如：pSC101、p15A。
2）松弛型质粒(relaxed plasmid)：
10-200拷贝/cell，复制不受细胞核控制， 染色体DNA复制停止时，仍可进行复制。 加入氯霉素（终浓度 10-170g/ml）抑制
细菌蛋白质合成后，可达3000拷贝/cell 。
如：pMB1、ColE1。
质粒DNA的提取方法：
6）加入150l 4℃预冷的溶液III，盖紧管口， 温和振荡10sec，冰上放置5min。 7 ） 4℃离心 15000rpm5min ，将上清转移至