实验七、质粒DNA的小量制备
质粒DNA制备
另外，HB101及其它含有endA+基因型 的菌株表达中的核酸内切酶A，在煮沸 时不能完全失活， 在以后操作中， 只要有Mg2+存在(如内切酶反应缓冲液)， 核酸内切酶A就可将质粒DNA降解，而 影响实验结果。
若一定要用煮沸法提取这类菌株的质粒 DNA，不管是大量还是小量制备，必须 用酚、氯仿反复抽提几次．以去除该 酶．
半乳糖苷酶
X-gal
X + gal
无色
蓝色产物 半乳糖
若在含有X-gal的培养剂中，在乳糖操纵 子(lac operon)诱导物异丙硫半乳糖苷 (isopropylthiogalactoside，IPTG)的作 用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解X—gal， 此菌落成为蓝色。
若lacZ基因被外源DNA片断插入而破坏， 则不能制造半乳糖苷酶，菌落为白斑。
6. 限制性内切酶单一切口
在质粒复制子以外的部位具有一种或多 种限制性内切酶的单一切口，便于外源 基因的插入。
若这种单一的限制性内切酶位点处于选 择标记基因的内部，外源基因片断插入 后会导致该基因失活便于筛选。
三、常用质粒载体
1. pBR322
pBR322是一种使用最广泛的质粒，全长 为4 363bp，由3种野生型质粒成分组成， ampr基因来自pRSF2124，tetr来自pSCl01， 复制起始点来自pM9。核苷酸的序次号， 以EcoRI序列GAATTC的第一个T为第一个核 苷酸。
在一些细胞中，一种质粒处于优势，而在 另一些细胞中，与之不相容的另一种质粒 却占尽上风。细菌生长几代之后，占少数 的质粒将会丧失殆尽，在原始细胞的后代 中可含有两种质粒中的任意一种，但不会 兼而有之。
通过检查不同质粒在同一细胞中共存的能 力，可以把它们分为若干不相容组。带有 相同复制子的质粒属于同一不相容组，而 带有不可互换成分的复制子的质粒则属于 不同的不相容组。现已发现30多个这样的 不相容组。
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告
一、实验名称：质粒DNA的提取与纯化，DNA琼脂糖凝胶电泳二、实验原理：1.质粒DNA的提取：质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子，能够自主复制和稳定遗传，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆载体。
除质粒外，大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质，因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。
分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验使用碱裂解法，即利用SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。
（1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA，达到分离提纯质粒DNA的目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，线性的DNA因氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕，不会完全分离。
当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性，恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中；而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。
与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。
进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质，然后用无水乙醇沉淀，即可获得纯化的质粒DNA。
SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。
（2）四种溶液作用及原理：①Solution I的作用：悬浮大肠杆菌菌体，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。
实验十三 碱变性法小量制备质粒DNA
食品科学系 徐文生
实验一 小量制备质粒DNA
一．实验目的及背景
质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb 到200kb。
大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合 环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细 菌内的共生型遗传因子。
其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制 和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。
1、 DNA的分子大小 2、 琼脂糖浓度 3、 DNA分子的构象 4、 电源电压 5、嵌入染料的存在 6、 离子强度影响
DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带
实验注意事项
1. EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套， 并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或 物品必须经专门处理后才能清洗。沾染了EB的垃圾要专门 处理后才可丢弃。
2ul (终浓度为
MgCl2
6ul
(终浓度为1.5mmol／L)
引物1
1ul
(终浓度为50pmmol／L )
引物2
1ul
(终浓度为50pmmol／L )
模板DNA
1ul
2)100℃加热反应混合液10分钟，冰浴5′，使DNA完全变性。
3)将1ulTaqDNA聚合酶(5单位/ul)，加入反应混合液中。
4)用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加 热-冷却的过程中蒸发。
将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体 DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋 白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍 为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染 色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用 酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
实验试剂
ＬＢ培养基：
质 粒 提 取 原理及步骤
质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。
2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
质粒DNA的提取及检测实验报告
题目：质粒DNA的提取及检测一．实验目的:1.学习碱裂解法提取质粒的原理和方法；2.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。
二．实验原理1. 质粒 (Plasmid)：一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性，产生抗生素、限制酶、修饰酶等。
2.载体(Vector)：要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，转化到细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体。
目前除了大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。
3.分离质粒DNA：（1）培养细菌使质粒扩增；（2）收集和碱裂解细菌；（3）分离和纯化质粒DNA。
4.碱裂解法（1）溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl (pH8.0)作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解（2）溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH，2% SDS，临用前1：1配制作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性（3）溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml，冰醋酸11.5ml，双蒸水28.5ml作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。
大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。
5.电泳带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。
DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。
DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。
因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。
6.提取质粒在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳一、前言质粒质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。
大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。
然而，1984年，在Streptomyces coelicoler(天蓝色链霉菌)等放线菌以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质粒。
天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。
质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。
质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可能。
有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒)。
有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。
一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。
它是基因工程最常见的运载体。
质粒在细胞的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞只含有一个或几个质粒分子，如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。
细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。
质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。
质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。
分子生物学实验指导
北京化工大学分子生物学实验指导实验一 少量质粒DNA的制备一、实验目的（1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。
（2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。
（3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。
二、实验原理质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。
质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。
从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。
根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。
目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。
在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。
质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。
严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。
每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。
松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。
该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。
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实验七、质粒DNA的小量制备
一、实验目的
用碱性裂解法从大肠杆菌中分离质粒DNA。
二、实验原理
分离质粒DNA需要去除的：大肠杆菌染色体DNA、蛋白质、 RNA 碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
该方法是在EDTA、（溶菌酶）和表面活性剂的存在下，经碱处理溶菌。
同时在pH高达12.0-12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。
当以pH4.8的KAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA、不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
降解的小分子RNA可通过Rnase A处理去除，未除净的蛋白质可通过苯酚/氯仿抽提除去。
三、实验材料
LB液体培养基、氨苄青霉素、RNase A 、预冷无水乙醇、70%乙醇、TE缓冲液
溶液Ⅰ（细菌重悬液）：50mM Tris-HCl、10mM EDTA、pH 7.5
溶液Ⅱ(细菌裂解液)：0.4M NaOH、2% SDS
溶液Ⅲ：1.32M KAc、pH 4.8 (用醋酸调)
四、实验具体步骤
1、挑取转化平板上的单菌落至2ml LB培养液中（含Amp 100μg/ml），37℃，250rpm，培养过夜。
2、取1.5ml培养物至指形管中，12,000rpm，30s。
3、吸去上清，使沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于200μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。
5、加200μl溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管口，轻柔颠倒5次以混匀内容物。
冰上放置不超过5min。
6、加入200μl溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，温和振荡，冰上放置3-5min。
7、4℃，12,000rpm，5min，将上清转移至另一离心管中。
8、重复步骤7。
9、加入等体积酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃， 12,000rpm ，2min，将上清转移到另一离心管中。
10、加入2倍体积的无水乙醇，室温静置2min。
11、4℃，12,000rpm，5min。
12、弃上清，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。
13、用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，弃上清，吸干，37℃干燥10min。
14、加入20μl RSW缓冲液（含20μg/ml RNase A ，不含DNA酶），使DNA完全溶解。
15、37℃，保温20min，消化RNA，取出置-20℃保存。
五、实验结果与分析
通过凝胶电泳检测抽提的质粒浓度及纯度。
根据迁移率，跑的最快的为共价闭合DNA，其次是线性DNA，最慢的是开环DNA。
对比一下，DNA大多集中于共价闭合DNA中，说明制得的产物以共价闭合DNA为主，其中也含有开环DNA，但量较少。
六、思考题
问：溶液I、溶液II和溶液III在提取质粒的过程中的作用分别是什么？
溶液I：重悬菌体，提供缓冲环境。
溶液II：氢氧化钠和SDS裂解菌体细胞壁、在细胞膜上穿孔，释放细胞内的质粒。
溶液III：中和氢氧化钠、SDS中的钠被钾替换，吸附菌体产生沉淀。