稀释平板计数法
稀释平板计数法
检测方法------稀释平板计数法一、原理稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。
计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。
经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。
二、器材1．活材料：菌剂。
2．培养基：酵母浸粉0.5%、蛋白胨1%、氯化钠1%、琼脂18%、PH7.0-7.2。
3．器材：90ml无菌水、99ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管（或移液枪）、天平、称样瓶、记号笔等。
三、实验方法1．样品稀释液的制备准确吸取待测样品l0ml（粉剂称取1g），放入装有90ml（粉剂99ml）无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，置摇床上振荡60 min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管（或移液枪），吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，震荡60秒，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管(或枪头)吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也震荡器上震荡60秒，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液。
通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10-8稀释度，测粉剂取10-9。
2．平板接种培养利用混合平板培养法用无菌吸管按无菌操作要求分别吸取稀释液1ml 放入4个无菌平板中，然后分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基，轻轻晃动动平板30秒，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，以无菌水做空白对照，按相同方法操作，37℃培养。
稀释涂布平板法计数公式
稀释涂布平板法计数公式
稀释涂布平板法
操作过程：
稀释操作：
1、将分别盛有9ml水的6支试管灭菌,并按10^1到10^6的顺序进行编号
2、用移液试管吸取1ml培养的菌夜,注入10^1倍稀释的试管中.用手指轻压移夜管上的橡皮,
吹吸三次,使菌液与水充分混匀.
3、从10^1倍稀释的试管中吸取1ml稀释液,注入10^2倍稀释的试管中,重复第二步的混匀
操作.以此类推,直到完成最后一支试管的稀释.
涂布操作：
1、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中.
2、取少量菌夜（不超过0.1ml）滴加到培养基表面.
3、将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃,待酒精燃尽后,冷却8~10s.
4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面,涂布时可转动培养皿,使菌液分布均匀.
计算公式：
菌体数量cfu/g（mL）土样=同一稀释度重复的菌落平均数×稀释倍数。
浇注平板法稀释过程
浇注平板法稀释过程
浇注平板法是一种在微生物学中常用的菌落计数和分离技术，通常用于稀释样品并测定其中微生物的数量。
以下是使用浇注平板法进行稀释过程的步骤：
1.样品准备：首先，准备好待测的微生物样品，这可能是一个已知含有微
生物的液体或固体样品。
2.系列稀释：
1)在无菌条件下，取一定量的原始样品放入一个无菌试管中，标记为
10^0。
2)接下来，通过吸取不同体积（如0.1ml或1ml）的10^0浓度样
品，加入到含有一定体积（如9ml或9.9ml）无菌培养基（LB、TSB
等）的试管中，充分混合，制作成10^-1倍稀释液。
3)以此类推，继续吸取1ml（或预先设定好的体积）上一步得到的稀释
液至新的含无菌培养基的试管中，制成10^-2、10^-3等更高倍数
的稀释液。
3.浇注平板：
1)对每个稀释度的样品，取定量（一般为0.1ml）均匀地浇注到已灭菌
并冷却至45-50℃左右的琼脂平板上。
2)使用无菌L形棒轻轻转动平板，使样品与琼脂充分混匀，并在整个平
板表面形成一层均匀的薄层。
3)将浇注好的平板倒置放置于恒温箱中，在适宜的温度下（比如
37℃）培养一段时间（通常24-48小时），以利于微生物生长形成
可见的菌落。
4.菌落计数：
1)待平板上的菌落清晰可辨后，取出平板观察并计数各个稀释度平板上
的菌落数目。
2)选择菌落数在30-300之间的平板作为有效计数范围，根据稀释度计
算出原始样品中的微生物浓度。
以上就是浇注平板法进行稀释及菌落计数的基本流程。
通过这种方法，可以得到样品中微生物的浓度，以及对微生物进行纯化和分离。
第二周稀释平板计数法
3
平均
1克样品总菌落数
• 样品稀释液的制备用手或置摇床上充分振 荡，使微生物细胞分散
二、操作步骤
（1）土壤稀释液的制备：按“稀释平板测数 法” 进行，按无菌操作法将土壤稀释至107即可。
（2）平板接种培养（混菌法）： 吸10-４，10-５，10-６，10-７土壤悬液1ML 到灭菌平板内，再倒入冷却至50 ℃培养基。
平板接种培养
• （1）混合平板培养法 • （2）涂抹平板计数法
下一周做
（3）倒放置培养箱中培养，28oC培养 3~4天后，在有混浊半透明的胶状菌落 出现，有的在后期会产生褐色的色素。
（４）观察菌落形态及计数
稀释平板计数法
• 将实验结果填入下表
稀释度 菌落数
10-3
10-5
1
2
3
平均 1
2
3
平均 1
2
细菌数量大于放线菌，真菌量最少
稀释平板计数法 对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。 优点：传统计数方法。对设备要求不高。活菌计数
10-3
10-4
10-5
10-6
• 微生物得稀释平板记数使根据在固体培养 基上所形成得一个菌落，即是由一个单细 胞繁殖而成，且肉眼可见得子细胞群体这 一生理及培养特征进行得。
无菌操作三要点
静 使无菌操作室空气流动尽可降低
关好门窗, 避免空气流动过快; 不宜四处走动; 操作者不讲话,他人也不要在操作处讲话.
快 操作熟炼, 动作快速, 使接种器具暴露在
空气中的时间缩短.
轻 打开或盖上瓶口的动作要轻;
接种操作动作要轻.
从土壤中分离自生固氮菌
• 一、实验原理 微生物常以群落状态存在，这种群落往往 是不同种类微生物的混合体。研究某种微 生物的特性或者要大量培养和使用某种微 生物，必须从这些混杂的微生物群落中获 得纯培养，这种获得纯培养的方法称为微 生物的分离与纯化。
稀释培养和稀释平板测数法
稀释培养和稀释平板测数法稀释培养测数法一、实验目的通过对好气性自生固氮菌的计数，了解稀释培养计数（MPN）的原理和方法。
二、实验原理最大或然数(most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。
其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。
本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。
见附表23-1）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。
MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如lm1）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。
根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。
具体地说，菌液经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3—5次重复接种于适宜的液体培养基中。
培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表（见附录九）上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。
如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；稀释度 lO-3 10-4 10-5 lO-6 10-7 10-8重复数 5 5 5 5 5 5出现生长的管数 5 5 5 4 1 0根据以上结果，在接种lO-3—10-5稀释液的试管中5个重复都有生长，在接种lO-6稀释液的试管中有4个重复生长，在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长，而接种10-8稀释液的试管全无生长。
由此可得出其数量指标为“541”，查最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数的稀释倍数（10-5的稀释倍数为100 000）。
稀释涂布平板法计数公式
显微镜计数法即血球计数法，事先把菌液稀释到一定的倍数，然后通过血球计数板在显微镜下计数。
此法计数比较精准。
活菌计数法是将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.2ml放入无菌平皿，再倒入适量的已熔化并冷至45℃左右的培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放入适宜温度的培养箱或温室培养，长出菌落后，计数，按下面公式计算出原菌液的含菌数：每毫升原菌液活菌数=同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数×稀释倍数×5稀释涂布平板法是一种粗略的活菌计数法，即通过一定的稀释倍数，涂布到平板上，在适宜的条件下培养后，观察活菌数。
平板划线法是用来分离单菌落的一种方法，不是计数的方法。
如果只有一个稀释度的平均菌落数符合30~300这个范围
则以该稀释度平均菌落数除以涂布平板所用稀释液体积(0.1mL)，乘以稀释倍数作为该样品的细菌总数
如果有两个稀释度的平均菌落数符合要求
则按照两者菌落总数之比来决定
如果小于2，取两者的平均值
如果大于2，取较小的菌落总数
本题的46*10^3与295*10^2的比之为1.6
应取两者的平均值
（46*10^3+295*10^2)/0.1/2=3.775*10^5
相当于统计学里面的比较差异，
如果多比少大于2倍，则梯度浓度差异是10倍的情况下，其菌落是有很多重叠或者链接在一起的，这样就无法计算清楚是否为单菌落了，所以只有选择较小的菌落数。
来保证以上要求。
稀释平板计数法
实验原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。
实验器材LB液体、固体培养基1m1移液器，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。
实验步骤1．无菌器材的准备(1) 无菌培养皿：取培养皿9套，包扎、灭菌。
(2) 无菌水：取6支试管，分别装入4.5m1蒸馏水，加棉塞，灭菌。
2．样品稀释液的制备(1) 编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。
另取6支盛有4.5m1无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
(2) 稀释用1m1移液器吸取0.5m1己充分混匀的菌悬液(待测样品)，至10-1的试管中，此即为10倍稀释。
将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。
用1m1移液器在10-1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。
吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面。
混匀后吸取至10-2试管中，此即为100倍稀释。
……其余依次类推，整个过程如图所示。
3．平板接种培养平板接种培养有浇注平板培养法和涂布平板培养法两种方法。
稀释平板计数法的原理和方法
稀释平板计数法的原理和方法
嘿，朋友们，今儿咱们来聊聊那个“稀释平板计数法”是咋个回事儿。
这个啊，咱们四川人儿叫“平板计数法”，陕西的朋友可能直接就说“计数法”，而北京的哥们儿估计会叫得更正式些。
但不管咋叫，这法儿都是用来计算微生物数量的。
咱们先从原理说起。
这个“稀释平板计数法”的原理啊，就像咱们四川人做泡菜一样，得掌握好比例和条件。
简单来说，就是把微生物样本进行一系列稀释，然后分别涂布在培养基平板上，让微生物在适宜的条件下生长。
长得好的那些菌落，咱们就能数出来，从而推算出原样本中微生物的数量。
再来说说方法。
首先呢，得准备好培养基平板，这就像是咱们陕西人准备面团一样，得精心调配。
然后，把微生物样本进行稀释，这一步很关键，得稀释到合适的程度，才能让微生物在平板上分散开，长成单个菌落。
接着，就是把稀释后的样本涂布在平板上了，这个得涂得均匀，不能厚此薄彼。
最后，就是放在培养箱里培养，等微生物长出来，咱们就能数菌落了。
这法儿虽然看起来简单，但实际操作起来还是有不少讲究的。
比如稀释的倍数、培养的条件、计数的方法等等，都得根据具体情况来调整。
就像咱们北京人说的，“做事儿得讲究个精细”，这“稀释平板计数法”也是这么回事儿。
总之啊，这个“稀释平板计数法”是个挺实用的方法，能帮咱们了解微生物的数量和分布情况。
不管是四川的、陕西的还是北京的，咱们都得好好掌握这个方法，才能更好地研究微生物、保护咱们的健康和环境。
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稀释平板计数操作方法
实验原理
平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。
实验器材
LB液体、固体培养基
1m1移液器，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。
实验步骤
1．无菌器材的准备
(1) 无菌培养皿：取培养皿9套，包扎、灭菌。
(2) 无菌水：取6支试管，分别装入4.5m1蒸馏水，加棉塞，灭菌。
2．样品稀释液的制备
(1) 编号
取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。
另取6支盛有4.5m1无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
(2) 稀释
用1m1移液器吸取0.5m1己充分混匀的菌悬液(待测样品)，至10-1的试管中，此即为10倍稀释。
将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。
用1m1移液器在10-1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。
吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面。
混匀后吸取0.5ml至10-2试管中，此即为100倍稀释。
……其余依次类推，整个过程如图所示。
3．平板接种培养
平板接种培养有浇注平板培养法和涂布平板培养法两种方法。
(1) 浇注平板培养法
1) 取样
用三支1ml无菌吸管分别吸取10-4、10-5、和10-6的稀释菌悬液各1ml，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2ml。
不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。
2) 倒平板
尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒人融化后冷却至45℃左右的培养基约15毫升／平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。
待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。
由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并己冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。
(2) 涂布平板计数法：
平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。
二者操作基本相同，所不同的是后者先将培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20—30 min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置于的恒温箱中培养24—48h。
涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml较为适宜，如果过少，菌液不易涂布开；过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。
实验结果
将培养后菌落计数结果填入下表：
稀释度
10-410-510-6
1 2 3 平均 1 2 3 平均 1 2 3 平均
cfu数/平板
每ml中的
cfu数
计数和报告
1．操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。
可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。
2．到达规定培养时间，应立即计数。
如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。
3．计数时应选取菌落数在30~300之间的平板，若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。
4．若所有稀释度均不在计数区间。
如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。
如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。
有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。
5．不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接
近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。
如出现逆反现象，则应视为检验中的差错，不应作为检样计数报告的依据。
6．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。
如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。
7．当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。
再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。
8．菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。
固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm）报告。
每毫升中菌落形成单位(cfu)＝同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5。