药敏试验程序及步骤
药敏试验实验报告
药敏试验实验报告药敏试验实验报告一、实验目的了解不同药物对细菌的敏感性，为临床选择合适的药物提供参考依据。
二、实验材料及方法1. 实验材料：试验细菌、各种抗生素药品、琼脂培养基、平板培养基、培养皿、试管等。
2. 实验方法：(1) 细菌培养：取一根无菌的接种棒，沾取细菌液悬浊液，在琼脂平板上划线接种。
(2) 药物敏感性试验：将各种抗生素药品通过滴定法或漏斗法加入琼脂平板培养基中制成不同浓度的培养基，然后滴加在含有细菌的琼脂平板上。
(3) 实验观察：观察不同抗生素对细菌的抑制情况，通过测定菌落直径，判断细菌对该药物的敏感性。
三、实验结果及分析根据实验结果，我们发现不同细菌对不同抗生素药物表现出不同的敏感性。
对于某些细菌，某种抗生素可能具有很好的抑制效果，而对于另一些细菌则无效。
这表明细菌的敏感性是多种因素相互作用的结果。
四、实验总结通过本次药敏试验，我们获得了一些细菌对不同抗生素药物的敏感性信息。
在临床应用中，我们可以根据该信息选择合适的抗生素进行治疗，提高治疗效果。
实验中发现不同细菌对不同抗生素的敏感性差异很大，这与细菌的生物特性、遗传变异、环境因素等有关。
因此，在临床应用中，我们应该充分了解细菌的敏感性情况，并结合患者的具体情况，选择适合的抗生素进行治疗。
需要注意的是，药敏试验结果只是一种参考，我们不能单纯地根据结果选择抗生素。
在实际应用中，我们还需要综合考虑患者的病情、用药历史、并发症等因素，综合评估选择合适的抗生素方案。
继续深入研究细菌对抗生素的敏感性是必要的，只有通过进一步的研究，我们才能更好地了解细菌的抗药性机制，指导合理使用抗生素，避免抗生素滥用导致的抗药性问题。
五、参考文献1. XXX，XXX，XXX. 药敏试验在临床中的应用和意义[J]. 中国抗生素杂志，2020，35(4).2. XXX，XXX，XXX. 不同细菌对抗生素的敏感性研究进展[J]. 临床药学杂志，2019，15(2).。
药敏试验操作方法
药敏试验操作方法
药敏试验操作方法一般包括以下步骤：
1. 菌株选取：选择适当的病原菌株进行测试，一般使用已知药敏性的参比菌株作为对照。
2. 菌液的制备：将菌株接种到培养基上培养，培养至菌量合适后，采用生理盐水调制成适宜浓度的菌悬液。
3. 菌液的稀释：取一定数量的菌悬液，根据草浆法或直接法进行适当稀释，使菌量达到目标细菌的浓度，一般为0.5-2×10^8个CFU/mL。
4. 抗生素的制备：按照制备好的抗生素试纸或试剂盒的说明，将抗生素溶液或药片溶解成合适浓度的抗生素溶液。
5. 稀释菌液的扩散：将已制备好的菌液均匀涂布在含有良好的抗生素稀释浓度梯度的培养基上。
6. 培养基的培养：将涂布了菌液的培养基在合适的温度（通常为35-37）下培养约16-20小时。
7. 结果的解读：通过观察培养基上微生物的生长情况，判断细菌对抗生素的敏
感性。
一般，对抗生素敏感细菌培养后，会在培养基上形成清晰的抑菌圈，直径会随着对菌体敏感程度的增加而扩大。
8. 数据记录和分析：记录抗生素的名称、浓度、菌株信息、抗菌圈直径等数据，并进行统计和分析。
需要注意的是，药敏试验的具体操作方法可能会因实验目的、试验样本、试剂等因素而有所不同，因此在进行药敏试验前应详细阅读试剂盒或试纸的使用说明，并按照说明书操作。
药敏试验实验报告定量
药敏试验实验报告定量引言药敏试验是用来测试不同细菌对不同药物的敏感性的一种常见方法。
药敏试验可以帮助医生选择最适合患者的抗生素治疗方案，从而提高治疗效果。
本实验旨在了解药敏试验的原理，以及通过药敏试验来确定药物的最小抑菌浓度(MIC)和最小细菌杀灭浓度(MBC)。
材料与方法实验材料- 不同药物的抗生素片剂- 丁氏琼脂平板- 数量相同的细菌培养物- 滴定架- 移液枪- 特定体积的加样针管实验步骤1. 将丁氏琼脂平板均匀铺平在实验台上。
2. 取一定体积的细菌培养物，将其均匀涂抹在丁氏琼脂平板上。
3. 将不同的抗生素片剂按一定浓度顺序放入一列小孔中，并按要求标记。
4. 将实验室培养的细菌可生长落入称量瓶中，根据实验需要取一定体积的细菌培养物。
5. 将从选择培养物中取出的细菌盘均匀涂抹于琼脂平板上。
6. 将标有抗生素的纸片粘贴到琼脂平板上。
7. 按照抗生素的浓度梯度顺序涂于琼脂平板上。
8. 将涂有细菌的琼脂平板放入孵化器在适当的温度下孵育一段时间。
9. 观察细菌在不同抗生素浓度下的生长情况。
数据处理和分析1. 根据观察结果，确定细菌对不同抗生素的敏感性。
2. 计算最小抑菌浓度(MIC)和最小细菌杀灭浓度(MBC)。
结果与讨论经过药敏试验，我们观察到不同细菌对不同抗生素的敏感性有所差异。
以细菌菌落的生长情况为判断标准，我们确定了细菌对各种抗生素的敏感性。
通过数据的分析，我们计算得到了每种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)和最小细菌杀灭浓度(MBC)。
这些数据对于医生在治疗患者时选择合适的抗生素非常关键。
药敏试验是一种非常有效的方法，可以快速准确地确定不同细菌对不同抗生素的敏感性。
根据药敏试验的结果，医生可以选择最佳的抗生素治疗方案，从而提高治疗效果。
不过，药敏试验的结果也可能受到实验条件、培养物等因素的影响，因此在进行药敏试验时需要严格控制实验条件，确保结果的准确性。
结论药敏试验是一种重要的方法，可以帮助医生选择最适合患者的抗生素治疗方案。
微生物实验 药物敏感实验
微生物药物敏感实验
⏹一、实验目的
⏹1、熟悉和掌握圆纸片扩散法检测细菌对抗菌药物敏感性的操作程序和结果判断方
法。
⏹2、了解药敏试验在实际生产中的重要意义
二、实验原理
⏹将含有定量抗菌药物的纸片（药敏纸片）贴在已接种待检菌的琼脂平板表面特定部
位。
药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散，形成了随着离纸片距离加大，琼脂中的药物浓度逐渐减少的梯度浓度。
其纸片周围一定区域琼脂内的药物浓度高于抑制待检菌所需浓度时，则该区域内细胞不能生长，形成透明抑制圈。
抑菌圈的大小可以反映待检对测定药物的敏感程度，抑菌圈愈大，说明该菌对此药物越敏感三、实验器材
⏹1．菌种大肠埃希菌。
⏹2．培养基牛肉膏蛋白胨培养基。
⏹3．试剂无菌生理盐水，抗菌药物纸片：
包括青霉素、氨苄西林、土霉素、链霉素等。
⏹4．其他无菌棉拭子、镊子、毫米尺、接种环。
四、实验方法和步骤
⏹1．菌液制备
菌浓合适，一般为106
⏹2．接种
细菌悬液制备后15min内接种至倒好的牛肉膏蛋白胨培养基平板中，接种量0.1-0.2mL。
涂布均匀。
⏹3．贴药敏纸片
⏹涂布后的平板在室温下干燥3~5min，用纸片分配器或无菌镊子将纸片贴于琼脂表面
并轻压，使纸片与琼脂表面完成接触。
各纸片中心相距应大于24mm，纸片贴上后就不能再移动位置。
⏹4．培养
⏹将平板倒置放入37℃培养箱培养，16~18h读取结果。
五、实验结果
六、思考题
⏹ 1.圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项？
⏹ 2. 试述药敏试验的意义。
药敏试验的原理
药敏试验的原理药敏试验原理药敏试验是一种用于确定细菌的抗生素敏感性的检测方法，主要用于指导临床上的抗菌治疗，以提高治疗效果和避免抗生素的滥用。
药敏试验的原理是通过将不同种类的抗生素与细菌进行反应，观察细菌的生长情况，来确定其对抗生素的敏感性或耐药性。
具体步骤包括以下几个方面：1. 培养细菌药敏试验前需要先从患者的样本中分离出目标细菌，并在培养基上进行培养，使其生长到所需的数量。
通常使用的培养基包括莫乃基、大肠杆菌平板以及血琼脂等。
2. 制备药物药敏试验所使用的药物通常是常见的抗生素，如青霉素、头孢菌素、氨基糖苷类等。
这些药物需要提前配置好，以确保其浓度的准确性和稳定性。
3. 稀释药物将药物稀释成不同的浓度，这些浓度范围从最小浓度开始，逐渐递增至最大浓度，通常会制备8个不同的浓度。
4. 加入细菌将药物加入到已经培养好的细菌中，让其在固定时间内进行吸收。
可以采用不同的方案，如将药物加到固定体积的培养基中，或是通过切开莫米德瓶，在其中加入药物溶液来进行。
5. 观察细菌的生长情况将稀释好的药物加入细菌中后，将其分配到不同的培养基上，通常使用微量进针或是延伸半硬质琼脂板法进行。
然后，将培养基放到恒温箱中进行培养，观察细菌的生长情况和形态。
6. 解读结果并进行分析根据细菌的生长情况来判断其对抗生素的敏感性或耐药性。
根据不同的药物浓度、细菌生长情况和形态，可以简单地确定细菌对药物的敏感性或耐药性。
药敏试验不仅可以指导临床上的抗菌治疗，而且可以在重要疾病爆发时，对于了解不同城市/城镇之间的细菌耐药率变化有帮助。
在药敏试验中，测定细菌对某种药物的敏感性或耐药性的方法有许多种，目前中国临床上主要采用两种常规药敏试验：纸片扩散法和微量进针法。
纸片扩散法纸片扩散法是一种常见的药敏试验方法，主要用于检测各种抗生素对细菌的敏感性。
该方法将已经稀释好的药物加在一个标准莫莫尼格琼脂板上，然后在细菌感染区域中放置一张含有药物的纸片，在培养室中孵化。
药敏试验纸片扩散法操作步骤
药敏试验纸片扩散法操作步骤
药敏试验纸片扩散法是一种常用的检测细菌对抗生素敏感性的方法，其操作步骤如下：
1. 准备培养基：根据需要选择合适的培养基，如Mueller-Hinton（MH）琼脂（常用于细菌药敏试验）。
按照制造商的
说明溶解固体培养基，并加入适当量的琼脂（通常为2%），
将其加热溶解，然后用无菌盘口装好。
2. 菌液制备：从培养基上的细菌菌落中接种一根病菌棒，将其浸入含有3-5毫升无菌盐水的试管中。
3. 菌液浓度调整：将试管中的细菌菌液用比例稀释至合适的浓度（通常为0.5麦克百尼尔/毫升）。
4. 纸片扩散：用无菌的棉签将稀释后的菌液均匀地涂抹在一块布拉格琼脂平板上，然后在琼脂上按要求摆放敏感纸片（一般为阿莫西林、头孢菌素等常用抗生素），注意要与纸片相距一定距离。
5. 培养：将布拉格琼脂平板反面朝上，用无菌培养皿盖好，然后放入恒温培养箱中进行孵育。
通常在35-37°C条件下培养
24小时。
6. 结果录入和解读：观察纸片周围的细菌生长情况，通过测量纸片周围形成的抑制圈直径来评估细菌对不同抗生素的敏感性。
根据抑制圈的直径大小，将细菌的敏感性分为敏感、中等和耐
药三个等级。
注意事项：
- 操作过程需要严格无菌，以免细菌的外源污染影响结果。
- 确保培养皿紧闭，避免细菌的空气传播。
- 操作前后要做好清洁，避免微生物交叉感染。
- 移栽过程要注意避光，避免紫外线对细胞的破坏。
药敏试验(扩散法)操作方法PPT课件
敏感（S）：表示该药物对细菌的MIC值低于常规剂量下的抗菌 药物血液浓 度或组织浓度4-8倍，可以用常规剂量治愈。
中介（I）：表示该药物对细菌的MIC值接近于常规剂量给药后的血药浓度 或组织药物浓度，细菌对该药的敏感性降低，但仍可用于生理性浓集部位的 感染或使用高剂量药物进行治疗（注：必须考虑高剂量的安全性）。
二、常用的药敏测定方法
1、扩散法：纸片法、牛津杯法、打孔法等。
纸片法 手工测试的方法，通过测试药物纸片在固体培养基 上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。目前临床上 广泛使用此法。定性
2、稀释法：琼脂稀释法、液体稀释法（试管、微量）
通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断 其最低抑菌浓度（MIC）。自动化仪器均采用液体稀释法为药敏 试验的方法。 定量
2、药片吸水量的测定 在上述药片用微量移液器进行滴 加蒸馏水，最可使药片完全浸透又不滴水为宜，最终计 算出每片药片的吸水量。一般常用直经6mm的定性滤纸 药片吸水量为0.01ml。
药液的制备（用于商品药的试验）：
按兽药说明书(或标签)上标明的治疗量的10-20倍比例配制药液。 如某药品：100g兑水100kg，表明该药治疗量为1ห้องสมุดไป่ตู้兑水1L，配制 药液时就是1g加50-100ml水或1L水加10-20g药品，即为配制药敏 片所用的药液浓度。
2、成药（复方成分） 多种联合 的抗菌药物制剂应以其成分中某种 含量最高的抗菌药物为标准稀释成 有效浓度。但多数厂家由于产品配 方机密，多按产品用量进行配制。 药敏片可由厂家提供，也可自制。
抗生素药敏试验标准操作程序
抗生素药敏试验标准操作程序1规范药敏试验操作方法，保证药敏试验结果的准确、可靠。
22.12.1.1 制备接种菌液：用接种环挑取已分纯菌落，悬浮于生理盐水中，震荡混匀后与标准比浊管比浊 (0.5McFarland)，以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管相同。
2.1.2 接种平板：制备好的接种液必须在15分钟内使用。
用灭菌的棉拭子蘸取菌液，在管壁上旋转挤压，去掉多余菌液，用拭子涂布整个培养基表面(三个方向，每次将平板旋转 60 度，最后沿平皿周边绕两圈，保证均匀)。
2.1.3 贴纸片：半开平板的盖子，约 3~5 分钟(不可超过 15 分钟)，用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表面，用镊尖压一下，使其贴平，纸片一旦贴下就不可再拿起，因纸片中的药物已扩散到琼脂中。
每张纸片间距不少于 24mm，纸片中心距平皿边缘不少于 15 mm，或用纸片分配器按压。
2.1.4 孵育： 35℃孵箱孵育 18-24 小时后，读取结果。
2.1.5 判定结果：培养后取出平板，测量抑菌环的直径，根据 CLSI 标准判读结果。
2.1.6 质控程序见《微生物室室内质控操作程序》。
2.22.2.1 将鉴定/药敏板放在加样盘上。
2.2.2 在鉴定/药敏板上标记标本信息。
2.2.3 将 broth 试管放置在加样盘上; ID broth 放在左边；AST broth 放在右边。
2.2.4 用 ID broth 配置 0.5 McFarland 菌悬液。
a) 使用无菌棉签挑取菌落至 ID broth；b) 混匀 5 seconds.等待 10 seconds 使气泡消失；c) 使用 PhoenixSpec TM 比浊仪调整菌液浓度 (以 0.45-0.55 McFarland 为佳)。
2.2.5 在 AST broth 中垂直滴加一滴 AST indicator solution。
2.2.6 从 ID broth 中转移25µl 菌悬液至 AST broth，颠倒混匀，请勿震荡。
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药敏试验程序及步骤微生物标本的采集通常有血液、脑脊液、尿液、伤口的脓液、胸水腹水、粪便、痰液及泌尿生殖系统的分泌物。
1）采集的一般原则：a早期采集b 无菌采集注意对局部及周围皮肤的消毒，渎道底部采集的标本（外通道）正常菌群寄生部位采集的标本应明确目的菌，采用选择培养基。
C 不同菌不同采集方法D 采集适量标本，量不应过少，注意采集不同时间不同部位标本，要全面有特征E 安全采集2）标本处理2h送到检验处，部分菌应保温于一定环境中保存注意安全尤其对烈性传染病。
有时可以直接用抽取标本的注射器如尸检组织、支气管洗液、心包液、痰、尿等标本要保存于4℃环境中，脑脊液保存于25℃3）各部位标本的采集及注意事项A 血液皮肤消毒采血部位采血量采血次数采血时间不同动物有所不同血液应马上送检室温保存不可冷藏。
配置的培养基血液和肉汤比为1：5～1：10血液中常见的病原体引起的疾病有葡萄球菌菌血症，肠球菌菌血症、革兰隐性杆菌、厌氧菌菌血症真菌血症。
B 脑脊液采集脑脊液一般用腰椎穿刺术获得。
采集后立即送检，一般不要超过1h，避免凝固和混入血液一般取3～5ml 35度保温送检不可至于冰箱保存做病毒检查时应放置冰块4度保存72h常见细菌性脑膜炎如流行性脑脊髓膜炎肺炎球菌脑膜炎，链球菌脑膜炎等真菌性脑膜炎常见隐球菌脑膜炎假丝酵母菌脑膜炎等特别是免疫功能低下和恶性疾病患者易并发。
如AIDS 恶性肿瘤严重糖尿病等流行性乙型脑炎是一种人兽共患病肠道病毒可见多种病毒引起脑膜炎和肺炎c 脓液标本的采集首先用无菌生理盐水清洗脓液及病灶的杂菌，在采集标本，用针和注射器抽吸采取，再移入无菌容器立即送检也可用拭子在伤口深部采集渗出物，对于皮肤或下表皮的散播性感染，应采集病灶出边缘而非中央处的感染组织送检。
脓肿标本以无菌注射器抽取为好，也可用排液法取得，先用70的酒精擦拭病灶部位，袋干燥后用以无菌刀切开排脓，以无菌拭子采取，不能及时送检可放冰箱冷藏，厌氧菌培养的标本只能放于室温下。
厌氧菌感染的脓液常有腐臭味，采集和运送要注意不要接触空气，可直接针筒送检或置于厌氧运送培养基送检。
外伤性创伤感染以葡萄球菌和链球菌多见，放线菌，结核分枝杆菌，大肠埃希菌，铜绿假单胞杆菌也常见。
深部感染极易引起破伤风和气性坏死感染。
烧伤创面最常见革兰阴性杆菌感染和革兰阳性球菌感染急性化脓性骨关节炎常由金黄色葡萄球菌感染溶血性链球菌肺炎链球菌感染所致慢性化脓性骨关节炎慢性骨髓炎常由结合分支杆菌感染所致。
放线菌感染可发生在免疫功能下降时或由于拔牙口腔粘膜损伤一起的感染。
d痰液标本的采集自然咳痰法和支气管镜采集法对呼吸道感染诊断有重要意义，细菌性肺炎为下呼吸道感染最常见的类型。
支原体肺炎常以不典型肺炎表现。
真菌性肺炎和病毒性肺炎也常见。
E 粪便标本的采集用药前自然排便采集脓血粘液部分2～3g，粪便表面采样，液体便取絮状物1～2ml置于无菌容器内送检。
细菌性痢疾细菌真菌病毒引起的胃肠炎细菌性食物中毒致病性大肠埃希菌的肠道感染幽门螺杆菌感染导致消化性溃疡，主要部位是十二指肠球部。
F 尿液标本采集采集清洁中段尿最好早晨取样，先清洗尿道口。
必要时导尿或膀胱穿刺留尿样本采集容器要求清洁无菌、密封、加盖、防渗透、广口、容积大于50ml。
主要主要经尿道口上行感染，极少数血道感染，可反映肾脏，膀胱，尿道，前列腺等处的炎症变化。
药敏试验用药敏实验进行药物敏感度的测定，以便准确有效的利用药物进行治疗。
但由于药敏试验要求比较严格，条件比较高。
目前，临床微生物实验室进行药敏试验的方法主要有纸片扩散法，稀释法（包括琼脂和肉汤稀释法），抗生素浓度梯度法（E-test法），和自动化仪器等。
一、纸片扩散法该法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。
同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，而抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关。
二、稀释法稀释法药敏试验可用于定量测试抗菌药物对某一细菌的体外活性，分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。
实验时，抗菌药物的浓度通常经过倍比稀释，能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最小抑菌浓度（MIC），一个特定抗菌药物的测试浓度范围应该包含能够检测细菌的解释性折点（敏感、中介和耐药）的浓度，同时也应该包含质控参考菌株的MIC.2.1 琼脂稀释法首先制备含抗菌药物的琼脂稀释平板。
再接种待测菌株，然后是结果判读。
2.2 肉汤稀释法三、抗生素浓度梯度法四、自动化仪器法实验步骤一、实验材料普通营养琼脂培养基：可去生化试剂店购买，做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基，如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦糠凯培养基。
做沙门氏菌可选择血清培养基。
药敏试纸：购买或自制（详见实验准备）细菌：待做药敏试验的细菌三、实验操作方法3.1药敏片法3.1.1在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。
具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。
然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。
3.1.2将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。
为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。
为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要记住。
3.1.3将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。
3.2牛津杯法3.2.1在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。
具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。
然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。
（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。
要求涂布均匀致密。
）3.2.2以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6nm、外径8nm、高10nm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，并在小管处标记各种药物名称。
每个平板可放4-6支小管。
待分钟后，分别向各小管中滴加一定数量的各种药液，勿使其外溢。
置37℃培养8-18小时，观察结果。
3.2.3将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。
3.3打孔法：该法较简单，成本低，易操作，比较适用于商品药物的检测。
3.3.1在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。
具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。
然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。
（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。
要求涂布均匀致密。
）3.3.2以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。
3.3.3加样：按不同药液加样，样品加至满而不溢为止。
3.3.4将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。
在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。
过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。
其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。
一、药敏实验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。
具体对于不同的菌株，及不同的抗生素纸片需参照NCCLs的标准或者CLSI标准。
二、药物敏感实验判定标准参考表1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上为高敏，6—9毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。
一、培养基：应根据试验菌的营养需要进行配制。
倾注平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。
培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。
二、细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。
三、药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。
商品药应严格按照其推荐治疗量配制。
四、培养时间：一般培养温度和时间为37℃8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2~4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。