4.金黄色葡萄球菌检查用培养基适用性检查验证方案
金黄色葡萄球菌检测培养基
金黄色葡萄球菌检测培养基Jvo SiegristAnalytiX第10卷第2篇金黄色葡萄球菌通常是我们皮肤菌群的一部分，但也是导致多种疾病的原因。
当前的研究报告表明，近年来，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的案例显著增加。
葡萄球菌可能是空气传播的，存在于动物和人类中，或污水、水、牛奶或食物中以及在环境表面或食物设备中。
它仍然是医院感染的五个最常见原因之一，通常会导致术后伤口感染。
因此，它在医院中引起了人们的极大关注，尤其是对于MRSA，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。
金黄色葡萄球菌是一种侵入性病原体，可以在人体的几乎任何组织或器官中引起疾病，主要是在受感染的个体中。
以前，葡萄球菌感染使用青霉素治疗，但是多年来，这种病原体通过构建青霉素酶而产生了对青霉素的抗性。
甲氧西林是下一代药物的选项，因为它不被青霉素酶裂解。
甲氧西林在治疗大多数葡萄球菌感染方面非常有效，但有些菌株通过产生青霉素结合蛋白而对甲氧西林产生了抗药性，无法再被这种抗生素杀死。
这些耐药细菌称为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）1。
因伤口，留置导管或烧伤导致皮肤破裂的患者极有可能发生MRSA感染2。
与MRSA感染者接触后，通过保持个人卫生可以在很大程度上控制MRSA感染的传播1。
如今，有许多创新的解决方案可以检测MRSA。
默克为微生物学家提供了选择性显色HiCrome MeReSa琼脂的大力支持，可用于从临床分离株和其他样品中检测MRSA。
培养基中掺入的专有显色混合物被金黄色葡萄球菌特异性切割，从而在该培养基上产生蓝绿色菌落，并且可以与其他物种明显区别开来。
通过添加甲氧西林使该培养基对MRSA具有选择性。
经常与葡萄球菌食物中毒相关的食物包括肉和蛋制品、牛奶和奶制品，以及可能包含这些食品成分的各种其他产品。
在食品工业中，保持在略高温度下的加工过程必须防止葡萄球菌性食物中毒，这是引起胃肠炎的主要原因之一。
食物中毒是由于食物中存在金黄色葡萄球菌产生的葡萄球菌肠毒素。
培养基适用性检查方法的验证.
培养基适用性检查方法的验证文件编号制订日期审核日期批准日期云南云科药业有限公司A：验证方案方案制订制订日期方案编号方案审核审核日期方案批准批准日期云南云科药业有限公司目录1．验证项目名称2．验证组织3．概述4．验证目的5．参照标准6．验证程序7．验证报告、评价及批准1．验证项目名称：培养基适用性检查方法的验证2．验证组织：姓名部门职务分工3．概述：通过验证以确认所采用的方法适合于培养基适用性检查。
根据培养基及菌的特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
若符合，按验证的方法和条件进行培养基适应性检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
4．验证目的：细菌、霉菌及酵母菌计数用培养基应进行培养基的适用性检查。
验证的目的是确认营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基适合细菌、霉菌及酵母菌数测定。
（确认所采用的方法适合于培养基适应性检查，为了保证检验结果的准确性，对现有的检验方法进行验证。
）5．参照标准：2010年版《中国药典》二部附录ⅪJ 计数培养基的适用性检查。
6.验证程序：6.1适用范围：适用于培养基适用性检查。
6.2被验证产品：营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基。
6.3试验材料：6.4试验菌株：6.5合格标准：被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致。
6.6验证方法：培养基在使用前应进行适用性的检查，通过对被检培养基上的菌落与对照培养基上的菌落比较，以确认所采用方法的可行性。
6.6.1菌液的制备：6.6.1.1 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于30～35℃培养18～24小时。
取上述营养肉汤新鲜培养物1ml加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5～10-7约为50～100cfu/ml的菌悬液备用。
金黄色葡萄球菌的分离培养试验
实验金黄色葡萄球菌的分离培养一．实验目的；1．掌握Baird-Parker培养基的配制方法2．掌握利用选择性培养基分离金黄色葡萄球菌的检验方法二．实验内容1原理；Baird-Parker培养基在含有氮源的基础上，补充了促进细菌生长的丙酮酸钠，又含有抑制剂：亚碲酸钾，故有较好的选择性。
但对于金葡萄球菌没有抑制，其能将亚碲酸钾还原为碲在菌落中心呈黑色，易于观察；加入卵黄，由于卵磷酯酶阳性特征，其菌落周围可出现明显的沉淀环。
利用选择性培养基进行常见致病菌的分离是致病菌检测中的重要部分。
2 仪器与试剂250ml三角瓶灭菌锅量筒Baird-Parker氏培养基、亚碲酸盐卵黄增菌液、7.5%氯化钠肉汤3操作步骤3.1 培养基配制Baird-Parker琼脂培养板：称取58克干粉，加热溶解于950ml蒸馏水中,分装每瓶95ml，121℃高压灭菌15分钟,冷至50℃左右,于每95 ml加入常温解冻的卵黄亚碲酸钾增菌剂5 ml，摇匀后倾入无菌平皿。
7.5%氯化钠肉汤（蛋白胨10g 牛肉膏5g 氯化钠75g蒸馏水1000mlph7.4）将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225 mL，121 ℃高压灭菌15 min。
3.2增菌及分离培养挑取金黄色葡萄球菌接种于7.5%NaCl肉汤培养基内，置于（37℃）恒温箱中培养6-8h.3.将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker 平板，于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h 或45 h～48 h。
3.3观察菌落形态4、结果判定根据菌落形态，鉴别检样中细菌种类三、实验结果实验金黄色葡萄球菌的染色镜检一．实验目的;掌握细菌革兰氏染色方法；在显微镜下观察金黄色葡萄球菌的形态。
二．实验内容1原理;革兰氏阳性菌经结晶紫染色乙醇脱色后，仍为紫色，而革兰氏阴性菌被复染为其他颜色。
2仪器与试剂；结晶紫染色液（结晶紫1g 95%乙醇20ml 1%草酸铵水溶液80ml将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
培养基适用性验证ppt课件
b．适用性检查：接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯 草芽孢杆菌各50-100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾 入营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备3个平皿，混匀， 凝固，置30~35℃培养48h，计数；取白色念珠菌、黑曲 霉各50-100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红 钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备3个平皿，混匀，凝 固，置23~28℃培养72h，计数。同时，用相应的对照培 养基替代被检培养基进行上述试验。
5）黑曲霉菌液的制备
接种黑曲霉的新鲜培养物于改良马丁培养基上, 30℃、 150\min培养2天
4.2 适用性检查 4.2.1 试验步骤 a．菌液制备：按稀释度10-5,10-6,10-7等依次类推稀释
菌悬液，接种培养后取50～100cfu计数。接种金黄色葡 萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营 养琼脂培养基上；至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35℃， 培养18~24小时；接种白色念株菌的新鲜培养物至改良马 丁培养基上25~28℃，培养24~48小时，上述培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数为50~100CFU的菌 悬液，备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂 斜面培养基上，23~28℃，培养5~7天，加入3-5ml0.9%无 菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用 管口带有薄的无菌棉花或纱布能通过滤菌丝的无菌巴氏 吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100cfu的孢子悬液。菌液制备后在室温2h 内使用，在2~8℃可再24h内使用。
结果判定：若被检培养基上得菌落平均数不小于对照培 养基上得菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养 基上得菌落一致，判改培养基的适用性检查符合规定。
新版GMP培养基适用性检查
新版GMP培养基适用性检查验证方案培养基适用性检查验证方案文件编号：VMP-VV-501-00起草人：审核人：批准人：批准日期：年月日验证立项申请表验证方案审批表1.概述通过验证以确认所采用的培养基适合于细菌、霉菌及酵母菌的测定及控制菌的检查，根据特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
若符合，按验证的方法和条件进行微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
2.验证目的及范围为了确认所采用细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查的培养基是否符合微生物限度检查法的规定要求，以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
3.验证风险评估对于本次验证的执行进行了如下的风险分析：4.验证前准备4.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。
培训人员记录见附件1。
4.2将所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
4.3仪器与器具：恒温培养箱、生化培养箱、高压蒸汽灭菌器、净化工作台、无菌培养皿、无菌移液管。
5.验证内容5.1测试环境条件要求所有检查在环境洁净度C级下的局部A级洁净度的单向流空气区域内隔离系统内进行，其全过程严格遵守无菌操作，能防止微生物污染。
5.2计数培养基5.2.1验证用菌种及培养基：5.2.1.1来源：食品药品检验所5.2.1.2菌落计数用菌种注：编号由菌种首字母-传代代数-配制日期组成。
5.2.2培养基及其制备方法：取市售的脱水培养基，分别按照规定方法进行配制后灌装于洁净的三角烧瓶中，然后加塞灭菌，在实验前加温熔化备用。
5.2.3菌液制备5.2.3.1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml，加0.9％无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml，做活菌计数备用。
微生物限度检查——培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验.
制作人：王丽娟 重庆医药高等专科学校
控制菌检查—— 培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验
提纲
一、控制菌种类 二、培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验 三、对照试验
一、控制菌种类
耐胆盐革兰阴性菌
白色念珠菌
大肠埃希菌
控制菌检查项目 梭菌 沙门菌
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
二、培养基的适用性检查与检查方法的适用性试验
1.控制菌检查用培养基的适用性检查 控制菌检查用培养基包括成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应进 行培养基的适用性检查，检查项目包括培养基的促生长、抑制能力和指示特性。
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
大肠埃希菌
乙型副伤寒沙门菌
白色念珠菌 生孢Fra bibliotek菌2.检查方法的适用性试验 检查方法及流程同“微生物计数法适用性检查” 所用阳性对照菌液不同 结果判断不同：控制菌检查用培养基制药检出阳性对照菌即可判为无抑菌性
三、对照试验
阳性对照试验 • • • 目的：检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜 操作：同供试品操作，仅加入了不超过100cfu的阳性对照菌 结果要求：应呈阳性 阴性对照试验 • • • 目的：检查操作环境、试验物品、操作技术是否无菌 操作：用稀释剂代替供试品，其余同供试品。 结果要求：应呈阴性
微生物计数培养基适用性检查验证方案
微生物计数培养基适用性检查验证方案
1、验证目的：
细菌、霉菌及酵母菌计数用培养基应进行培养基的适应性检查，本次验证的目的是为了确证营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基适合细菌、霉菌及酵母菌测定。
2、参照标准：《2010年版中国药典》
3、验证项目：营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基
4、验证所用培养基：
5、菌液制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基斜面上。
培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面，培养24小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液逐级稀释制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。
6、适用性检查
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50～100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，混匀，凝固，每株实验菌平行制备2个平皿，另1平皿不接种菌作为空白对照，置35℃培养48小时，计数；
取白色念珠菌50～100cfu，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固，每株实验菌平行制备2个平皿，另1平皿不接种菌作为空白对照，置25℃培养72小时，计数。
同时，用相应对照培养基替代被检培养基同步进行上述试验。
7、结果记录
备注：空白皿均未长菌
8、结果判定：若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平
均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的一致，判该培养基实用性检查符合规定。
9、结论：本次所检培养基上的菌落平均数对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的一致，该培养基适用性检查规定。
试验人复核者。
药典增补本 培养基适用性检查(限度)
菌种→沙氏葡萄糖琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂(20～25℃/5～7天)→加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱→吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
适用性检查
胰酪大豆胨琼脂
培养基适用性检查（限度）
菌悬液制备
金黄色葡萄球菌
菌种→胰酪大豆胨琼脂或胰酪大豆胨肉汤(30～35℃/18～24小时)→用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
菌种→沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤(20～25℃/ 2～3天)→用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液
白色念珠菌
黑曲霉
加入菌悬液(≤100cfu)→培养(20～25℃/不超过5天)
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
加入菌悬液(≤100cfu)→培养(30～35℃/不超过3天)
白色念珠菌
黑曲霉
加入菌悬液(≤100cfu)→培养(30～35℃/不超过5天)Fra bibliotek胰酪大豆胨肉汤
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
加入菌悬液(≤100cfu)→培养(30～35℃/不超过3天)
沙氏葡萄糖琼脂
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1.概述:培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。
适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制是提供优质培养基的保证。
供试品微生物限度检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
2.验证目的：本次验证的目的是确认金黄色葡萄球菌检查用培养基适用性检查用的甘露醇氯化钠琼脂培养基的质量，以及其制备程序、保存条件等是否满足微生物限度检查用要求。
3.验证依据：《中国药典》2015年版四部“1106非无菌产品微生物限度检查：微生物控制菌检查”、“9203药品微生物实验室质量管理指导原则”。
4.验证项目：甘露醇氯化钠琼脂培养基的适用性检查。
5.适用范围：成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
6.验证周期：除另有规定外，在实验室中，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可以只进行一次。
如果培养基的制备过程未经验证，那么每一灭菌批培养基均要进行适用性检查试验。
7.验证小组人员及职责：
7.1验证小组人员:
7.2验证人员职责及要求
7.2.1按验证方案及相关文件实施验证。
7.2.2认真观察并做好验证原始记录。
7.2.3对实施验证的结果负责。
7.3验证中各部门的职责
7.3.1验证领导组职责
7.3.1.1制订验证总计划，负责全公司验证工作的管理。
7.3.1.2确定验证项目及验证项目负责人。
7.3.1.3负责验证方案的批准工作。
7.3.1.4负责验证资料及结果的审核工作。
7.3.1.5负责验证报告的批准工作。
7.3.2验证项目小组职责
7.3.2.1负责验证方案的起草工作。
7.3.2.2参与验证方案的讨论、确认工作。
7.3.2.3负责验证方案的实施。
7.3.2.4负责验证结果的分析、统计、报告工作。
7.3.2.5参与验证结果的评价工作。
7.3.3质量部职责
7.3.3.1负责公司验证日常管理工作。
7.3.3.2负责验证方案的审核工作。
7.3.3.3负责验证过程中仪器、仪表、计量器具的校验工作。
7.3.3.4负责检验仪器及检验方法的验证。
7.3.3.5负责验证中各项检测工作，提供验证的检验记录、检验报告，对验证过程中的各项检验工作负责。
7.3.3.6负责对验证人员的培训、考核工作。
7.3.3.7负责验证资料和报告的审核工作。
7.3.3.8负责验证文件回收、归档管理工作。
8.合格标准：
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在
0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
9.验证实施条件
9.1验证方案培训：在验证实施前，应对参与验证的人员进行验证方案以及与验证相关的文件进行培训，确保相关人员掌握了验证的相关要求与知识。
9.2微生物限度检测室：检验所使用的检测室应经过HVAC系统确认，并符合要求。
9.3检验用水：验证过程使用的纯化水其制备系统应经过确认并符合要求，纯化水质量应经过检验并符合《中国药典》2015年版二部的要求。
9.4检验仪器设备：验证涉及的检验仪器（设备）与检验方法，应经过技术监督局校验合格或者公司确认/验证合格。
9.5验证菌种：验证所使用的菌种，其种类与传代次数应符合《中国药典》的相关要求。
菌种情况见附件2:菌种确认。
10.验证过程
10.1菌液制备
取经30-35℃培养18-24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的新鲜培养物1ml加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍递增稀释至10-6-10-8，约为≤100cfu/ml的菌悬液备用。
10.2实验操作
10.2.1甘露醇氯化钠琼脂培养基：新鲜配制对照甘露醇氯化钠琼脂培养基，121℃灭菌15min，冷却至60℃倾注平皿，35℃培养箱预培8h后备用。
取2个无菌甘露醇氯化钠琼脂平板，涂布接种大肠埃希菌1皿，接种菌液0.1ml（含菌≥100cfu），另一平板不接种菌作为空白对照，涂布均匀后于30～35℃倒置培养。
被检培养基同法操作。
72h分别观察结果。
10.2.2甘露醇氯化钠琼脂培养基：新鲜配制对照甘露醇氯化钠琼脂培养基，121℃灭菌15min，冷却至60℃倾注平皿，35℃培养箱预培8h后备用。
取3个无菌甘露醇氯化钠琼脂平板，分别涂布接种金黄色葡萄球菌2皿，接种菌液0.1ml（含菌≤100cfu），另一平板不接种菌作为空白对照，涂布均匀后于30～35℃倒置培养。
被检培养基同法操作。
18h分别观察结果。
10.3.检查结果：见附件5：金黄色葡萄球菌检查用培养基适用性检查结果
11.异常情况与偏差处理：当出现偏差时，应按《偏差处理管理规程》进行处理。
12.验证结果评定、结论与建议
验证小组组长负责收集各项验证、试验记录，根据验证、试验结果对验证效果进行综合评审，起草验证报告、做出验证结论。
对验证结果的评审应包括
以下内容：
12.1验证试验是否有遗漏？
12.2验证实施过程中对验证方案有无修改？修改原因、依据以及是否经过批准？
12.3验证记录是否完整？
12.4验证试验结果是否符合标准要求？偏差及对偏差的说明是否合理？是否需要进一步补充试验？
13.附件
13.1 附件1:验证实施条件确认
13.2 附件2:培养基确认
13.3 附件3:菌种确认
13.4 附件4:菌液浓度确定
13.5 附件5:金黄色葡萄球菌检查用培养基适用性检查结果
13.6 附件6:验证结果审批表
附件1：设施设备验证确认
确认结论：
确认人：确认日期：
确认结论：
确认人：确认日期：
确认结论：
确认人：确认日期：
附件4：菌液浓度确定
根据要求，菌数要控制在每1ml中含菌数在≤100cfu，因此，我们确定菌液制备浓度为：
大肠埃希菌：金黄色葡萄球菌:
附件5：金黄色葡萄球菌检查用培养基适用性检查结果
表6:验证结果审批表
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