原生质体细胞融合技术
诱导原生质体融合的化学试剂
诱导原生质体融合的化学试剂原生质体融合是一种重要的细胞学技术，可以将两个或多个细胞融合成一个细胞，从而实现细胞间的基因和质粒的转移。
这种技术在生物学、医学和农业等领域都有广泛的应用。
为了实现原生质体融合，需要使用一些化学试剂来诱导细胞融合。
常用的原生质体融合化学试剂主要包括聚乙二醇（PEG）、钙离子和脂质体等。
其中，PEG是最常用的化学试剂之一。
PEG可以增加细胞膜的通透性，从而促进细胞融合。
PEG的浓度和分子量对细胞融合的效果有很大的影响。
一般来说，PEG的浓度越高，细胞融合的效果越好。
但是，过高的PEG浓度会导致细胞死亡，因此需要根据实际情况选择合适的PEG浓度。
钙离子也是一种常用的原生质体融合化学试剂。
钙离子可以促进细胞膜的融合，从而实现细胞融合。
钙离子的浓度和种类对细胞融合的效果也有很大的影响。
一般来说，钙离子的浓度越高，细胞融合的效果越好。
但是，过高的钙离子浓度会导致细胞死亡，因此需要根据实际情况选择合适的钙离子浓度和种类。
脂质体是一种由磷脂和胆固醇等成分组成的微小囊泡，可以与细胞膜融合，从而实现细胞融合。
脂质体可以通过电穿孔、超声波和化学方法等多种方式制备。
脂质体的种类和浓度对细胞融合的效果有很大的影响。
一般来说，脂质体的浓度越高，细胞融合的效果越好。
但是，过高的脂质体浓度会导致细胞死亡，因此需要根据实际情况选择合适的脂质体浓度和种类。
诱导原生质体融合的化学试剂是实现细胞融合的重要手段。
PEG、钙离子和脂质体等化学试剂可以促进细胞膜的融合，从而实现细胞融合。
在使用这些化学试剂时，需要根据实际情况选择合适的浓度和种类，以达到最佳的细胞融合效果。
原生质体融合技术简介
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中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology
原生质体研究的发展
1838 1873 1896 1931 1954 1958 1970 1972 1972 1974 1976 1976 1977 1978 1981 1988 2002 Muller Lugmbuthl Unna Wathin Bnders et al Marston Power et al Carlson Ferenczy et al Michayluk Ferenczy et al Fodor et al Hopwood Gleba et al Menczel Kirimalra et al Stemmer et al 动物病理组织中发现多核细胞 天花病脓胞周围发现多核细胞 水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞 麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞 组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞用和成多核体 用副流感病毒诱发细胞融合 探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合 用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合 以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 发现 以曲霉 青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功 链霉菌原生质融合并获融合重组子 用PEG+高pH-Ca2+研究原生质体融合 高 用高pH-Ca2++9℅DMSO与少量 与少量PEG获得较高的融合率 用高 与少量 获得较高的融合率 原生质体PEG融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 原生质体 一种新的体内分子育种方法——全基因组改组技术 全基因组改组技术 一种新的体内分子育种方法
细胞工程___第四章原生质体与细胞融合用
五.原生质体鉴定
1)低渗爆破法：无壁吸水向外膨胀直至胀破，是无形 的。有部分细胞壁，则原生质体从破碎后留下的残 迹仍保持半圆形的细胞壁。
2)荧光染色法:将原生质体放大离心管中，加入0·7mo l/L甘露醇配置的0.05%~0.1%荧光增白剂溶液，染 色5-10Min ，离心、洗涤除去多余的染料，在荧光 显微镜下观察(波长3600-4400A0)。绿色光显示纤维 素的存在，发出红色光的没有纤维素的真正的原生 质体。
4、细胞质膜稳定剂
细胞质膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生质 体的稳定性与活性，促进细胞壁形成及细胞分裂等。
常用质膜稳定剂有：
葡萄糖硫酸钾、MES、CaCl•2H2O、KH2PO4等。 MES:2-( N-morpholino) ethanesulfonic acid 2-( N-吗啉代)乙磺酸
作用：不但具有质膜稳定作用，还具有缓冲作用，调 节pH值。
(4)氧电极法:有活力的原生质体在光照下会进行光合 作用而放出氧气，在没有光照的条件下进行呼吸而 耗氧。因此，可以采用氧电极来测定氧的变化来原 生质体是否具有活力。
第二节 细胞融合
一、细胞融合的概念
细胞融合，也称原生质体融合，或体细 胞杂交。是指两种异缘（种间、属间）原生 质体，在诱导剂诱发下或电冲击下，发生膜 融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞， 进一步发育成杂种植物体。
甘露醇
0.6 M
CaCl•2H2O
0.5%
MES
5.0 mM
pH
5.8
6、原生质体的游离与纯化(以叶为例)
1）、原生质体的游离
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将 去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无 菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表 皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。 对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在 酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉， 留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。
原生质体融合和体细胞杂交的关系
原生质体融合和体细胞杂交的关系下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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诱导植物细胞原生质体融合的方法
诱导植物细胞原生质体融合的方法
植物细胞原生质体融合就像是一场细胞界的奇妙派对！那到底咋诱导它们融合呢？嘿，物理法里的离心、振动、电刺激就像给细胞们来一场刺激的冒险。
把不同的原生质体放在一起，通过高速离心或者振动，让它们撞在一起，就像两个小伙伴在游乐场里不小心撞个满怀。
电刺激呢，就像给细胞们来一道闪电，瞬间让它们“来电”，紧密结合。
注意哦，操作的时候可得小心，别把细胞给弄伤啦！这方法安全不？放心吧！只要操作得当，那是相当安全稳定滴。
就好比走钢丝，只要技术好，就不会掉下去。
那这融合有啥用呢？用处可大啦！可以创造出具有新特性的植物呀！比如让抗病虫害的和高产的植物融合，哇塞，那不就有了既抗病虫害又高产的超级植物嘛！优势也很明显呀，能打破物种界限，就像打破了魔法的封印，让不同的植物基因可以交流融合。
就问你厉不厉害？实际案例也不少呢！比如科学家们通过原生质体融合，培育出了更耐旱的植物。
在干旱地区，这可真是救命稻草哇！所以说，植物细胞原生质体融合就是植物界的魔法棒，能创造出各种神奇的植物。
咱就得大胆地去探索，让植物世界更加丰富多彩。
观点结论：植物细胞原生质体融合超棒，值得我们大力研究和应用。
原生质体融合方法及原理
原生质体融合方法及原理一、原生质体融合方法。
1. 化学法。
- 聚乙二醇（PEG）融合法可是原生质体融合的常用化学方法哦。
PEG就像一个超级黏合剂呢。
它能使原生质体紧紧地挨在一起。
你想啊，原生质体原本都是单个儿的，PEG在那儿一搅和，就把它们拉到一块儿啦。
它会改变原生质体的膜结构，让膜上的一些分子重新排列，这样就创造了融合的条件。
就好像是给原生质体们牵红线，让它们有机会亲密接触然后融合在一起。
2. 物理法。
- 电融合法也很有趣呢。
想象一下，原生质体就像一个个小泡泡。
电融合的时候，就给它们加上一个电场。
这个电场就像是一个魔法力量，在合适的电场强度和脉冲时间下，原生质体的膜会被诱导发生极化。
膜上的电荷分布就变得不均匀啦，然后就会相互吸引。
就像小磁铁一样，“啪”地一下就贴到一起，然后就融合成一个新的原生质体啦。
二、原生质体融合原理。
1. 膜融合。
- 原生质体融合最关键的就是膜融合啦。
不管是化学法还是物理法，最终目的都是让原生质体的膜融合起来。
原生质体的膜是有流动性的，就像软软的果冻一样。
当受到外界的刺激，比如PEG的黏合作用或者电场的极化作用时，膜上的脂质分子和蛋白质分子就开始动起来啦。
它们会调整自己的位置，使得两个原生质体的膜能够逐渐靠近，然后融合成一个连续的膜，这样就把两个原生质体的内部物质包到一起啦。
2. 细胞内物质混合。
- 一旦膜融合了，两个原生质体里面的细胞质、细胞器这些东西就开始混合啦。
这就像是两个小伙伴把自己的宝贝都拿出来放到一起分享。
线粒体、叶绿体这些细胞器在新的原生质体里面开始重新组合和分配工作。
细胞核里面的遗传物质也在这个新的环境里可能会发生一些奇妙的变化呢，比如说基因的重组，就像把两盒不同的拼图碎片倒在一起重新拼一样，可能会拼出全新的图案，也就是产生新的性状啦。
原生质体融合就是这么一个充满神奇和惊喜的过程呀。
人工诱导植物原生质体融合的方法
人工诱导植物原生质体融合的方法
人工诱导植物原生质体融合的方法有以下几种：
1. 超声波处理法：将含有植物原生质体的悬浮液经过超声波处理，在超声波的作用下，原生质体的融合效果会得到提高。
2. 电融合法：利用电场的作用促使原生质体融合。
将含有植物原生质体的悬浮液放置在电融合装置中，通过调节电场强度和持续时间来诱导原生质体的融合。
3. 化学诱导法：利用化学物质（如聚乙二醇）改变原生质体的细胞膜的渗透性，使原生质体能够互相融合。
4. 高温处理法：将原生质体悬浮液暴露在较高的温度下，通过高温的作用促使原生质体融合。
5. 培养基优化法：通过改变培养基中的成分和浓度，调节pH
值等条件来提高原生质体融合的效率。
需要注意的是，不同植物原生质体融合的条件可能会有所不同，以上方法仅供参考，具体的操作条件需要根据实际情况进行优化和调整。
原生质体融合操作方法
原生质体融合操作方法
原生质体融合是将两个或更多的细胞融合在一起，以形成单一的细胞。
在实验室中，原生质体融合可用于合成杂交细胞或研究细胞膜蛋白质交互作用。
以下是一种常用的原生质体融合操作方法：
1. 制备原生质体：收获新鲜的植物细胞并环绕其周围的细胞壁。
用酶类解除细胞壁以获得原生质体。
2. 制备混合物：在离心管中将两种原生质体混合并加入缓冲液。
3. 让细胞融合：通过高渗透压或电脉冲使膜破裂或局部破损，让细胞形成互通。
4. 分离融合物：将融合物分离出来，并放在一个合适的培养基上培养。
5. 检测融合结果：使用显微镜观察细胞是否真正融合，或使用特定的抗体标记来检测融合后的细胞表面分子。
需要注意的是，原生质体融合需要谨慎操作，避免损坏细胞结构或引入杂质。
在实验中，需要仔细选择不同类型的原生质体，以确保它们能够融合。
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食品生物技术课程论文原生质体细胞融合技术原生质体细胞融合技术摘要：细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术己在农业、医药、环保等领域得到了迅速发展和应用。
综述了细胞融合技术中的常用方法:细胞融合仙台病毒诱导法、细胞融合PEG（聚乙二醇)诱导法、细胞融合电场诱导法、细胞融合激光诱导法;以及最新研究进展:基于微流控芯片的细胞融合技术、高通量细胞融合芯片、空间细胞融合技术、离子束细胞融合技术、非对称细胞融合技术等，并对它们的优缺进行简要的评述。
关键词：原生质体细胞融合技术影响因素融合方法发展正文：原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交，是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程。
利用现代科学技术，把来自于不同种生物的单个细胞融合成一个细胞，这个新细胞得到了来自两个细胞的遗传物质，具有新的遗传或生物特性。
原生质体融合技术起源于20世纪60年代。
1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。
1974年匈牙利的Ferenczy 等采用离心力诱导的方法，报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合，从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术，并从微生物种内融合扩展到界间的融合。
目前，通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。
细胞融合核技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理念领域的研究提供了有力的手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方而都有广泛的应用价值。
特别是在单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发等技术中细胞融合技术已成为关键技术。
1 原生质体融合技术微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备，原生质体融合，原生质体再生。
1. 1 原生质体制备与再生过程中的影响因素制备原生质体的最大障碍就是细胞壁，现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法，使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶，具体根据所用微生物的种类而定。
影响原生质体制备的因素很多，不同的微生物有其较为适当的形成条件。
在菌龄选择上，多采用对数生长中后期的细菌，这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肤聚糖含量最低，细胞壁对酶的作用最敏感。
对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中，用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度比为5:3: 1的酶液混合使用能提高去壁效果。
使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用一种酶的效果好，在一定范围内，酶作用的时间和酶作用的浓度都与原生质体的形成率成正相关，而与再生率成反相关。
另外，EDTA作为鳌合剂，可以避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶脱壁效果，从而提高原生质体的形成率。
据报道，对大肠埃希菌来说，用EDTA洗涤后，可以除去对酶解不利的金属离子。
另一方面，在原生质体制备前，用适量的青霉素对菌体进行预处理，可以抑制肤聚糖合成过程中的转肤作用，有利于原生质体的形成。
根据酶反应动力学原理，酶解温度直接影响酶促反应的速度，如放线菌的最适酶解温度为28℃一37℃，真菌的最适酶解温度为30℃一35℃。
在高渗溶液中添加15 m L/ L聚乙烯毗咯烷酮( PVP)等原生质体扩张剂，有利于溶液中细菌的分散，有助于制备原生质体，添加 0.02 mol/ L镁离子，有利于原生质体的稳定。
关于原生质体的再生，在原生质体高渗再生培养基中加入0.3mol/L的蔗糖和0.2 mol/L的丁二酸钠是合适的，还有报道说在高渗再生培养基中加入0.5mol/L的蔗糖是适宜的，这可能要根据不同的微生物种类而定。
1. 2 原生质体融合过程中的影响因素1974年，匈牙利的Ferenczy报道了离心力诱导法对白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合。
随后人们相继用NaCl、 KC1等作为诱变剂进行融合，但融合频率都很低。
聚乙二醇在适量钙离子存在下能有效地诱导植物原生质体融合，钙离子主要是通过维持膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与活性。
原生质体膜外在蛋白上二价阳离子的存在使膜脂流动性减慢、稳定性增强，这种维持稳定性的效果大小与膜表面分子数量的多少呈正比例关系，PEG种类对原生质体融合的影响不大。
此外，其融合率还受其他诸因素的影响。
影响原生质体融合的因素很多，特别是环境中的阳离子存在，融合时的pH也对原生质体融合有较明显的影响。
一般来讲钙离子,镁离子有助于融合。
如有0.O1 mol/L钙离子存在时，可得到较高的融合率，但在缺乏钙离子时，若pH较低，融合频率也较高。
这是因为钙离子和带负电荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用，使原生质体带电，彼此易于附着发生凝集所致。
2 原生质体融合的方法2. 1 细胞融合仙台病毒(HVJ)诱导法1962年日本冈田善雄偶然发现一种叫日本血凝性病毒HVJ或称仙台病毒能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。
冈田善雄的研究为人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础。
细胞融合现象公布后引起细胞学界的高度重视。
1965年英国的Harris和Watkins在利用灭活病毒诱导细胞融合上作了大量的工作，并进一步将这种灭活病毒作为一种普遍的方法来诱导不同种动物细胞，他们在实验室中成功进行了人类细胞、动物细胞、鸟类和蛙类细胞之间的融合，并且可得到存活的杂合细胞。
他们的研究工作证明了在病毒法诱导细胞融合中，其有效促融因子在于细胞的膜，病毒膜片(甚至在病毒灭活或被超声打碎后)能使细胞间产生凝聚和融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。
该方法的问题主要在于病毒制备困难，操作复杂，灭活病毒的效价差异大，实验的重复性差，融合率很低等。
这种方法适用于动物细胞融合.主要用于实验室研究。
2. 2 细胞融合PEG(聚乙二醇)诱导法1974年华裔加籍科学家高国楠(Kao)发现聚乙二醇( PEG:polyeth贝eneglycol)能促使植物原生质体融合，当加入一定分子量的PEG时，融合效率较病毒诱导法可提高1 000倍以上，Kao经过研究发现PEG在融合过程中起着稳定和诱导凝集作用。
后来人们又发现还有许多其他的化学剂可使细胞凝集并融合，如磷酸盐、高级脂肪酸衍生物、脂质体等，不过这其中以聚乙二醇的效果较好。
且由于病毒诱导细胞融合存在诸多缺点，所以1975年以后，利用PEG诱导细胞融合逐渐发展成为一种规范的重要化学融合方法，并代替了Sendai virus 在细胞融合中的地位，它将病毒法诱导的细胞融合率从1/105提高到1/103。
另外，PEG法的好处是没有品种种间、属间、科间的特异性或专一性，动植物间的限制也被打破。
不过PEG法对细胞毒性大，这极大地影响了融合率和融合后细胞的存活率。
这种方法一直沿用至今，即使到了细胞电融合技术业已成熟的今天，PEG法依然以其低廉的实验成本和相对较高的融合率，而在许多实验中依然被大量应用。
2. 3 细胞融合电场诱导法细胞电融合是20世纪80年代发展起来的一门新兴的细胞工程和生物物理技术。
自电穿孔及电融合技术发明创造以来的20年里，电穿孔和电融合已成为一门成熟的学科。
有关细胞电融合现象为科学家Zimmermann在1978年所发现，并采用电脉冲方法成功地诱导了细胞融合，开创了细胞融合技术的新局而。
日本科学家Senda也在1979年利用电场刺激实现了植物细胞的融合，并首次实现了电穿孔的实验和用电刺激植物原生质体融合的实验，其后他又对植物细胞电融合技术进行了研究。
以后几年里，人们把这种新的融合手段从动、植物扩展到微生物和真菌的原生质体融合研究中，导致了原生质体融合技术的新突破。
与使用聚乙二醇( PEG)的化学法相比，电场刺激法是一种非常高效的细胞融合方法。
电融合技术操作简单、电参数(如脉冲强弱、长短等)容易精确地调节、无化学毒性，对细胞损伤小，可以免去细胞融合后的洗涤程序，融合率高，可应用于许多种不同的细胞。
故这种方法得以在短期内被广泛采用，成为细胞融合的主要技术手段。
不过需要购置专用的细胞电融合设备(细胞电融合仪)。
2. 4 细胞融合激光诱导法1984年，Schierenberg首次报道利用微束激光成功地进行了细胞融合实验，为细胞融合找到了另一种有效的方法。
1987年，联邦德国海德堡理化研究所使用准分子激光器泵浦的染料激光器诱导哺乳动物细胞融合和植物原生质体融合。
细胞之间相互接触是实现细胞融合的前提，除了采用病毒、化学剂或电的方法使细胞接触，还可以利用激光的光镊建立两细胞间接触。
简单地说，光镊所形成的光学势阱，会把细胞拉向光束中心，钳住细胞，从而实现了对生物粒子的远距离、非接触式捕获。
1991年Rosemarie, Wicgand, Steubing等人先后使用激光诱导法对骨髓瘤细胞间的接触实现了融合。
不过激光诱导法中所使用的设备非常昂贵，而且是一种微操作法，对操作技术要求很高，总体来看这种技术的效率并不高。
3 细胞融合技术的最新进展3. 1基于微流控芯片的细胞融合技术随着微机电系统技术和微加工技术的发展，微电极阵列的设计加工制作也日趋成熟，加之微通道网络可以整合到生物芯片之上，这将使得微流控系统成为细胞融合的理想平台，利用微流控系统可以按照预定的要求大量融合异种细胞。
目前，基于微流控芯片的细胞融合技术已成为细胞融合技术研究的重点领域。
思德博格等研究人员已经在微流控系统中实现了单个成对细胞的融合。
他们的成功证明了利用微流控技术使细胞之间可以实现可控融合。
这种可控的融合势必对于未来杂交瘤细胞的制备、克隆技术以及对基因表达的研究方而产生巨大的影响。
利用基于芯片技术的微流控系统不仅可以实现对细胞甚至单个细胞的操控，比如转移、定位(移动到指定的位置)、变形等;也可以同时输送、合并、分离和分选大量细胞;细胞融合在芯片上可以通过并行或快速排队的方式实现。
此外由于在微通道内的腔体容积很小，所以会大幅减少细胞融合中所需的细胞数量，同时细胞融合率和杂合细胞的成活率会大大提高。
3. 2高通量细胞融合芯片高通量细胞融合芯片利用微电极阵列在细胞融合芯片的微米范围内产生的高强度高梯度辐射电场，使得细胞融合芯片中的细胞在此特殊辐射电场的作用下产生介电质电泳力，精确处理和刺激预定的细胞目标;从而使目标细胞按照预先设计的方向(细胞可以以任何预先设计好的方向)以预定的速度(可以使不同种的细胞以不同的速度定向)移动，从而可以按照设计要求准确地大批量地得到目标细胞配型;集成微电极阵列的微流控系统，可以方便灵活地实现对细胞的操作、隔离和转移。
由于在微通道内微电极间距可以做得很小，因此获得同样强度的辐射电场强度只需施加较低电压的交变电场和脉冲就可以了，不用加载昂贵的高电压发生装置。
例如，在20um的电极对间距施加14 V的脉冲就相应地可以获得7 kV/cm的高强度场强，这足以形成细胞融合所需要的电场强度。