原生质体融合技术的讲义研究进展
原生质体融合技术的研究进展
• 不足之处：
– 原生质体融合后DNA交换和重组随机发生， 增加重组体 分离筛选的难度。
二、原生质体融合的步骤和方法
原 生 质 体 融 合 步 骤
1、亲本及遗传标记的选择
• 根据融合的目的选择适宜的直接亲本。现在一般认为亲本 应采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具 有更大的杂种优势。 • 作为原生质体融合的二亲本都应该有一定的遗传标记，便 于重组体的检出。常用的遗传标记有：带隐性性状的营养 缺陷、抗性标记、热致死、孢子颜色和菌落形态等作为标 记。 • 实际应用时究竟采用哪各遗传标记，可以根据试验目的确 定。
28-37 28-37
7.5-8.5
一类是盐溶液系 统，包括NaCl、 KCl、MgSO4、 CaCl2，浓度为0.3 ~ 1.0mol / L；
放线菌
glucuronidase 1%-2%
纤维素酶、 酵母裂解 酶、β-1,3 葡聚糖酶、 几丁质酶、 蜗牛酶 lywallzyme 1.5% snailase 10-30 时间较长
四、前景及展望
• 原生质体融合技术为遗传操纵、分子生物学和基 础理论研究提供了一种重要工具，也为遗传育种 提供了一种有效手段，已广泛应用于微生物育种 工作的各个方面。 • 近年来，灭活原生质体融合、离子束细胞融合、 非对称细胞融合以及基因重排分子育种等新方法 相继提出并应用于微生物育种，这是原生质体融 合技术的新发展。相信随着技术的不断完善，原 生质体融合在微生物育种中占有的地位会越来越 重要。
放线菌
1000~6000
20
l ~ 60 min，
一般 30% ~ 50%
4000~6000 真菌 链霉菌：1000
大多数情 况下为l ~ l0 min 30
植物原生质体融合技术
要点二
细胞大规模培养
通过改进细胞培养技术，可以实现植物原生质体融合后细 胞的规模化培养，为快速繁殖和生产转基因植物提供有效 手段。
生物反应器与细胞工厂的优化
生物反应器设计
针对植物原生质体融合过程，可以设计和优 化生物反应器，实现融合过程的自动化和连 续化，提高融合效率和细胞质量。
细胞工厂构建
通过优化生物反应器中的培养条件和工艺参 数，可以构建高效细胞工厂，实现植物原生
技术应用领域
新品种培育
通过原生质体融合技术，可实现不同品种间 优良性状的整合，快速培育出新品种。
基因功能研究
通过原生质体融合技术，可研究植物细胞中 基因的表达和功能。
抗性改良
利用该技术改良植物的抗逆性，如抗旱、抗 病、抗虫等。
细胞器与细胞生物学研究
该技术可用于研究细胞器的结构和功能，以 及细胞分裂、分化的过程。
原生质体的诱导融合
电融合法
利用电场作用诱导原生质体融合，通 常在特定的电融合装置中进行，需要 在特定的电场强度和脉冲时间下进行 操作。
化学融合法
利用化学物质如聚乙二醇（PEG）等 诱导原生质体融合，通过调节PEG浓 度、pH值等参数来控制融合过程。
融合后细胞的筛选与培养
筛选
通过特定的筛选方法如荧光染色、抗性筛选等，从融合后的细胞群体中筛选出 具有优良性状的细胞。
植物原生质体融合技术
目录
CONTENTS
• 植物原生质体融合技术概述 • 植物原生质体融合技术的基本原理 • 植物原生质体融合技术的应用 • 植物原生质体融合技术的挑战与前景 • 案例研究 • 技术展望
01
CHAPTER
植物原生质体融合技术概述
定义与特点
海藻原生质体融合及杂交技术的研究进展
海藻原生质体融合及杂交技术的研究进展*REVIEW O N PR OTOP LAST FU SIO N AN D H YBRIDIZATIO N OF MARINE AL GAE林学政沈继红李光友(国家海洋局第一海洋研究所海洋生物活性物质重点实验室青岛266061)关键词海藻,原生质体,融合与杂交技术根据藻类细胞脱壁程度的不同,Adam ich 将脱壁后的藻细胞分为原生质体(Proto p last )和原生质球(S p hero p last )。
原生质体是指质膜外的细胞壁和包被层全部除去而保持其余细胞组分的任何基因型的藻细胞;原生质球是指细胞壁被全部或部分除去,仍保持质膜外包被层的含全部细胞内组分的部分。
当细胞壁去除后,原生质体具有以下特征:(1)无细胞壁障碍,可对膜、细胞器进行基础研究,同时可进行遗传操作。
(2)具有全能性,能在人工条件控制下,进行大量快速繁殖。
(3)可诱导融合,形成杂种细胞,为体细胞杂交提供实验材料。
细胞杂交是指用人工的方法把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导融合成杂合细胞,再经离体培养,诱导分化出完整植株的整个过程,以及研究其亲代、子代的性状表现等有关理论和实际问题。
原生质体融合使任何两种海藻细胞进行杂交成为可能,为各种海藻的遗传型,有效地培育具有各种优良性状的海藻新品种开辟了一条新途径。
本文就海藻原生质体的制备与再生、融合与杂交等问题予以综合评述,以期为利用该技术改良海藻提供参考。
1海藻原生质体的制备及培养技术海藻原生质体的制备方法有机械法、微生物酶解法和酶法。
其中机械法由于原生质体得率太低,费时费力,目前已很少使用。
微生物酶解法是利用海洋细菌与藻体共培养过程中释放出来的特殊酶,把海藻细胞壁分解掉从而得到原生质体,这实际也是酶法。
由于酶法是特定的酶水解藻细胞壁,具有很强的专一性,同时酶解的条件十分温和,在细胞能够承受的范围之内,所以对细胞无伤害,而且酶法效率高,从而能获得大量的有活力的原生质体。
细菌原生质体育种技术及其应用进展
四、实验过程
3、原生质体融合
取两个亲本的原生质体悬液各1 mL 混合，放置5 min 后，2500 r/min 离心10 min，弃上清液。于沉淀中加入
0.2 mL SMM 溶液混匀，再加入1.8 mL PEG 溶液，轻轻
摇匀，置36℃水浴保温处理2 min，2500 r/min 离心10 min，收集菌体，将沉淀充分悬浮于2 mL SMM 液中。
四、实验过程
（二）原生质体融合育种流程：
选择 亲本
制备 原生 质体 原生 质体 再生
遗传 标记、 选择 性培 养基
化学融合、电融合
促融合
高渗
破壁
融合子 筛选
反复
检出融合子
四、实验过程
（三）实验过程
1、选择亲本
选择两个具有育种价值并带有选择性 遗传标记的菌株作为亲本。
四、实验过程
2、原生质体的制备
的重要基因重组技术。1976年FODORK等采用聚乙 二醇（PEG）、磷酸钙诱导巨大芽孢杆菌原生质体
的融合，SCHAEFFEP等报道了用PEG诱导枯草芽孢
杆菌的原生质体融合，这2项重要研究成果同时发
表在美国科学院院报上，是细菌原生质体融合技
术发展的里程碑，经过30余年的发展，已经成为 细菌遗传育种的一项基本技术。
1、能够打破菌株的种属界限，实现远缘菌株间的融合； 2、可以使遗传物质传递更为完整，获得更多基因重组机会； 3、可以和其他育种方法相结合，综合双亲的多种优良性状； 4、在工业菌株的选育过程中，可以实现定向育种； 5、能够用于遗传分析等基础理论研究等。
七、意义及展望
细菌原生质体融合育种技术不但可以
改良菌种遗传性状、提高有用代谢产物产量， 还可以综合不同菌株代谢特征，产生新的有 用代谢产物，在工业生产和遗传育种上展示 出美好的应用前景。
14.10原生质体融合的研究概况
原生质体融合的研究概况
一、原生质体融合的概念
原生质体融合又叫体细胞杂交，是指将不同来源的植物原生质体进行融合，再经培养获得杂种植株的过程。
植物体细胞杂交的过程
二、原生质体融合的研究概况
1909年，Kuster用低渗NaNO
溶液引起原生
3
质体的融合。
1972年，Carlson等用NaNO
融合方法获得
3
了第一株体细胞杂种，即烟草与其野生种间体细胞杂种（粉蓝烟草与郎氏烟草）。
1973年，Keller和Melchers用强碱性的高浓度
钙离子（5mM CaCl
2·2H
2
O，pH10.5）溶液融合
烟草叶肉原生质体，获得种内及种间体细胞杂种。
1974年，Kao和Michaylub用聚乙二醇(PEG)作融合剂，明显提高了异核体的形成率，且对细胞的毒性很低。
因此，该方法迅速展开。
1978年，用PEG法，成功获得了西红柿与马铃薯第一个属间体细胞杂种。
薯番茄或番茄薯
1979年，Senda发现电融合方法。
由于对
细胞无毒害，已广泛
应用。
目前，种内、种间、属间体细胞杂种已在许多植物上成功。
（如白菜与甘蓝、烟草与大豆、矮牵牛与爬山虎等）
+
白菜甘蓝
白菜-甘蓝
思考题
1、什么是原生质体融合？
2、植物原生质体融合与动物的体细胞杂交
有什么不同？
Thank You!。
微生物原生质体融合技术研究进展
动物医学进展,2008,29(5):64267Progress in Veterinary Medicine微生物原生质体融合技术研究进展3王春平1,2,韦 强1,鲍国连13,刘 燕1,邵泽香1,2,季权安1(1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江杭州310021;2.山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018) 摘 要:原生质体融合技术在遗传学、动植物远缘杂交育种、生物学、免疫学、兽医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值,文章就原生质体制备、再生及其融合过程中的影响因素做了综述,另外还对原生质体融合方法和融合子的筛选方法进行了比较,为选择适宜有效的诱导融合方法和筛选方法提供依据。
关键词:原生质体融合;影响因素;融合方法;筛选方法中图分类号:Q813.2文献标识码:A文章编号:100725038(2008)0520064204 原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交,是指细胞通过介导和培养,在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程[1]。
原生质体融合技术起源于20世纪60年代。
1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。
1974年匈牙利的Ferenczy L 等[2]采用离心力诱导的方法,报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合,从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术,并从微生物种内融合扩展到界间的融合。
路玲玲等[3]采用融合技术成功构建耐高温高产酒精酵母,至此,原生质体融合技术成为工业菌株改良的重要手段之一。
原生质体融合技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大[4]。
1 原生质体融合技术微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备,原生质体融合,原生质体再生[5]。
1.1 原生质体制备与再生过程中的影响因素制备原生质体的最大障碍就是细胞壁,现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法,使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶,具体根据所用微生物的种类而定。
植物生物技术：第七章 植物原生质体融合
第七章 植物原生质体融合
1
第7章 植物原生质体融合
本章主要内容
• 第一节 原生质体融合的发展和研究意义 • 第二节 原生质体融合的方法 • 第三节 原生质体融合方式 • 第四节 体细胞杂种的筛选与鉴定 • 第五节 体细胞杂种的遗传分析 • 第六节 原生质体融合与植物遗传改良
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第7章 植物原生质体融合
一、自发融合（Spontaneous fusion ） ➢ 自发融合是在酶解细胞壁过程中，有些相邻的原生质体彼此
融合形成同核体 ➢ 来源于分裂旺盛细胞的原生质体，自发融合的频率较高 ➢ 小孢子来源的原生质体融合率可高达50%-70%。实际上自然条
件下受精就是一种自发融合
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第二节、原生质体融合的方法
是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合 创造杂种的过程 ➢ 为了与有性杂交区别开来，原生质体融合常常写作“a（+）b”， 其中a和b是两个融合亲本，（+）表示体细胞杂交
4
原生质体融合概念的提出
5
（Melcher et al, 1978）
6
➢ 像大多数杂种一样，杂交株同时具有马铃薯和番茄的形态特征。其 中一些植株形成了“类似块茎的生殖根”，但是没有产生可结实的 花、果实以及真正意义上的块茎
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第二节、原生质体融合的方法
(五)电融合技术
Senda 1979年首先用此方法实现原生质体融合
细胞融合仪
电融合仪的结构特点： 一是交变电场部分； 一是高频直流电击部分
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第二节、原生质体融合的方法
1.电融合法原理
交流电场使原生质体表面电荷偶极化 沿着电极排列，形成串珠 施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，最后形成 融合的原生质体。
园艺植物原生质体融合技术研究进展
1 引言原生质体融合（protoplast fusion）亦称细胞融合（cell fusion）、体细胞杂交（somatic hybridization）、超性杂交（Para sexual hybridization）或超性融合（Para sexual fusion ），是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程[1]。
植物细胞融合技术包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养，以及植株的再生和鉴定等环节。
原生质体融合涉及了双亲的细胞质，它不仅可以把细胞质基因转移到全新的核背景中，也可使叶绿体基因组或线粒体基因组间重新组合。
原生质体融合还可避免受精作用中的种的特异性配子识别反应，有可能打破远亲杂交中的有性不亲和界限。
原生质体技术还可用于种质资源的保存、细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入等方面。
原生质体融合技术起源于20世纪60年代，是基因重组技术的一部分。
经过一定的理化条件处理,使外源目的基因进入受体细胞，并得以表达，以期使得受体细胞在原有性状的基础上，获得所需的新的特殊性状[2]。
1953年we bull首先用肤聚糖水解酶，溶菌酶得到巨大芽胞杆菌的原生质体，1960年Cocking用酶法分离出番茄根原生质体后，Nagata等首次利用烟草叶分离原生质体，经培养获得再生植株，1972年Carlson等以烟草获得了体细胞杂种[4] ，1974年高国楠发现聚乙二醇（PEG）在钙离子存在的条件下能促使植物细胞原生质体融合，1975年Vardi等首次从木本植物Shamonti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织，并从愈伤组织分离原生质体,经培养通过胚状体再生出植株，1985年Fujimura等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株并从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。
随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进，植物细胞融合获得了巨大成功。