原生质体融合(实验报告)
实验十七(2)烟草原生质体融合
弃上 清液
弃上清 液,重新 悬浮在
0.5ml CPW溶 液中
800rpm离 心3min
加入3ml CPW 培养基，用滴 管重新悬浮原 生质体
5
4、原生质体融合
（1）调整密度：用血球板计数后，将原生质体 的密度调整为106个原生质体/ml。 （2）配置PEG融合液（无菌下） PEG溶液：甘氨酸缓冲液：DMSO=8：1：1 （3）将愈伤组织原生质体和叶肉原生质体等体 积混合。
6
（4）原生质体融合步骤
取0.2ml 混合原 生质体 悬浮液
加入0.2ml 高钙高pH PEG融合液
静置 10min
5min内缓慢
加入5ml W5 稀释液，轻
轻吸打混匀
重新悬浮 在0.5ml W5，静置 >10min
800rpm离 心3min， 弃上清夜
静置 >30min
7
（5）融合原生质体的观察
吸1滴融合的原生质体悬浮液于血球计数 板上，在显微镜下融合的原生质体，统计融 合率。 融合原生质体的特征： A：异源融合；B：同源融合 融合率=融合的原生质体数/观察的原生质体数
8
准备下次实验的试剂（各100ml）：
（1）2×CTAB提取缓冲液：100mM Tris-HCl（pH8.0）， 2％（w/v）CTAB，1.4M NaCl，40mM -巯基乙醇， 20mM EDTA
实验十七
（2）烟草原生质体融合
一、原理
PEG带微弱极性的负电荷，能与水、蛋白质和碳 水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。在邻近 原生质体表面之间起着分子桥的作用，加上PEG渗透 吸水的作用，使原生质体相互接触在一起。
在洗涤过程中，直接或间接与质膜结合的PEG分 子从原生质体表面洗脱，并随着pH的降低，导致膜电 荷的不平衡和发生重新分布；在原生质体 吸水过程中， 发生原生质体融合。
植物原生质体的分离与融合
实验六植物原生质体的分离与融合一、实验目的：1、掌握原生质体分离的方法；2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。
二、实验原理：PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。
普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。
该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。
三、实验材料：（1）韭菜或大蒜叶；（2）红辣椒四、实验步骤：Ι 植物原生质体的分离与纯化1、酶解：将撕去表皮的植物叶片和果肉置于酶液（PH 5.4_5.8,去表皮面接触酶液），在适宜温度条件下，避光酶解数小时。
2、过滤：用350目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。
3、原生质体收集：在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。
红辣椒800转/分离心5分钟。
4、洗涤：弃上清液，留沉淀约1ml，加入4ml13%CPW洗液，相同条件下再离心，弃上清液。
弃上清液，留沉淀约1ml，混匀呈悬浮备用。
5、纯化：**蔗糖漂浮法去除碎片法：（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液约3ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。
或者（1*）换一洁净离心管加入20%蔗糖溶液约3ml，然后小心将原生质体悬液平铺于离心管表面。
（以上任一方法皆能看到明显界面）(2)离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中。
注意下步镜检决定是否需要:加入3～4ml13%CPW洗液离心，离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），收集沉淀，最终原生质体体积控制在0.5ML左右。
Ⅱ细胞融合1．不同的原生质体各300μl与带盖离心管中，另加入300μl 40% PEG液，30℃水浴中温浴15min；2．融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能太干)，轻轻盖上盖玻片，显微镜观察。
原生质体融合
实验五原生质体融合一、目的要求学习原生质体融合的方法二、实验器材斜面菌种、接种环、酒精灯、三角瓶、培养皿、移液管、试管、容量瓶、离心管、玻璃棒、显微镜、离心机等。
三、实验试剂（1）0.1 mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。
（2）高渗缓冲液，于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。
（3）原生质体稳定液(SMM)（4）0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC12、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。
（5）促融剂40％聚乙二醇(PEG)的SMM 溶液。
三、实验内容(一) 原生质体的制备1．活化菌体将酿酒酵母菌活化分别转接新鲜斜面。
自新鲜斜面分别挑取一环接入装有25 mL 完全培养基的锥形瓶中，30℃培养16 h 至对数期。
2．离心洗涤、收集细胞分别取5 mL 上述培养至对数生长期的酵母细胞培养液，3000 r/min 离心10 min，弃上清液，向沉淀的菌体中加入5 mL 缓冲液，用无菌接种环，搅散菌体，振荡均匀后离心洗涤一次，再用5 mL 高渗缓冲液离心洗涤一次。
将二株菌体分别悬浮于5 mL 高渗缓冲液中。
3. 酶解脱壁各取3 mL 菌液于无菌小试管中，3000 r/min 离心10 min，弃上清液，加入3 mL 含2.0 mg 蜗牛酶的高渗缓冲液(此高渗缓冲液含有0.1％EDTA 和0.3％SH-OH）于30℃振荡保温，定时取样镜检观察至细胞变成球状原生质体为止，此时原生质体形成。
（二）原生质体融合1. 除酶取两亲本原生质体各1 mL，混合于灭菌小试管中，2500 r/min 离心10min，弃上清液，用高渗缓冲液离心洗涤二次，除酶。
2. 促融向上述沉淀菌体中加入0.2 mL SMM 溶液，混合后再加入1.8 mL 40％PEG，轻轻摇匀，32℃水浴保温2 min 立即用SMM 溶液适当稀释(一般为100、10-1、10-2)。
3．再生取融合后的稀释液各0.1 mL，放于冷却至45℃左右的6 mL 固体再生基本培养基试管中，迅速混匀，倒入带有底层再生培养基的平板上，每个稀释度做两次重复，30℃培养96 h，检出融合子。
04-植物原生质体的制备及融合-卢文
原生质体的制备及融合生31 卢文2003012377一、实验目的：a)学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体形态。
b)学习植物原生质体的融合技术，观察融合原生质体时其形态及变化。
二、实验原理：详见讨论。
三、实验用品：显微镜、擦镜纸、剪子、镊子、小平皿、吸管、直式漏斗、300目尼龙网、10ml离心管、载玻片、盖玻片。
四、试剂：a)洗涤液：甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 2mMpH=5.6b)酶混合液：纤维素酶1%果胶酶0.5-0.7%甘露醇0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 7mMMES 3mMpH=5.6c)PEG溶液：PEG-6000 40%CaCl2·2H2O 3.5mMKH2PO4·H2O 0.7mM葡萄糖0.3mMpH=5.8d)高Ca，高pH洗涤液：CaCl2·2H2O 100mMTris 50mM山梨醇100mMpH=10.5e)蔗糖溶液：20%五、实验步骤：a)原生体的制备i.将新鲜花瓣用蒸馏水洗干净，用滤纸吸干表面水分。
ii.用尖头镊剥去木料的下表皮或将其剪成小细条，加入几滴酶液恒温振荡半小时。
iii.酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，加入少量洗涤液定容至4ml，此时，未被酶解的大块组织留在尼龙网上。
iv.500rpm离心5分钟，弃去上清液，加洗涤液至约2ml吹打均匀。
500rpm5min重复离心一次，彻底去除酶液。
v.加8滴洗涤液，悬浮原生质体。
vi.镜检，检察原生质形态和浓度，看看是否有碎片，本试验中碎片较少，故未做蔗糖漂浮。
b)PEG融合：i.在小平皿内各滴三滴原生质体悬液，静置沉淀。
ii.各缓缓滴加一滴PEG在其中两滴原生质体悬液上，iii.在另一滴上滴加一滴高Ca2+高pH洗液。
iv.镜下观察，1-2分钟后，在原先加入PEG的一滴悬液上加入一滴高Ca2+高pH洗液。
影响植物原生质体融合研究
3. 取不同器官切成细条后提取原生质体，比较获 取原生质体的条件和能力。 4. 用不同成分、浓度的酶液(含0.5%~2%纤维素 ( 0.5%~2% 酶、0.3%~10%离析酶、0~0.5%半纤维素酶、 3mmol/L 2-N-吗啡琳乙磺酸钠、10mmol/L CaCl2、0.7mmol/LKH2PO4和0.3mol/L甘露醇 组成的酶液)(pH5.7)分离原生质体，过滤和洗 涤后离心沉淀收集原生质体。了解不同酶系对 原生质体分离的影响。
【实验报告 实验报告】 实验报告
研究不同因素对黄瓜(或酵母)原生质体的 分离和融合过程的影响，结合专业知识 分析其原因，提出改进的方法。
【原理 原理】 原理
细胞融合过程一般首先是细胞质的 融合，尽管在特殊诱导物(如聚乙二醇等) 的作用下，细胞膜可能会发生一定变化 使两个或多个细胞发生融合。考虑用原 生质体为材料进行融合，可以避免这些 不利因素。
聚乙二醇诱导原生质体融合，通常用相 对分子质量1000的PEG做融合剂最好， 50%PEG溶液能产生最多杂交细胞,使用 相对分子质量较小的PEG时,以55%浓度 为好。PEG溶液在pH 6.0时细胞融合率最 高,融合时细胞密度不要太大,在汇成单层 之前融合时能产生更多杂种细胞。同样, 要成功地用电场法融合原生质体,也依赖 于植物材料的生理状况、实验条件。
黄瓜是分离原生质体的较好材料。已经有建立 黄瓜子叶、真叶或胚性悬浮培养细胞获取的原 生质体分离、培养体系的报道。但其原生质体 融合与其品种、取材部位和培养条件等有关 (也可以用酵母为材料)，方法仍需要摸索和建 立。据报道，种子萌发培养的条件、苗龄以及 是否黄化等因素对分离、提取原生质体有较大 影响；取合适器官的细胞、用分解细胞壁酶系 的浓度、酶解时间也直接影响原生质体的分离、 纯化。原生质体的活力和密度是发生融合的基 本条件。
实验十四 原生质体的分离融合
1、取上述原生质体液两滴，间隔5mm滴于载玻片 上，静置l0分钟，使原生质体沉淀在载玻片上。 2、在两滴悬液之间加1滴30％PEG液，使3滴淀液 相连，室温下(15℃一20℃)作用5一l0分钟， 在显微镜下观察原生质体粘连情况。
实验原理
而原生质体融合是实现上述目的的一个 极为重要的手段。同种或异种原生质体可在 聚乙二醇(PEG)诱导下产生异核体，实现体细 胞杂交，实现广泛的遗传重组，创造新的生 物类型。
实验原理——酶解分离法
常用的细胞壁降解酶种类：
纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、果酸酶等。
——优点：可获得大量原生质体，几乎所有的植 物及其器官组织都可使用。 ——缺点：酶制剂中均含有蛋白酶、核酸酶、过 氧化物酶等及酚类物质，影响获得的原生质体 的活力。
实验方法 (一)原生质体的分离收集：
5、沉淀中加入0．16M CaCl2·2H20溶液1—2ml于 沉淀，轻摇使之悬浮，用带长针头的注射器自 离心管底部轻轻地加入6—8ml22％蔗糖溶液， 使之形成界面。 6、静置待原生持体形成一条带时弃去上、下液 及残渣，用吸管吸取收集原生质体。
实验方法
(一)原生质体的分离收集：
实验用品
(一)材料：植物叶片（菠菜叶片）
取材容易，易用酶解法分离。
(二)用品：倒置显微镜，离心机，
过滤筛(100目)， 漏斗，烧杯，吸管，长注射针， 注射器(5—10m1)等 。
实验用品
(三)试剂： （1)纤维素酶MCaCl2·2H20和0．1％ MES中，PH调至5．6—6．0。
7、用0.24M CaCl2·2H20溶液洗涤一次，离心， 吸去上清液。 8、沉淀中加入l-2ml O．16M CaCl2·2H20溶液悬 浮沉淀，用血球计数板计数，使原生质体密度 为2×105个／ml。 9、取一滴于载玻片上，低倍镜观察原生质体的 纯度和完整性，也可用荧光显微镜检查。
试验十七烟草原生质体融合
学习植物原生质体融合的方法，为进行体细 胞杂交，培育体细胞杂种和胞质杂种打下基础。
三、实验材料和用具
1、材料：烟草BY2愈伤组织，烟草组培苗 2、用具：过滤器，注射筒，不锈钢网筛 （=54m），漏斗，三角瓶，滴管，10ml刻度离 心管，血球记数板。
四、实验步骤
1、配制酶液
各组（2人）配制下列酶液各10ml， 4000rpm离心6min后过滤灭菌于无菌三角瓶中。
（4）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris.HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0）
（5）溶液III： 60 ml 5mol/L乙酸钾, 11.5 ml 11.5％冰乙酸 水
, 28.5 ml无菌
（6）分别配制0.4 mol/L NaOH和2％SDS溶液（各50ml）
CPW培养基+0.4mol/L甘露醇+2%纤维素酶 +0.5%离析酶
2、BY2愈伤组织和叶肉原生质体分离
2～3周龄愈伤 组织和叶片各 约1g和0.5g，叶 片剪成细条
加入到酶液中、 用镊子分散愈 伤组织
黑暗、 25℃酶
解5~6小时，间 歇轻轻摇动。
3、过滤和离心洗涤原生质体
过 滤
800rpm离 心3min
（4）原生质体融合步骤
取0.2ml混 合原生质 体悬浮液
加入0.2ml 高钙 高pH PEG融合 液
静置 10min
5min内缓慢加
入5ml W5稀释 液，轻轻吸打混
匀
重新悬浮在 0.5ml W5，静 置>10min
800rpm离心 3min，弃上 清夜
静置>30min
（5）融合原生质体的观察
原生质体融合
（二）原生质体活性测定 这里采用伊文思蓝活性染色法或荧光素双醋酸酯（FDA） 染色法。 伊文思蓝活性染色法： 1 配制0.005~0.001%的伊文思蓝染料。 2 用染料处理数5min。 3 染色过的细胞材料，放在显微镜下观察。凡未染或染色 及浅的细胞是有活力的，而染色深的细胞是无活力的死细 胞。 FDA染色法： 1 取洗涤过的原生质体悬液0.5mL置于小试管内。 2 加入荧光素双醋酸酯溶液，使其最终浓度为0.01%，混匀， 置于室温5min后用荧光显微镜观察。激发光滤片用QB24， 压制滤光片用JB8。发绿色荧光的原生质体是有活力的， 不产生荧光的原生质体是无活力的。
【实验结果与分析】
当加入原生质体液内的 PEG 被稀释除去时，原 生质体发生融合并形成许多杂合体。种内原生质 体融合比较明显。随着 PEG 分子量的提高，原生 质体融合率增高。 紫菜原生质体和浒苔原生质体之间有融合现象 。
【思考题】
1、 计算迁移效率的意义。
2、 如何将所研究细胞的轨迹图定义到一张图上， 并且所有细胞的起始点均为坐标原点。
（三）原生质体融合 1、 将同样数量的浒苔和紫菜原生质体混合到一
起，浓度106 个/ml。 2、 将0.05 ml的以上混合液加入培养皿中，逐渐 加入0.04 ml 33% PEG。 3、 5~10 min 后，加入0.5 ml洗提液。 4、 5 min 后用15 ml培养基稀释。
5、 培养并在显微镜下观察。
三、实验原理
植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是 开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技 术，其原理是：植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成， 因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细 胞壁。海藻细胞表面为一层海藻多糖组成的藻胶层，其成分不同于高 等植物的细胞壁，但是可用海螺酶将藻胶层酶解去除，从而获得海藻 的原生质体。 在原生质体培养前，常常先对原生质体的活性进行检测。短时间 内测定原生质体活性的方法有多种，如：观察胞质环流作为旺盛代谢 指标、伊文思蓝活性染色、测定光合活性、荧光素双醋酸酯（FDA）染 色法等。现在一般采用荧光素双醋酸酯（FDA）染色法。荧光素双醋酸 酯本身无荧光，无极性，可通过原生质膜进入原生质体，由于受到原 生质体内的酯酶分解而产生有荧光的极性物质 -- 荧光素。荧光素不能 自由出入原生质体，有活力的原生质体便产生荧光；而无活力的的原 生质体无酯酶活性，因此无荧光。根据荧光的有无以及荧光的强弱， 可以确定原生质体的死活及其活性的强弱。
原生质体融合（实验报告）
酵母原生质体融合××××× ××××× 酵母有发酵工业的灵魂之称，其发酵性能的好坏直接影响发酵产品的质量，同时也决定着发酵工艺流程和运转周期及运转费用[1]。
因此，选育优良的酵母菌种在发酵工业中具有重要的意义[2]。
对酿酒酵母的选育始终是酿酒工作者所要从事的重要工作之一。
对酿酒酵母的选育始终是酿酒工作者所要从事的重要工作之一。
好的酿酒酵母好的酿酒酵母能够提高酒的质量和产量，赋予酒良好的风味；能够简化工艺流程，减少设备投资；能够缩短发酵周期，降低运转费。
短发酵周期，降低运转费。
原生质体融合育种( protoplast fusion )是20世纪60年代发展起来的基因重组年代发展起来的基因重组 技术。
通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。
1960年法国的Barsi 研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，同时日本的Dkada 发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索。
国内外对原生质体融合技术的研究都比较成熟, 一般认为酵母菌原生质体融合技术的关键点有原生质体的制备和再生、原生质体的融合以及融合子的筛选等。
传统的对酿酒酵母的选育方法主要有自然分离、连续培养和诱变育种[3]。
近年来重组技术，基因工程和原生质体融合技术迅速发展，得到了广泛应用。
应用。
两个或两个以上的细胞经过自然的或者人为的作用合并成为一个细胞叫融合细胞，这个过程就称为细胞融合过程。
过程就称为细胞融合过程。
用微生物作材料进行细胞融合，用微生物作材料进行细胞融合，用微生物作材料进行细胞融合，必须消除细胞壁和细胞膜。
必须消除细胞壁和细胞膜。
必须消除细胞壁和细胞膜。
通常通常采用酶解作用破除细胞壁，采用酶解作用破除细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。
采用聚乙二醇促使细胞膜融合。
采用聚乙二醇促使细胞膜融合。
03-1植物原生质体的制备及融合_2310040
1962年，日本科学家发现日本血凝型病毒能引起艾氏腹水瘤 细胞融合的现象。
1965年，英国科学家证实灭活的病毒在适当的条件下也可以 诱发动物细胞融合。
背 景
植物细胞杂交发展历史
1960年，Cocking用酶法制备高等植物原生质体获得成功 1970年，Power首次用硝酸钠为诱导剂实现原生质体融合 1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种
加peg后17min以观察实验现象为主拍照只是呈现实验现象的一种方法比较分析实验组与对照组之间的差异及原因原生质体制备和融合过程中各种试剂的渗透压
实验报告的批改
1．基准分：60%
2．实验原理（不能简单拷贝）：5%
3．实验步骤（如实记录）：10% 4．结果与讨论：20% 5．绘图（拍照及图片处理）：5%
1974年，Kao将PEG（聚乙二醇）诱导融合法应用于植物细
胞融合 1978年，Melchers获得了第一个属间细胞杂种（番茄＋马铃 薯） 1981年，Zimmerman发明了电融合仪，建立了电融合方法 1987年，Schweiger建立了对原生质体电融合技术程序
/2013/10/01/tom-tato-patatas-y-tomates-en-una-sola-planta/
机械切割
酶法 自发融合（同种细胞） 人工诱导融合
细胞融合
背 景
细胞融合
19世纪30年代，在肺结核，天花，水痘，麻疹等疾病患者的 病理组织中观察到多核细胞。 19世纪70年代，科学家们在蛙的血细胞中也看到了多核细胞 的现象。 1912年，Lambert报道在组织培养中观察到细胞合并。 1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物 细胞融合的效应。 60年代初法国学者G.巴斯基等发现体外培养的小鼠细胞能自 发融合。
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酵母原生质体融合××××××××××酵母有发酵工业的灵魂之称，其发酵性能的好坏直接影响发酵产品的质量，同时也决定着发酵工艺流程和运转周期及运转费用[1]。
因此，选育优良的酵母菌种在发酵工业中具有重要的意义[2]。
对酿酒酵母的选育始终是酿酒工作者所要从事的重要工作之一。
好的酿酒酵母能够提高酒的质量和产量，赋予酒良好的风味；能够简化工艺流程，减少设备投资；能够缩短发酵周期，降低运转费。
原生质体融合育种( protoplast fusion)是20世纪60年代发展起来的基因重组技术。
通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。
1960年法国的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，同时日本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索。
国内外对原生质体融合技术的研究都比较成熟, 一般认为酵母菌原生质体融合技术的关键点有原生质体的制备和再生、原生质体的融合以及融合子的筛选等。
传统的对酿酒酵母的选育方法主要有自然分离、连续培养和诱变育种[3]。
近年来重组技术，基因工程和原生质体融合技术迅速发展，得到了广泛应用。
两个或两个以上的细胞经过自然的或者人为的作用合并成为一个细胞叫融合细胞，这个过程就称为细胞融合过程。
用微生物作材料进行细胞融合，必须消除细胞壁和细胞膜。
通常采用酶解作用破除细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。
细胞融合之后，还经过细胞质融合，细胞核重组，细胞壁再生等一系列过程才能形成具有生活能力的新菌株。
融合后的细胞有两种可能：一是染色体DNA不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。
另一类是两亲本细胞核染色体DNA真正发生重组。
通过连续传代分离纯化可以区别这两类融合。
应该指出，即便是真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。
因此，必须经过多次分离纯化才能够获得稳定的融合子。
本实验将通过酿酒酵母2.339与酿酒酵母2.70的融合，以期获得具有更高发酵效率的酿酒酵母新品种并应用于制酒工业，在节省酿酒粮食的投入量前提下提高发酵产量。
以期获得更好的经济价值。
1.材料与方法1.1 材料酿酒酵母2.339；酿酒酵母2.701.2 培养基和试剂1. 马铃薯培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml.2. YEPD培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000 g，PH6.03. YEPD高渗培养基：在YEPD培养基中加入0.6mol/L，3%琼脂。
4. YNB高渗基本培养基：YNB基本培养基中0.6mol/LNaCl5. 生理盐水（0.85%）6. 0.6mol/L NaCl7. 无菌水8. 其它化学试剂均为国产分析纯。
1.3 实验用具试管、三角瓶、摇床、恒温培养箱、恒温水浴锅、离心机、接种环、移液管、酒精灯、分光光度计1.4 方法1.4.1 原生质体的制备①收集菌体从斜面上取两亲本菌株各一环酵母菌分别接种于5ml含有YEPD培养基的试管中，25℃静置培养24后，0.3-0.5ml，转接至装有50新鲜YEPD培养基的250三角瓶中，摇床25℃培养至对数早期（14-16h），细胞数达107-108/mL。
离心（3000r/min，5min）收集菌体。
②菌体的预处理菌体用生理盐水洗两次（3000r/min，5min），去上清液后，于离心管中加入预处理液（其用量约为每克湿重菌体用4mL处理液），25℃，30min，离心3000r/min），5min，取沉淀物。
酶液处理去壁于上述离心管中加入新鲜配制的酶液5mL（酶液用量约为1%-2%），轻轻摇动，悬浮细胞，然后于30℃摇床轻轻震荡培养50min，每隔20 min取样于相差显微镜下观察，绘图并计数原生质体的形成率（按下列公式计算）。
待90%以上细胞都形成原生质体后，离心去除酶液，并用0.6mol/LNaCl洗涤1次，用10mL0.6mol/LNaCl将原生质体制成悬液，备用。
原生质体形成率=原生质体数/（原生质体数+完整细胞数）×100%1.4.2 原生质体的融合①加入助溶剂将双亲原生质体悬液（5×107-10×107个/mL）各3mL混合于8ml的离心管，离心（3000r/min，10min）弃上清后，加入3mL助融剂，轻轻震荡，悬浮原生质体并置25℃恒温水浴保温20min。
每隔3-4min轻轻摇动一次，使助溶剂与原生质体充分接触，然后立即加入8mL高渗YEPD培养基，离心（6000r/min，10min），弃上清液可获得融合沉淀物（即原生质体融合物）。
②稀释及涂布用0.6mol/LNaCl悬浮以上获得的原生质体融合物，并进行稀释至10-3，分别从10-2、10-3中取0.1mL，涂于YNB基本培养基平板上。
③选择融合子及计算融合频率将以上培养物于25℃培养2d，从长出的菌落中选出融合子。
另取等量稀释液用相同方法于再生完全培养基（YEPD高渗培养基）中培养后，并计算菌落数。
融合频率=（融合子数×稀释倍数）/再生完全培养基上长出的总菌落数×稀释倍数1.4.3 原生质体的再生将双亲原生质体悬液用0.6mol/LNaCl稀释至10-5，取0.2mL涂布于高渗YEPD培养基。
对照用无菌水稀释原生质体，均匀涂布于YEPD培养基。
25℃培养48h，分别记录长出的菌落数，计算原生质体的再生率。
原生质体的再生率=（高渗YEPD长出的菌落数-YEPD长出的菌落数）/显微镜计数的原生质体数2.结果与分析2.1 原生质体形成率用新鲜配制的去壁酶液5ml，轻轻摇动，悬浮细胞，然后于30℃摇床轻轻震荡培养50min，计数原生质体的形成率：原生质体形成率=原生质体数/（原生质体数+完整细胞数）×100% 结果如表1所示。
2.339和2.70两种菌株的原生质体的形成率分别为77.68%和96.51%，说明两种菌株的原生质体形成率相差不大。
说明酶水解去壁取得了良好的效果。
表1 原生质体形成率结果2.339 1.165×1099.05×10877.68%2.7 1.245×109 1.29×10996.51% 2.2 原生质体再生将双亲原生质体悬液用0.6mol/LNaCl稀释至10-5，取稀释液涂布于高渗YEPD培养基。
对照用无菌水稀释原生质体，均匀涂布于YEPD培养基。
25℃培养48h，分别记录长出的菌落数，计算原生质体的再生率：原生质体的再生率=[（高渗YEPD长出的菌落数-YEPD长出的菌落数）/显微镜计数的原生质体数] ×100%结果如表2所示。
2.339由于菌株在平板上长得非常密集导致无法计数，使原生质体再生率无法计算。
2.7菌株原生质体的再生率为75.2%，说明2.339菌株的原生质体再生率要更优于2.70菌株。
表2 原生质体的再生结果表酿酒酵母菌株YEPD长出的平均菌落数高渗YEPD长出的平均菌落数显微镜计数的原生质体数原生质体的再生率2.339 无数4480 1.165×109无法计算2.70 1242 1812 1.245×10945.78×10-6 2.3 原生质体融合频率将双亲原生质体悬液混合于离心管，离心弃上清后，加入3mL助融剂，轻轻震荡，悬浮原生质体并置25℃恒温水浴保温20min。
每隔3-4min轻轻摇动一次，然后立即加入高渗YEPD培养基，离心，弃上清液即得原生质体融合物：融合频率=[（融合子数×稀释倍数）/再生完全培养基上长出的总菌落数×稀释倍数]×100%融合结果如表3所示。
两菌株融合后，稀释度为10-2的菌株原生质体融合频率为27.07%，稀释度为10-3的菌株原生质体融合频率为42.55%，说明稀释度为10-3的菌株原生质体融合频率更高。
表3 原生质体融合结果稀释倍数融合子数平均数再生完全培养基上长出的平均总菌落数融合频率稀释10-214405320 27.07%稀释10-3868204042.55%3.讨论原生质体融合技术为遗传操纵、分子生物学和基础理论研究提供了一种重要工具,也为遗传育种提供了一种有效手段,已广泛应用于微生物育种工作的各个方面。
近年来,灭活原生质体融合、离子束细胞融合、非对称细胞融合以及基因重排分子育种等新方法相继提出并应用于微生物育种,这是原生质体融合技术的新发展。
相信随着技术的不断完善,原生质体融合在生物育种中占有的地位会越来越重要。
原生质体融合技术在生产实践中的应用产生的效益,已是举世瞩目,它已成为高新技术开发的重要领域。
该技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制理念等领域的研究提供了有力的手段,而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值。
通过原生质体融合进行细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。
参考文献：[1] 杜金华, 张开利, 张锦丽, 等. 嗜杀苹果酒酵母的构建[J]. 食品与发酵工业, 2002,28(5):1-5[2] 庞小燕, 王吉瑛, 赵凤生, 等. 构建直接发酵淀粉产生酒精的酵母融合菌株的研究[J].生物工程学报, 2001, (2):21-22[3] 彭帮柱, 岳田利, 袁亚宏, 等. 酵母菌原生质体融合技术[J]. 西北农业学报, 2004,13(1) : 101-103。