第4章 抗体的制备及处理1
抗体的制备
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C、凝胶层析法：利用凝胶的多孔网状结构， 大分子在凝胶颗粒间很快通过，小分子 进入网孔，难于洗脱，将抗原分为大、 中、小三种。属区带分离法。
D、离子交换层析：利用带离子基团的纤 维或凝胶，吸附带相反电荷的抗原。
凝胶过滤层析( 分子筛)的作用机理
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E、亲和层析：利用生物学分子间所具有的 专一亲和性而设计的层析方法。Ag-Ab, 激素-受体，酶-酶配体，酶蛋白-辅酶。
但完全福氏佐剂局部注射因易形成肉 芽肿和持久溃疡而不用于人体免疫。
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(四)免疫动物
+ 为获取高质量(特异性强和效价高)的 抗体，除了需制备质量好纯度高的抗 原外，还需选择适宜的动物和设计有 效可行的免疫方案，如抗原的剂量、 剂型、注射途径、注射次数、注射间 隔和接种动物的年龄均与免疫效果密 切的关系。
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B、冷热交替法：将材料投入沸水中，90 ℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中。 在细菌或病毒中提取蛋白质及核酸可用 此法。
C、超声波破碎法：是利用超声波的机械振 动而使细胞破碎的方法。微生物和组织 细胞破碎多用此法，但真菌厚膜孢子则 较难打破。
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D、酶处理法：酶在一定的条件下能消化 细菌和细胞。例如在碱性(pH8.0)下，溶 菌酶可专一破坏G+菌细胞壁。此法适用 于多种微生物。
C、新鲜血去除纤维蛋白原后按B处理。
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(2)细菌抗原的制备：取标准菌株，接种。 H抗原：取有动力的菌株液，用 0.3~0.5%甲醛处理。 O抗原：菌液于100℃2.5h。 Vi抗原：杀菌后，加入1%的氯化钙溶 液。
(3)虫卵也可作为抗原，例如日本血吸虫 卵悬液。
抗体制备流程
抗体制备流程1. 引言抗体制备是生物医学研究领域中常用的实验技术之一。
通过制备特定的抗体，我们可以用于检测特定的蛋白质、细胞或其他分子，从而在研究中获得更加准确和可靠的结果。
本文将详细介绍抗体制备的流程，包括免疫原制备、动物免疫、抗体纯化等几个主要步骤。
2. 免疫原制备2.1 选择免疫原免疫原是指能够引起机体免疫系统产生抗体反应的物质。
在选择免疫原时，需要考虑以下几个因素：•目标蛋白质：免疫原应该是目标蛋白质或其片段，可以是纯化的蛋白质、合成的多肽或重组蛋白等。
•抗原性：免疫原应该具有足够的抗原性，能够激发免疫系统产生抗体反应。
•稳定性：免疫原应该具有足够的稳定性，可以在制备和储存过程中保持其完整性和活性。
2.2 免疫原制备制备免疫原的方法多种多样，常见的包括以下几种：1.纯化蛋白质：从细胞或组织中纯化目标蛋白质，获取单一纯度的免疫原。
2.合成多肽：根据目标蛋白质的氨基酸序列合成相应的多肽片段，作为免疫原使用。
3.重组蛋白：利用基因工程技术在表达系统中表达目标蛋白质的重组形式，作为免疫原。
3. 动物免疫3.1 动物选择选择合适的动物作为免疫宿主是成功制备抗体的重要因素。
常用的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子、鸡等。
选择免疫动物时需要考虑以下几点：•易于操作：动物应该易于操作和养护，能够适应实验室环境。
•免疫系统：动物的免疫系统应该对免疫原有良好的反应。
•抗原性：动物对免疫原应有较好的抗原性，能够产生高效的抗体反应。
3.2 免疫程序动物免疫的程序通常包括以下几个步骤：1.初次免疫：将制备好的免疫原与适当的佐剂混合，注射到动物体内。
注射的途径通常选择腹腔或皮下注射。
2.强化免疫：在初次免疫后，根据需要可以进行一定次数的强化免疫，以提高免疫效果。
3.血清采集：在免疫程度达到一定水平后，从动物体内采集血清，其中含有目标抗体。
4.抗体效价测定：通过合适的方法，测定血清中目标抗体的效价。
4. 抗体纯化4.1 抗体提取通过离心等方法，将血清中的抗体分离出来。
抗体的制备原理及其应用实验
抗体的制备原理及其应用实验1. 引言抗体是一类由人体或动物体内产生的免疫分子，具有识别并结合特定抗原的能力。
抗体的制备原理包括免疫原制备、免疫动物的选择、免疫方法、抗体纯化和鉴定等。
在实验室中，抗体的制备得以广泛应用于生物学、医学以及其他领域的研究和实验中。
2. 抗体制备的基本原理抗体制备的基本原理是通过免疫动物对抗原的免疫反应，使其体内产生特异性抗体。
具体步骤如下：•第一步：免疫原制备–收集目标抗原，如蛋白质或多肽片段。
–对抗原进行纯化和浓缩，确保纯度和活性。
•第二步：免疫动物的选择–选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子或大鼠等。
–考虑动物的抗原相似性和体积适宜性。
•第三步：免疫方法–给免疫动物注射抗原，刺激其免疫系统产生抗体。
–定期采集免疫动物的血样，分离抗体。
•第四步：抗体纯化和鉴定–使用技术如亲和层析、离子交换层析等纯化抗体。
–使用免疫学方法验证抗体的特异性和活性。
3. 抗体应用实验抗体的制备在实验中具有广泛的应用价值，以下列举了一些常见的抗体应用实验：•酶联免疫吸附（ELISA）–抗体可用于ELISA实验，通过与特定抗原结合来检测其存在和浓度。
–ELISA广泛应用于血清学、药物检测、疾病诊断等方面。
•免疫组织化学（IHC）–抗体可用于IHC实验中，通过与组织中的抗原结合来检测其在组织中的位置和表达水平。
–IHC可用于病理学研究、癌症诊断等领域。
•免疫印迹（Western Blot）–抗体可用于Western Blot实验，通过与目标蛋白结合来检测其在细胞或组织中的表达水平。
–Western Blot广泛应用于蛋白质研究和疾病诊断等方面。
•流式细胞术–抗体可用于流式细胞术实验，通过与细胞表面或内部特定抗原结合来分析细胞的类型和数量。
–流式细胞术在免疫学、细胞生物学研究中得到广泛应用。
•免疫疗法–抗体可用于免疫疗法中，通过结合肿瘤细胞表面的抗原，识别和杀伤肿瘤细胞。
–免疫疗法是目前肿瘤治疗的重要方法之一。
抗体制备流程
抗体制备流程一、背景介绍抗体是免疫系统产生的一种蛋白质，具有高度的特异性和亲和力，广泛应用于生命科学领域。
抗体制备是指从动物血清或单克隆细胞中提取纯化抗体的过程。
本文将介绍抗体制备的详细流程。
二、材料准备1. 动物：常用小鼠、大鼠、兔子等；2. 抗原：根据实验需要选择适当的抗原；3. 组织破碎液：可以使用高渗盐溶液、甘油等；4. 纯化柱：可以使用蛋白A/G，蛋白L等；5. 色谱柱：可以使用离子交换柱、大小分离柱等。
三、抗原制备1. 合成或提取目标分子作为抗原；2. 重组表达目标分子作为抗原；3. 从组织或细胞中提取目标分子作为抗原。
四、动物免疫1. 免疫前处理：（1）对动物进行基础检查，确保健康状态良好；（2）按照实验需要确定免疫计划，如免疫次数、免疫间隔等；（3）根据实验需要选择适当的免疫方式，如皮下注射、腹腔注射等。
2. 免疫过程：（1）将抗原与佐剂混合后注射到动物体内；（2）在免疫后的一定时间内采集血清；（3）根据实验需要重复进行免疫。
五、抗体检测1. 间接ELISA法：将抗原固定于微孔板上，加入动物血清进行反应，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
2. Western blotting法：将蛋白质分离并转移至膜上，然后加入动物血清进行反应，最后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
3. 免疫组化法：将组织切片或细胞涂片固定并处理后，加入动物血清进行反应，最后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
六、抗体纯化1. 亲和层析法：利用特异性结合亲和剂纯化目标抗体，如蛋白A/G、蛋白L等；2. 离子交换层析法：利用抗体表面带电性质与离子交换树脂上的离子进行吸附和洗脱；3. 大小分离层析法：利用抗体的分子量差异与分子筛或凝胶过滤树脂进行分离。
七、抗体保存1. 冷冻保存：将纯化后的抗体溶液加入甘油后冷冻保存在-20℃或-80℃；2. 溶液保存：将纯化后的抗体溶液加入保护剂后在4℃下保存。
八、总结以上就是抗体制备的详细流程，其中包括了材料准备、抗原制备、动物免疫、抗体检测、抗体纯化和抗体保存等步骤。
抗体的制备与使用指南
抗体的制备与使用指南一、抗体的制备。
1. 免疫原的选择。
- 对于制备抗体，首先要确定合适的免疫原。
如果是针对蛋白质抗原，要保证其纯度尽可能高。
例如，从细胞裂解物中纯化目标蛋白，可以采用亲和层析等方法。
对于小分子半抗原（如药物分子等），通常需要将其与大分子载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联，以增强其免疫原性。
- 免疫原的剂量也很关键。
一般来说，初次免疫时，对于小鼠等小动物，蛋白质抗原的剂量可在10 - 100μg之间，具体剂量需要根据抗原的性质和动物的种类进行优化。
2. 动物的选择与免疫。
- 动物选择。
- 常用的动物有小鼠、大鼠、兔子等。
小鼠因为繁殖快、成本低，是实验室制备单克隆抗体时常用的动物。
兔子则常用于制备多克隆抗体，其血清中抗体产量相对较高。
- 免疫程序。
- 对于小鼠，初次免疫可采用皮下注射或腹腔注射的方式。
以皮下注射为例，可在小鼠背部多点注射免疫原。
初次免疫后，间隔2 - 4周进行加强免疫，加强免疫的剂量可以适当减少，一般为初次免疫剂量的1/2 - 1/3。
经过2 - 3次加强免疫后，可检测动物血清中的抗体效价。
3. 单克隆抗体的制备。
- 细胞融合。
- 在小鼠免疫后，取其脾脏细胞（其中含有产生抗体的B淋巴细胞），与骨髓瘤细胞（如SP2/0细胞系）在聚乙二醇（PEG）的作用下进行融合。
融合后的细胞具有两种细胞的特性，既能产生特异性抗体，又能在体外无限增殖。
- 筛选阳性克隆。
- 利用次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺陷型的骨髓瘤细胞和HAT （次黄嘌呤 - 氨基蝶呤 - 胸腺嘧啶核苷）选择培养基进行筛选。
在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因为缺乏HGPRT酶而死亡，未融合的脾细胞在体外不能长期存活，只有融合成功的杂交瘤细胞能够生长。
然后通过ELISA等方法筛选出产生特异性抗体的阳性克隆。
- 克隆化培养。
- 对筛选出的阳性克隆进行克隆化培养，常用的方法有限稀释法和软琼脂平板法。
限稀释法是将细胞悬液进行连续稀释，使每个孔中理论上只含有一个细胞，然后培养这些细胞，形成单克隆的细胞集落，从而得到稳定分泌特异性抗体的单克隆细胞系。
抗体制备流程
抗体制备流程抗体制备是一种用来生成特定抗体的实验方法，用于检测、治疗和研究各种疾病。
以下是一种通用的抗体制备流程，包括抗原选择、免疫动物的选择与处理、抗体的制备和纯化等步骤。
首先，我们需要选择合适的抗原。
抗原是导致免疫反应的物质，通常是一种蛋白质。
抗体的选择性依赖于抗原的选择性，因此我们需要选择具有高选择性且易于纯化的抗原。
接下来，我们需要选择合适的免疫动物。
常见的免疫动物包括小鼠、兔子和大鼠等。
选择免疫动物时，需要考虑抗原在动物体内的免疫原性、免疫系统的相似性以及免疫动物的体积等因素。
在选择好免疫动物后，我们需要对其进行处理。
通常情况下，我们会注射抗原到免疫动物体内，同时加入适当的免疫增强剂，以提高抗原的免疫原性。
接种后，我们需要在一定时间间隔内反复注射多次，以激发免疫反应。
在反复注射抗原后，我们需要等待一段时间，使得免疫系统产生足够多的抗体。
这个时间因免疫动物的类型和免疫原性而有所不同。
待免疫系统产生足够多的抗体后，我们需要将免疫动物进行牺牲，并从其体内获得免疫血清。
免疫血清是含有大量抗体的血液，在实验中可以用来检测和纯化抗体。
获得免疫血清后，我们需要对其进行抗体的制备和纯化。
首先，我们可以通过离心等方法去除血液中的红细胞等非细胞成分。
接下来，我们可以采用亲和层析和凝胶过滤等方法，将目标抗体从血液中纯化出来。
在纯化抗体后，我们可以对其进行鉴定和评估，以确保其质量和活性。
常用的鉴定方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和Western blotting等。
最后，我们可以将纯化的抗体用于实验中。
抗体可以用于检测特定抗原的存在，也可以用于治疗疾病，比如单克隆抗体疗法。
总结起来，抗体制备流程包括抗原选择、免疫动物的选择与处理、抗体的制备和纯化等多个步骤。
这一流程需要耗费一定的时间和资源，但是通过这一流程我们可以获得高质量和高选择性的抗体，从而用于检测、治疗和研究各种疾病。
抗体制备流程
抗体制备流程抗体制备是生物学研究中常见的实验技术之一，也是一项复杂而精细的工作。
下面将介绍抗体制备的一般流程，以供参考。
1. 抗原制备。
首先，需要准备抗原。
抗原可以是蛋白质、多肽、细胞膜蛋白等。
通常情况下，我们会通过基因工程技术来表达和纯化抗原蛋白。
在这一步骤中，需要注意保持抗原的天然构象和活性。
2. 免疫动物的选择。
选择合适的免疫动物也是非常重要的。
常见的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子等。
在选择免疫动物时，需要考虑到免疫动物的体积、生理特征、抗原的种类等因素。
3. 免疫程序。
将制备好的抗原充分混合并与免疫动物进行免疫。
免疫的途径可以是皮下注射、腹腔注射等。
在免疫过程中，需要根据实验要求进行多次免疫，以提高抗体的效价。
4. 血清收集。
在完成免疫程序后，需要定期采集免疫动物的血清样本。
血清中含有免疫动物产生的抗体，可以用于后续的实验。
5. 抗体纯化。
从采集到的血清样本中，可以通过蛋白A/G亲和层析柱或其他纯化手段来纯化抗体。
纯化后的抗体可以用于酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹（Western blot）等实验。
6. 抗体鉴定。
鉴定纯化后的抗体的效价和特异性也是必不可少的步骤。
常用的鉴定方法包括ELISA、Western blot、免疫组化等。
7. 抗体保存。
最后，需要将鉴定合格的抗体进行分装并保存。
在保存过程中，需要注意避免抗体的冻融循环，以保证抗体的稳定性和活性。
总结。
抗体制备是一项复杂的实验技术，需要研究人员具备扎实的实验技能和丰富的经验。
在实验过程中，需要严格控制各个步骤的条件和参数，以保证抗体的质量和稳定性。
希望本文介绍的抗体制备流程能对您有所帮助。
抗体的制备实验报告
一、实验目的本实验旨在了解抗体的制备原理和方法，掌握多克隆抗体制备过程，为后续的免疫学研究和应用提供实验基础。
二、实验原理抗体是机体免疫系统识别和清除抗原的重要物质。
抗体由B淋巴细胞分化而来的浆细胞产生，具有特异性结合抗原的能力。
根据抗体来源和特性，可分为单克隆抗体和多克隆抗体。
本实验主要制备多克隆抗体。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）抗原：猪链球菌全菌抗原（2）免疫动物：成年家兔（3）佐剂：福氏佐剂（4）抗体检测试剂：酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒2. 实验仪器：（1）恒温培养箱（2）低温高速离心机（3）酶标仪（4）微量移液器（5）恒温水浴锅四、实验方法1. 免疫动物的选择与处理选择健康的成年家兔4只，进行适应性饲养，适应新环境后，进行免疫。
2. 免疫抗原的制备将猪链球菌全菌抗原与福氏佐剂等比例混合，制备成抗原悬液。
3. 免疫注射将制备好的抗原悬液分别注入4只家兔的皮下，每组注射2ml。
注射后观察动物的反应，如有异常，及时处理。
4. 免疫程序免疫注射后，每隔7天进行一次加强免疫，共进行3次。
5. 抗体采集免疫注射结束后，于第28天采集家兔血液，分离血清。
6. 抗体检测采用ELISA方法检测血清中的抗体水平，以确定抗体产生情况。
五、实验结果与分析1. 免疫动物的反应免疫注射过程中，家兔出现不同程度的局部肿胀和红斑，但无严重反应。
2. 抗体检测ELISA结果显示，免疫后28天，家兔血清中抗体水平达到最高，表明抗体产生成功。
六、实验结论本实验成功制备了多克隆抗体，为后续的免疫学研究和应用提供了实验基础。
七、实验讨论1. 免疫动物的选择与处理选择健康的成年家兔作为免疫动物，确保实验结果的可靠性。
2. 免疫抗原的制备抗原的制备质量直接影响到抗体的产生。
本实验采用猪链球菌全菌抗原，确保抗原的有效性。
3. 免疫程序免疫程序的设置应根据抗原特性和动物个体差异进行调整，以获得最佳免疫效果。
4. 抗体检测ELISA方法具有灵敏度高、特异性强等优点，适用于抗体水平的检测。
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单克隆抗体的应用
检验医学诊断试剂 ① 病原微生物抗原、抗体的检测 ② 肿瘤抗原的检测 ③ 免疫细胞及其亚群的检测 ④ 激素测定 ⑤ 细胞因子的测定
肿瘤的导向治疗—生物导弹 蛋白质的分离纯化
抗 原 31 2 4
免疫
BA LB /c
1234
31 2 4
传统抗血清
所有抗体混合
B 細胞 1
3 2
4
瘤細胞
思考题
n 细胞融合技术的发展及应用进展 n 用于细胞融合的酶缺陷骨髓瘤细胞株筛选方法
2. 细胞准备
细胞融合
☆骨髓瘤细胞
•☆免选疫择脾对细数胞生长期的细胞进行传代培养 •••••••••••••☆饲细活避注存无拉无无脾计细常其饲养胞细免意于血颈菌血或数胞用中养细形胞细切清处取清淋、密小巨存-8胞0态计胞忌培死脾培巴备度鼠噬活℃浑数返过养小（养细用过腹细一或圆祖多液鼠或液胞低腔胞般液、，传洗，淋吹，不细还不氮透定代，酒巴出洗利胞有超中亮期培计精结法2于作清过～、用养数消）或细饲除23周均，，毒筛胞养死8次，-A一可备网生细亡不G、将用法长胞细处影排细研，胞理响列胞磨的2细×杂整分法作胞1交齐装游用0瘤4冻离细
（五）抗体效价的测定
1. 融合前 ELISA 效价（必须）和特异性（非必须）
2. 融合筛选时 ELISA，取样时防止污染 阳性（必须），阴性（必须），特异性 （非必须）
（六）抗体的保存
1. 同多克隆抗血清
☆56℃灭活30min，可加1/10000硫柳汞或 1/1000叠氮钠防腐
n 除菌后，4℃，3个月～半年 加甘油可延长保存期
胞的纯化
3. 细胞融合
细胞融合
• 取对数分裂期SP2/0与免疫鼠脾细胞，比例 为1:5～1:10，无血清培养基洗三次
• 1ml 50%的PEG（预温）在1分钟内滴完,静 置90秒,时间一到,将事先准备的无血清培养 液分步加入,终止PEG作用
• 加入HAT培养基（或24h后加HAT）, 分加 到96孔培养板（ 105个/孔）
食品免疫学检测技术
第四章 抗体的制备及处理
第一章 绪论 第二章 抗原 第三章 抗体
第四章 抗体的制备及处理
第五章 常见免疫学检测技术 第六章 免疫学检测技术在食品检测中的应用
第四章 抗体的制备及处理1（2学时）
l 第一节 多克隆抗体的制备 l 第二节 单克隆抗体的制备
第一节 多克隆抗体的制备
多克隆抗体(pAb)是研究和诊断领域广泛使用的 有效工具，主要用于免疫印迹、放免、ELISA、 间接和直接荧光抗体试验、红细胞凝集试验、 免疫组化、免疫沉淀试验、免疫扩散、亲和层 析、酶学以及分离基因产物等 多克隆抗体是由多个B细胞克隆产生的，针对某 一复杂抗原多个表位的不同抗体的混合物，又 称抗血清或免疫血清
多克隆抗体的制备
由不同B细胞克隆产生的针对抗原 上多种抗原决定簇的多种抗体混 合物
一、制备多克隆抗体的基本条件
抗原 实验动物 免疫 抗血清鉴定 抗血清收集 抗血清保存
二、多克隆抗体制备流程
（一）免疫原的制备 （二）实验动物的选择 （三）免疫的实施 （四）免疫血清的收集/采血 （五）免疫血清的鉴定/筛选 （六）免疫血清的保存
未融合的 脾细胞
骨髓瘤-骨髓 瘤杂交细胞
脾-脾杂交 细胞
四、单克隆抗体制备的流程
（一）免疫原的制备 （二）免疫的动物 （三）免疫的实施 （四）采血 （五）抗体效价的测定 （六）抗体的保存 （七）细胞融合 （八）抗体生产
（一）免疫原的制备
1. 参见第2章（抗原） 2. 制备单克隆抗体对免疫原的纯度要求不是
髓瘤细胞融合 4. 兔：兔B细胞和兔骨髓瘤细胞融合
（三）免疫的实施
1. 免疫接种时间表 2. 免疫效果
血清效价、特异性
3. 冲击/加强免疫 效价符合要求à适当休息à冲击免疫 不加佐剂 静脉à3天后融合 腹腔à4天后融合
（四）采血
☆以小鼠为例 n 效价测定
断尾采血 1大滴 n 融合前放血（阳性血清） 眼眶，0.2ml 37℃，1h，4℃过夜，离心取血清 n 对照血清
☆剂量还与抗原种类、免疫途径、免疫次 数、免疫周期等其它条件关联
（三）免疫的实施
2. 免疫途径：静脉(i. v.)、肌肉（i. m.)、皮下 （s. c.)、腹膜内（i. p.)、皮内 (i. d.) 等 ☆静脉受抗原形式、物种、注射量限制 ☆腹腔注射途径在小鼠中经常使用 ☆皮下注射途径在兔等经常使用 ☆淋巴结、脾可直接注射 ☆足垫免疫也被使用 不同注射途径比较见表：
细胞DNA合成途径及HAT筛选原理
主要途径
次黄嘌呤（H） HGPRT
氨 基酸 谷氨酰胺 尿核苷单磷酸
鸟嘌呤核苷酸 胸腺嘧啶核苷酸
替代途径
A
TK
胸腺嘧啶核苷（T）
A：氨甲喋呤，为叶酸拮抗剂 TK：胸腺嘧啶核苷激酶
HGPRT：次黄嘌呤磷酸核糖转化酶
HAT作用的结果
SP2/0Байду номын сангаас 用8-AG筛选的 HGPRT- ，TK-，无限 增殖特性
（二）实验动物的选择
1. 抗原与免疫动物的亲缘关系，如兔、小 鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊、鸡等
2. 抗血清需要量 3. 动物性别、年龄
雌性攻击性小、低剂量免疫可能更敏感、 更高的循环抗体、较强的免疫反应 4. 抗原性质：蛋白质抗原对多数动物都适合 但一些特殊的如IgE对绵羊，胰岛素对家 兔，胃蛋白酶原对山羊，不易产生抗体
6. 影响细胞融合的因素
• 细胞生长状态 • 骨髓瘤和淋巴细胞比例 • PEG • 血清质量 • 细菌、霉菌、支原体等污染 • 操作手法 • 筛选时机
细胞融合
（八）抗体生产
1. 体外培养法 2. 悬动浮物培体养内诱生法
固腹相水载制体备培，养抗体浓度可达2～5mg/mL 灭菌石蜡油致敏，0.5ml/只à，1～2周后每 只小鼠腹腔注射2×106个杂交瘤细胞，7～ 10天后，当小鼠腹部膨胀且行动迟缓时抽 取腹水， 3000rpm离心10min，弃去脂 肪，收集中间澄清腹水，冻存备用
（三）免疫的实施
4. 抗原注入的体积
（四）免疫血清的收集/采血
☆及时、采前禁食24h n 颈动脉采血
家兔、山羊 n 心脏采血
豚鼠、大鼠、鸡 n 静脉多次采血
家兔耳缘静脉、山羊颈静脉
（五）免疫血清的鉴定/筛选
1. ELISA 2. 双向琼脂扩散 3. 凝集试验
（六）免疫血清的保存
☆56℃灭活30min，可加1/10000硫柳汞或 1/1000叠氮钠防腐
三、杂交瘤细胞的筛选原理（HAT筛选法）
n 细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途 径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的 合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过 程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合 成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它 是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核 苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两 种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个 效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺 乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细 胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤— 鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途 径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖 而很快死亡。唯有融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途 径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在 HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖
脾细胞: 正常细胞， HGPRT+ ，TK+ ， 5~10天自然死亡
HAT
杂交瘤细胞: 从脾细胞 获得了HGPRT+ 和 TK+，可无限增殖
8-氮鸟嘌呤筛选HGPRT缺陷株原理
n HGPRT是嘌呤核苷酸合成替代途径的关键酶， 可直接利用次黄嘌呤进行核酸的应急合成。但 HGPRT可把嘌呤类似物8-氮鸟嘌呤掺入核酸中， 对细胞的核酸合成产生干扰作用
n 用于细胞融合的骨髓瘤细胞，先用8-氮鸟嘌呤的 培养基培养，正常的细胞能将8-氮鸟嘌呤掺入核 酸中而干扰核酸的合成，因此全部死亡；而少数 HGPRT缺陷型却能存活下来
n 同理，也可用5-溴-2-脱氧尿嘧啶筛选TK酶缺陷 株用于细胞融合
细胞融合的结果及命运
未融合的骨 髓瘤细胞
骨髓瘤-脾 杂交瘤细胞
（三）免疫的实施
3. 免疫间隔时间：是抗血清制备中的重要因 素，特别是首免和二免 ☆若在抗原识别阶段，B细胞正在增殖，如 过早注入抗原，可能会引起免疫抑制 ☆一般首免和二免间隔10～20天，以后间 隔7～10天 ☆免疫次数可达5～8次，半抗原可能需要 较长时间
（三）免疫的实施
4. 抗原注入的体积
（一）免疫原的制备
1. 免疫原制备方法参见第2章（抗原） 2. 制备多克隆抗体对免疫原的纯度要求十分
严格，一般要求电泳纯或层析纯。纯度越 高，特异性越好 3. 考虑抗原的大小、聚集状态及构象状态 >5kDa、小的多肽、是否天然蛋白 4. 避免细菌污染和杂质混入（如内毒素，影 响免疫应答的一些化合物）
m m
m m
细胞融合
1 23
4
阳性筛选
12 34
克隆 培养
各抗体分开
一、单克隆抗体制备的原理
抗体由B细胞合成，每个B细胞含有合成一种抗 体的基因 抗原分子上不同表位分别激活具有不同基因的B 细胞 筛选出分泌专一抗体的B细胞，克隆化培养 B细胞不能体外培养，但骨髓瘤细胞能在体外无 限增殖 应用杂交瘤技术将两者融合，得到杂交瘤细胞 杂交瘤细胞扩大培养，获得单克隆抗体