慢病毒载体介导的RNA干扰抑制PC12细胞MyD88基因的表达

解剖科学进展　Progress of Anatomical Sciences　2010 Mar,16(2):131~134慢病毒载体介导的RNA干扰抑制PC12细胞MyD88基因的表达*崔万鹏，刘晓湘，方秀斌（中国医科大学 基础医学院神经生物学教研室， 辽宁 沈阳 110001） 【摘要】　目的　研究慢病毒介导的RNA干扰对PC12细胞的转染效率和对MyD88基因的抑制效率。

方法　构建针对大鼠MyD88基因3个靶点的ShRNA慢病毒载体，PC12细胞按照不同的转染条件分为 正常组（DMEM完全培养液）、DMEM加入polybrene组、EN.iS（Enhance infection solution）组、EN.iS加入polybrene组。

荧光显微镜下观察不同组的转染效率，采用Real-time PCR和Western blot检测不同的靶点对MyD88的不同沉默效率。

结果　病8毒滴度为1 × 10 TU/ml，MOI为100时，PC12细胞在EN.iS组的转染效率最高，转染试剂polybrene对转染效率无明显影响，沉默效率最高的靶点是5'-CATAC GCAACCAGCAGAAA-3'。

结论　慢病毒介导的RNA干扰是一种高效的基因沉默手段，可以对PC12细胞中MyD88的功能进行长期的研究。

【关键词】　PC12细胞；慢病毒；RNA干扰；髓样分化因子初次应答基因88 【中图分类号】　Q189　【文献标识码】　A 【文章编号】　1006-2947（2010）02-0131-04Lentivirus mediated RNA interference knockdowns the expression of MyD88 in PC12 cells【Abstract】　Objective　To investigate the transfection efficiency of lentivirus and silencing efficiency of MyD88 by lentivirus mediated RNA interference in PC12 cell line. Methods　Recombinant lentivirus vectors with shRNA targeting rat myeloid differentiation primary response gene 88(MyD88) were constructed and transfected into pheochromocytoma cells (PC12) in vitro, the tranfection efficiency was observed under fluorescence microscope and the expression of MyD88 was 8determined by Real-time PCR and Western Blot respectively. Results　The viral titer of lentivirus was 1×10 TU/ml and the MOI(multiplicity of infection) was 100, PC12 cells exhibited the highest transfection efficiency in enhanced infection solution(EN.iS), with no remarkable effect on the transfection efficiency in the presence of the transfection reagent polybrene. According to the result of Real-time PCR and Western Blot, the most efficient targeting sequence was 5'-CATAC GCAACCAGCAGAAA-3'. Conclusion　Lentivirus mediated RNA interference is an effective means to silence gene expression in PC12 cells，which can generate stable transfected PC12 cell line with MyD88 expression knocking down.【Key words 】　Pc12 cell line; lentivirus; RNA interference; myeloid differentiation primary response gene88*CUI Wan-peng，LIU Xiao-xiang，FANG Xiu-bin （Department of Neurobiology, China Medical University, Liaoning Shenyang 110001 China）[1]Lentivirus 是逆转录病毒的一种，可将自身携带作用。

近来研究发现，MyD88 基因敲除的小鼠在肾的基因整合如宿主基因组。

利用Lentivirus 构建的脏和心肌缺血再灌注中，能够大大减少炎症反应导[1]shRNA表达载体，与化学合成和基于瞬时表达载体致的组织损伤和功能紊乱。

我们通过RNA干扰抑制构建的shRNA相比，一方面可以替代瞬时表达载体PC12 细胞中Myd88的表达，建立稳定表达shRNA细使用，另一方面，可用于转染依靠传统转染试剂难胞株，研究氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation）于转染的原代细胞、悬浮细胞等，并且可以整合到导致的TLR4介导的MyD88依赖的信号通路的激活导被感染的细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

致的细胞损伤的体外模型。

MyD88作为 Toll-like receptor4（TLR4）的主要胞内接头蛋白，在TLR4激活引起的炎症反应中起到关键1　材料和方法1.1 材料和试剂 DMEM高糖培养基购自GIBCO，胎牛血清和马血【收稿日期】2009-11-17【基金项目】辽宁省高等学校科研项目（No.2008813） *通讯作者（To whom correspondence should be addressed）·132·解剖科学进展2010年第16卷第2期清购自杭州四季青公司。

PC12和293T细胞购自上海CAAGGGTTGGTAT-3'，扩增条件为95℃（30s），中科院细胞所。

Real-time PCR试剂盒SYBR Primscrip 40 cycles of 95℃（5s），60℃（34 s）and dissociation TM RT-PCR kit购自Takara公司。

兔抗大鼠MyD88多stage 95℃（15s），60℃（1 min），95℃（15s）。

克隆抗体购自美国Santa Cruz。

Lipofectamine 2000和Western blot 按照《分子克隆指南》相关操作进行，Trizol 购自invitrogen公司。

PGL SIL-GFP 重组载体，显色后照相。

pHelper 1.0和 pHelper 2.0 慢病毒包装质粒购自上海吉凯基因公司。

2　结果1.2 慢病毒载体的构建2.1 慢病毒滴度和最佳转染条件设计针对大鼠MyD88cDNA的三个靶点（Table 经扩增和纯化后，检测针对三个靶点的病毒的1），分别为合成含有茎环结构的DNA双链互补序列滴度分别为1.5E+9 TU/ml，2E+9 TU/ml，2E+9 TU/ml ，19-mer sequence 5'-TTCTCC GAACGTGTCACG-3'作阴性对照病毒滴度为5E+9 TU/ml。

转染96h后检测转为阴性对照，将合成的序列在90℃水浴退火15min。

染效率发现，MOI为100时，在EN.iS组转染12h获得用限制性内切酶Age I和EcoR I 消化PGL SIL-GFP 重较高的转染效率，超过85%（图1C），因此确定MOI 组载体，将合成的DNA片段用T 4连接酶，连入线性为100，转染培养液为Enhance infection solution，转染化的载体中。

然后将该质粒转入感受态的大肠杆菌试剂polybrene对转染效率没有影响。

中。

将已转化的感受态细胞接种到含Apm抗性的2.2 Real-time PCR和Western blot 结果LB琼脂培养基上，培养16h后进行阳性克隆的PCR鉴Real-time PCR结果显示，转染阴性对照病毒定，挑选阳性克隆送测序。

测序通过的质粒与（NC组）的PC12细胞MyD88表达量与对照组（Con pHelper 1.0 载体和pHelper 2.0 载体共转染进293T慢组）相比没有变化，转染携带针对靶点5'-CATAC 病毒包装细胞，培养48h后收集细胞培养上清，用离GCAACCAGCAGAAA-3'的shRNA的慢病毒（RNAi 心超滤装置收集、浓缩病毒，然后进行滴度测试。

组），mRNA的表达被显著下调（90±3）%（ <0.01）1.3 转染预实验（图2A），其余两个靶点的沉默效率均不理想，PC12细胞按照不同的转染条件分为正常组MyD88的下调效率不到70%。

因此选用该靶点进行（DMEM完全培养液）、DMEM加入polybrene组、Western blot检测MyD88在蛋白水平的表达。

Western EN.iS（Enhance infection solution）组、EN.iS加入blot 结果显示，与阴性对照（NC）和对照组polybrene组，分别在MOI（Multiplicity of Infection）（Control）相比，RNA干扰MyD88组（RNAi组），10，50 和100的情况下进行转染。

最佳转染条件和MyD88的表达量下调了（80±11）%（ <0.01）（图MOI值由慢病毒的最高转染效率来决定。

转染完2B，C）。

整体上通过RNA干扰，MyD88的表达被成12h将转染培养液换成DMEM高糖（含10%胎牛血功下调。

清。

5%的马血清）的完全培养液。

96h的时候在荧光显微镜下观察GFP在细胞中的表达情况，确定转染效率。

1.4 Real-time PCR 和Western blotReal-time PCR 按照Takara SYBR PrimscripTMRT-PCR kit说明书进行，采用双标准曲线的半定量方法检测MyD88在各组的表达情况。