氨基酸含量的测定茚三酮比色法PPT.ppt
实验三氨基酸蛋白质的性质鉴定ppt优选PPT文档
5%氯化汞（剧毒）3—5黄滴，蛋有什白么现象反？说应明什：么问黄题？色沉淀，这一反应为苯丙氨
5ml，加热煮沸1—2min，观察呈什么现象？溶液冷却后，加入过量浓氨水，又呈什么颜色？
酸、酪氨酸、色氨酸等苯环aa特有。 氢氧化钠（5%）、硫酸铜（1%）、谷氨酸（1%）
甘氨酸（1%）、鸡蛋白、茚三酮（0. 缩二脲反应呈紫色
解释：不同Pr硫酸另铵沉取淀饱1和%度谷不同氨酸2ml按上法加入同样试剂作对照实
2.
验，比较反应结果。 5ml，加热煮沸1—2min，观察呈什么现象？溶液冷却后，加入过量浓氨水，又呈什么颜色？
2%茚三酮溶液3—4滴，然后将两支试管放在沸水浴中加热8—10分钟，观察两支试管有什么现象发生？ 取2ml鸡蛋白溶液于试管中，慢慢加入等量硫酸铵饱和溶液，混合均匀，即成不饱和硫酸铵溶液，静置数分钟，则析出球蛋白，滤出沉 淀，向滤液中加入结晶硫酸铵，使其饱和（硫酸铵不再溶解为止），此时析出清蛋白。 2、茚三酮试剂制备：0.
解释：茚三酮反应：aa和Pr都显蓝色
2、缩二脲反应
蒸馏水中，两天内用完于，否一则失支效。试管中加入鸡蛋白溶液2ml，再滴加5% 氢氧化钠溶液至呈碱性，再加3—5滴1%硫酸铜溶 2%茚三酮溶液3—4滴，然后将两支试管放在沸水浴中加热8—10分钟，观察两支试管有什么现象发生？
1g茚三酮溶50ml
液，观察有何颜色？ 两支试管中，各加入蛋白质溶液1ml，然后一支试管中慢慢加入1%硫酸铜溶液几滴，另一支试管中加入0.
了解氨基酸及蛋白质的主要化学性质及检验方法 取2ml鸡蛋白溶液于试管中，慢慢加入等量硫酸铵饱和溶液，混合均匀，即成不饱和硫酸铵溶液，静置数分钟，则析出球蛋白，滤出沉 淀，向滤液中加入结晶硫酸铵，使其饱和（硫酸铵不再溶解为止），此时析出清蛋白。 5ml，加热煮沸1—2min，观察呈什么现象？溶液冷却后，加入过量浓氨水，又呈什么颜色？
纸层析法分离氨基酸16页PPT
主要试剂：
（1）展开剂 正丁醇:甲酸:水＝60:12:8。 （2）氨基酸标准溶液 2 g·L-1水溶液。 （3）茚三酮 1 g·L-1乙醇溶液。 （4）氨基酸混合试液 将（2）配制的三种氨基酸等量混合。
实验操作：
1.在层析缸中装入展开剂，其高度约1.5~2.0cm；
2.准备滤纸：戴上手套，取层析滤纸一张，在纸的另一端距 边缘3.0cm处用铅笔画一直线，在此直线上每隔2cm作一记 号，为点样位置（即原点）；
3.点样：用毛细血管依次将异亮氨酸，谷氨酸，赖氨酸和混 合样品分别滴在四个位置，点样干后再点一次； 注意事项：每个点在纸上扩散的直径，最大不超过3mm；
实验步骤 ——点 样
3.0cm
1234
异 亮赖 谷混 氨氨 氨合 酸酸 酸液 3.0cm
各点 φ≈2mm
实验目的 实验原理 仪器试剂 实验步骤 注意事项 思考题
赖氨酸
原点到层析斑点中 心的距离 原点到溶剂前沿的 距离
标准aaRf 混合aaRf
Байду номын сангаас
纸层析结果
异亮氨酸
谷氨酸
思考题： 1.纸层析法属于吸附层析还是分配层析，为什么？ 2.此三种氨基酸还能用什么层析方法进行分离，为什么？
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
纸层析法分离氨基酸
Rf：0~1， Rf值相差越大，分离效果越好。 本实验分离和鉴定的氨基酸混合液：异亮氨酸、 赖氨酸和谷氨酸。
无色物质的纸色谱可用光谱法（紫外光照射）或 显色法鉴定，氨基酸纸色谱图谱常用茚三酮或吲哚 醌作为显色剂，本实验采用茚三酮作为显色剂。
氨基酸含量测定和标准曲线制作(茚三酮法)
茚三酮比色法测定游离氨基酸含量原理：茚三酮与氨基酸的反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生二氧化碳､氨和醛，而水合茚三酮被还原成还原性茚三酮；第二步是所生成的还原性茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成成为蓝紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比｡磷酸缓冲液（pH.8.04）：称磷酸二氢钾4.5350 g，定容500 ml。
称NAH2PO4·12H2O11.9380 g分别溶解定容500 ml。
取磷酸二氢钾10 ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液2％茚三酮溶液：称取水合茚三酮 2 g，加水溶解后定容至 100 mL。
储成于棕色瓶中，避光保存。
0.25%抗坏血酸溶液：称取抗坏血酸 0.1 g，加水溶解后定容至 100 mL，现配现用，或者密封，冻存于-20 o C。
茚三酮反应液：取50 ml 2% 茚三酮，加入5 ml 0.25%的Vc，使用蒸馏水稀释到100 ml，密封储存在棕色瓶中。
亮氨酸标准液:称取 100 mg 亮氨酸（纯度不低于 99%）溶于 100 mL 水中，作为母液，此时亮氨酸的浓度为1 mg/mL。
茚三酮标准曲线制作溶液中氨基酸的浓度如果低于20 μg/ml，茚三酮显色反应将不能发生，故先配制不同浓度的氨基酸标准液，取十支试管，标号为1，2，3……10，按照下表配制1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1000 μg/ml亮氨酸超纯水 ml 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9 8.9 8.8 8.7 8.6 8.5 亮氨酸 终浓度μg/ml 405060708090100110120130140150使用螺旋盖（内垫）试管分别取上述浓度的氨基酸标准液1ml，空白对照使用1ml 超纯水替代氨基酸标准液，然后向各个试管中加入0.5 ml 的茚三酮反应液和0.5 ml 的磷酸缓冲液，盖好盖子悬紧，置于沸水浴中煮沸15 min，分别加入3 ml 的超纯水，斡旋混匀，测定吸光度，绘制标准曲线取一支中等程度显色的试管进行紫外和可见波段的全波长扫描，结果如下图所示3004005006007008000.00.10.20.30.40.50.60.7吸光度波长（nm ）403 nm565 nm选择565 nm 作为其最大吸收波长，测定各管的吸光度，弃去吸光度大于1的值 茚三酮终浓度（μg/mL） 565 nm 的吸光度 20 0.037 25 0.114 30 0.226 35 0.347 40 0.412 45 0.538 500.62155 0.692 60 0.754 65 0.834 700.968使用origin 8.5 绘制散点图并进行线性拟合，结果如下图所示0.00.20.40.60.81.0O D 565氨基酸浓度（μg/mL ）注意事项：1. 茚三酮比色受测定环境中的pH 影响很大，故每次测定前需要将样品溶液的pH 值调整到中性（pH7左右），2. 茚三酮不光可以与氨基酸反应，与蛋白质同样可以反应，因此需要在测定前去除溶液中的蛋白质，因此正确做法是：向样品溶液中加入等体积等0.6 mol/L 三氯乙酸，斡旋震荡，静置10 min 后，3000 rpm 离心10 min，取上清调整pH 值至中性pH7左右，再进行测定，3. 稀释倍数的确定：因为标准曲线的测定范围为20-70 μg/mL，即20-70 mg/L，所以在不清楚你所要检测样品中氨基酸的浓度时，最好取部分样品稀释10倍和100倍，分别检测原液、十倍稀释液和100倍稀释液的OD565，发现哪个水平下OD565落在标准曲线的范围内，从而判断需要对样品稀释多少倍4. 标准曲线测定时最好选择密封性较好的试管（螺旋盖硅胶内垫），同时需要检查气密性，防止水浴蒸发导致计量误差或者使用10 mL 具塞比色管，以方便在水浴之后可以准确补水。
氨基酸显色反应茚三酮反应.ppt
氨基酸显色反应---茚三酮反应
茚三酮ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ应
实验原理
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质 都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。 该反应十分灵敏，1：1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用 的氨基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮 被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分 于和氨缩合生成有色物质。
实验器材及试剂
器材： 试管、酒精灯、试管夹、试管架 试剂： (1)蛋白质溶液：2％卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清：水＝1：9) (2)0.5％甘氨酸溶液 (3)0.1％茚三酮水溶液 (4)0.1％茚三酮—乙醇溶液
实验步骤
(1)取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1毫升，再各加0.5毫升0.1％茚 三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1—2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。 (2)在一小块滤纸上滴一滴0.5％的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一滴0.1％ 的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
茚三酮法测氨基酸
茚三酮法测氨基酸 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT茚三酮显色法测定氨基酸的含量一．原理：凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。
第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
二．仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥容量瓶移液枪烧杯试管架试管水浴锅。
三．药品：（1）标准氨基酸溶液：配制成L 溶液（2），2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。
用pH 检查校正。
（3）茚三酮显色液：称取170mg 茚三酮和30mg 还原茚三酮，用20mL 乙二醇甲醚溶解（4）60％乙醇。
（5）样品液：每毫升含～50μg 氨基酸。
茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入活性炭，轻轻搅拌。
加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。
次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。
还原型茚三酮按下法制备：称取茚三酮，用沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。
将维生素C 用25mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。
滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。
乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。
四、操作步骤1．标准曲线的制作分别取L 的标准氨基酸溶液0，，，，，于试管中，用水补足至1mL。
KJ 茚三酮法测定氨基酸总量(“氨基酸”相关文档)共8张
试剂配制：讲义P32 （1）2%茚三酮溶液 （2）pH8.04的磷酸缓冲液 （3）氨基酸标准溶液：200μg/mL异亮
氨酸标准溶液。
（2）标准曲线的绘制及样品测定
单位：mL
1 2 3 4 5 6 7、8、9
水 1.6 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 1.0 （3）氨基酸标准溶液：200μg/mL异亮氨酸标准溶液。
实验七：茚三酮法测定氨基酸总量
1．实验原理 凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨
基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三酮共热 时，产生紫色化合物，最大吸收波长在570nm处，在 一定浓度范围内，颜色深浅与氨基酸含量成正比，可 用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：
2. 实验材料、仪器与试剂
氨基酸含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
氨基酸与加茚三水酮的至反1应0分m两L个刻步骤度： 线，静置15min后，在570nm处测定吸光值，以氨基酸含量
为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
Hale Waihona Puke 570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基酸含量成正比，可用比色法进行测定。 氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤： 实验材料、仪器与试剂
管，具塞刻度试管。 实验材料、仪器与试剂
仪器：可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管。 凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在
试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢 570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基酸含量成正比，可用比色法进行测定。
（3）氨基酸标准溶液：200μg/mL异亮氨酸标准溶液。 实验七：茚三酮法测定氨基酸总量 试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。
氨基酸含量的测定茚三酮比色法
凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、 氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三 酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在 570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基 酸含量成正比，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：
2. 实验材料、仪器与试剂 材料：酱油 仪器：可见分光光度计，分析天平，容量 瓶，移液管，具塞刻度试管。 试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、 磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。
各种试剂加到比色管后混匀，于电炉上沸水浴15min，取出冷却至室 温后加水至10mL刻度线，静置15min后，在570nm处测定吸光度， 以氨基酸含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
（3）样品测定
管号
8 9 10 11
样品溶液/mL 0 0.5 0.5 0.5
水/mL
1.6 1.1 1.1 1.1
3. 实验步骤
（1）样品的处理：准确吸取0.5mL酱油于100mL 烧杯中，加入5g活性炭和50mL蒸馏水，置于80℃ 水浴锅中，保持半小时后过滤，用蒸馏水将滤渣 清洗数遍，收集滤液于100mL容量瓶中，定容至 刻线，摇匀备用。
（2）标准曲线的绘制
管号
12 3 4 56 7
氨基酸标准溶液 /mL
求职应注意的礼仪求职时最礼貌的修饰是淡妆面试时最关键的神情是郑重无论站还是坐不能摇动和抖动对话时目光不能游弋不定要控制小动作不要为掩饰紧张情绪而散淡最优雅的礼仪修养是体现自然以一种修养面对两种结果必须首先学会面对的一种结果被拒绝仍然感谢这次机会因为被拒绝是面试后的两种结果之一
实验九 氨基酸含量的测定 （茚三酮比色法）
各是什么？
0 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
氨基酸含量的测定-茚三酮比色法
实验九 氨基酸含量的测定 （茚三酮比色法）
1. 实验原理
凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、 氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三 酮共热时，产生紫色化合物，最大吸收波长在 570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基 酸含量成正比，可用比色法进行测定。
氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：
（3）通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎 后的样品5g～10g或吸取液体样品5mL～10mL， 置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和5g左右的活性炭， 加热煮沸，过滤。用30mL～40mL热水洗涤活性 炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至刻度线， 摇匀备用。
6. 思考题 （1）茚三酮法测定氨基酸的原理是什么？ （2）试比较三种方法测定氨基酸含量的优缺点
2. 实验材料、仪器与试剂 材料：酱油 仪器：可见分光光度计，分析天平，容量 瓶，移液管，具塞刻度试管。 试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、 磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。
（3）样品测定
管号
8 9 10 11
样品溶液/mL 0 0.5 0.5 0.5
水/mL
1.6 1.1 1.1 1.1
磷酸盐缓冲液/mL 0.4 0.4 0.4 0.4
茚三酮/mL
0.4 0.4 0.4 0.4
按上表加样后混匀，按标准曲线的步骤进行 实验，在相同条件下测定样品的吸光度，并在标 准曲线上查（1）该法是微量法，对氨基酸的最低检出量可 达0.5μg，其其灵敏度高，重现性好。 （2）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色， 最大吸收波长在440nm处。
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氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：
2. 实验材料、仪器与试剂 材料：酱油 仪器：可见分光光度计，分析天平，容量 瓶，移液管，具塞刻度试管。 试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、 磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。
3. 实验步骤
（1）样品的处理：准确吸取0.5mL酱油于100mL 烧杯中，加入5g活性炭和50mL蒸馏水，置于80℃ 水浴锅中，保持半小时后过滤，用蒸馏水将滤渣 清洗数遍，收集滤液于100mL容量瓶中，定容至 刻线，摇匀备用。
6. 思考题 （1）茚三酮法测定氨基酸的原理是什么？ （2）试比较三种方法测定氨基酸含量的优缺点
各是什么？
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
4. 结果计算
5. 说明及注意事项
（1）该法是微量法，对氨基酸的最低检出量可 达0.5μg，其其灵敏度高，重现性好。 （2）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色， 最大吸收波长在440nm处。
（3）通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎 后的样品5g～10g或吸取液体样品5mL～10mL， 置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和5g左右的活性炭， 加热煮沸，过滤。用30mL～40mL热水洗涤活性 炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至刻度线， 摇匀备用。