黄酮3-羟化酶(F3H)的生物信息学分析

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鹤望兰黄烷酮3-羟化酶基因SrF3H的克隆及表达分析

鹤望兰黄烷酮３一羟化酶基因ＳｒＦ３Ｈ的克隆及表达分析
樊荣辉
３５００１３
黄敏玲
钟淮钦
吴建设，２，３
。
１福建省农业科学院作物研究所，福州，３５００１３；２福建省农业科学院花卉研究中心，福州，３５００１３；３福建省特色花卉工程技术研究中心福州通讯作者，ｈｕａｎｇｍｌ６１８＠１６３．ｔｏｍ
读框（ＯＲＦ），共】１２２个碱基，编码３７４个氨基酸。与其他物种的氨基酸序列都有一定的同源性，其中与高杯花的Ｆ３Ｈ同源性最高，达到８３％。系统进化树分析显示，鹤望兰ＳｒＦ３Ｈ与百合蛋白亲缘关系较近。应用半定量ＰＣＲ分析表明，ＳｒＦ３Ｈ在蓝色花瓣中表达最高，而在鹤望兰不同花发育阶段差异不明显。研究结果不仅为
分子植物育种，２０１４年，第１２卷，第１期，第１６８～１７２页
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＢｒｅｅｄｉｎｇ，２０１４，Ｖｏ１．１２，Ｎｏ．１，１６８～１７Ｒｅｐｏｒｔ
ｉｎｆｏｗｅｒｃｏｌｏｒ．Ｉｎｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈ，ｔｈｅｆｕｌｌ — ｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＦ３Ｈｇｅｎｅ（ＳｒＦ３Ｈ）ｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍＳｔｒｅｌｉｔｚｉａ

过量表达黄烷酮3-羟化酶基因(AaF3H)提高青蒿中青蒿素的含量

过量表达黄烷酮3-羟化酶基因(AaF3H)提高青蒿中青蒿素的含量张婷婷;马嘉伟;王路尧;唐克轩;李杉;赵静雅【摘要】黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)是参与黄酮类化合物合成过程的一个关键酶.为了研究青蒿中F3H对青蒿素的影响,从青蒿中克隆到黄烷酮3-羟化酶基因(AaF3H),全长为1 095 bp,编码364个氨基酸.SouthernBlot证实AaF3H基因在青蒿基因组中只有1个拷贝.通过构建AaF3H过表达载体并稳定转化青蒿来获得转基因株系,再采用HPLC测定过量表达AaF3H的转基因青蒿植株中的青蒿素含量.结果表明,过表达AaF3H转基因青蒿植株中青蒿素的含量显著升高.通过实时荧光定量PCR分析,在转基因青蒿中,作为青蒿素合成的关键酶,紫穗槐-4,11-二烯合成酶基因(AaADS)、紫穗槐-4,11-二烯氧化酶基因(AaCYP71AV1)和青蒿醛△11(13)双键还原酶基因(AaDBR2)的表达量显著提高.研究结果表明过量表达AaF3H基因是提高青蒿中青蒿素含量的有效方法.【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2018(008)001【总页数】8页(P55-62)【关键词】青蒿;黄烷酮3-羟化酶;过量表达;青蒿素【作者】张婷婷;马嘉伟;王路尧;唐克轩;李杉;赵静雅【作者单位】上海交通大学农业与生物学院,交大-复旦-诺丁汉植物生物技术研发中心,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,交大-复旦-诺丁汉植物生物技术研发中心,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,交大-复旦-诺丁汉植物生物技术研发中心,上海200240;上海交通大学农业与生物学院,交大-复旦-诺丁汉植物生物技术研发中心,上海200240;华南理工大学生物科学与工程学院,广州510006;上海交通大学农业与生物学院,交大-复旦-诺丁汉植物生物技术研发中心,上海200240【正文语种】中文青蒿素是从青蒿(Artemisia annua L.)中分离到的一种含过氧基团的倍半萜内酯化合物[1]，在治疗疟疾时，它不仅疗效好，而且毒性低，因此联合国卫生组织提出，将以青蒿素为基础的联合疗法(artemisinin combination therapies，ACTs)作为医治由疟原虫叮咬引起的疟疾的最佳方法[2]。

紫茎泽兰F3’H基因表达载体的构建及对烟草转化的研究

紫茎泽兰F3’H基因表达载体的构建及对烟草转化的研究紫茎泽兰是一种世界性的恶性杂草,现已在我国南方和西南地区广泛分布,并且其蔓延速度极快,引起了社会各界的广泛关注。

紫茎泽兰具有很强的化感作用,能分泌化感物质抑制周围植物的生长。

在分泌化感物质的代谢途径中,类黄酮3’-羟化酶(F3’H)能被紫茎泽兰的主要化感成分——泽兰酮诱导,推测其可能与化感作用相关。

通过研究紫茎泽兰化感作用相关的F3’H基因并分析其功能,并且进一步探索紫茎泽兰化感作用的分子机理,研究F3’H基因的部分功能及其在次生代谢中的作用,从而为紫茎泽兰的控制和管理提供理论依据,减少紫茎泽兰所造成的经济损失和减轻其对生态系统的破坏。

本研究构建了F3’H基因的过量表达载体,将其转入烟草体内,并分别进行了生理指标的检测和分子生物学检测。

以实验室保存的含有全长F3’H基因的质粒为模板,设计带有Xba I限制性酶切位点的引物,进行PCR扩增反应。

PCR扩增产物电泳分析后将目的条带回收,与pMD18-T载体连接,命名为F3’H-T。

利用Xba I位点,将经过序列测定正确的目的片段从pMD18-T载体上酶切回收。

同时用Xba I将pBI121植物表达载体线性化,回收的条带经过去磷酸化处理。

接着,将回收的F3’H基因片段和去磷酸化的pBI121载体用T4 DNA连接酶连接,将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞(DH5α)中,挑取阳性克隆进行鉴定。

接着利用农杆菌介导的叶盘法把F3’H基因和对照pBI121植物表达载体转化到烟草体内。

结果发现,转F3’H基因烟草的花色偏浅,转空载体(PBI121载体)的烟草花色较转F3’H基因烟草深,但比野生型烟草花色浅,其中有部分转F3’H基因的烟草的花出现条纹状的深浅交错的表型。

表明F3’H基因与次生代谢途径中花色素的形成密切相关。

半定量RT-PCR 结果表明外源基因F3’H在转基因烟草中均能正常转录并表达,且表达量各不相同。

花生黄烷酮3-羟化酶基因AhF3H的克隆和表达分析

ｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｏｆＫＦ３１２２１８．ＡｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＡｈＦ３ＨｓｈａｒｅｄｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈＦ３Ｈｆｒｏｍｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ．ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＡｈＦ３ＨｗａｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏＦ３Ｈｆｒｏｍｓｏｙ－ｂｅａｎａｎｄｗｉｌｄｓｏｙｂｅａｎ．ＡｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＡｈＦ３ＨａｎｄａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎｐｕｒｐｌｅｐｅａｎｕｔｍｕｔａｎｔａｎｄＦｅｎｇｈｕａ１．ＴｈｉｓｒｅｓｕｌｔｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔＡｈＦ３Ｈｐｒｏｂａｂｌｙ
（山东省农业科学院生物技术研究中心／山东省作物遗传改良与生态生理重点实验室，山东济南２５０１００）
摘要：利用花生转录组测序结果和ＧｅｎＢａｎｋＥＳＴ数据库，首次从花生中克隆了黄烷酮３一羟化酶基因，

飞机草类黄酮3’-羟化酶基因(CoF3’H)的克隆及其在烟草中的表达

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(3): 479 486 /ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由广西自然科学基金项目(桂科自0832047)资助。

*通讯作者(Corresponding author): 何龙飞, E-mail: lfhe@, Tel: 0771-*******-801第一作者联系方式: E-mail: gxhhwn@, Tel: 0771-*******Received(收稿日期): 2014-08-12; Accepted(接受日期): 2014-12-19; Published online(网络出版日期): 2014-12-29. URL: /kcms/detail/11.1809.S.20141229.1006.011.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00479飞机草类黄酮3’-羟化酶基因(CoF3’H )的克隆及其在烟草中的表达何海旺潘华清张铙丹何龙飞*广西大学农学院, 广西南宁 530004摘要: 利用RT-PCR 和RACE 技术从飞机草中克隆得到1628 bp 的类黄酮3’-羟化酶cDNA 的全长序列, 命名为CoF3’H , GenBank 登录号为HQ268505.1。

CoF3’H 基因的编码区长度为1524 bp, 编码507个氨基酸。

氨基酸序列含P450蛋白结构域和半胱氨酸亚铁血红素结合域保守区(F××G×R×C×G), 利用DNAMAN 软件比对显示, CoF3’H 与其他植物的F3’H 蛋白的同源性很高。

通过农杆菌介导成功地将CoF3’H 基因导入烟草, T 2代的转CoF3’H 基因烟草植株的黄酮含量显著高于野生型。

说明CoF3’H 在黄酮的生物合成中起重要作用, 为后续研究飞机草的化感作用及综合利用提供基础。

芜菁黄烷酮3-羟化酶基因的克隆、序列分析及表达

（３）ｓｏｍｉｅａｌｅｅｚｍｅｎｅｒｇｆｎｈｃａｉｓｉｓｎｈｓ．ｈｏｔｏｓｄｒｉｄＦＨ ’ ｃｍ￣ｄｃｔｙｎｙａｌｓｅｏｔｏｙｎｎｏｙｔｅｉＴｅｒｏｓｆｕａｔｎｐａｉａａｚｉｙｔａａｂｓＴｕｎ
ｑｎｅａａｙｉｈｏｄｔａＦＨｓ９％ｉｅｔｙｔ３ｕｅｃｎｌｓｓｓｗｅｈｔＢｒ３ｗａ９ｄｎｉｏＦＨ一１ｏｆＢｒｓｉａｔａｓｃ．ｅＮｏｔｅｏｔｎｅｕｔＴｈｒｈｒｂｌｔｉｇｒｓｌｓｎ
摘要
花青素是一类重要的植物次生代谢产物，黄烷酮３一羟化酶（３）花青素生物合成早期阶段的重ＦＨ是
要催化酶。利用ＵＡ处理津田芜菁（ｓｄｒｉ）Ｖ．Ｔｕａｕｐ和赤丸芜菁（ｕｉｋｍｒｒｉ）根２提取总ｔｎＹｍｇＡａａｕｔｎｐ块ｕ４ｈ后
新基因、品质、品种新新
ＮｅＧｅｅ＆Ｇｅｍｐａｍｗｎｒｌｓ
芜菁黄烷酮３一羟化酶基因的克隆、列分析及表达序
许志茹 ’ 崔国新李春雷孙燕李玉花
东北林业大学生命科学学院，林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室，哈尔滨，５００１０４通讯作者，ｕｈｒ２０＠１６ｃｍｘｚｉ０３２．ｕｏ
Ｅｄｃｔｎ，Ｈａｂｎ，１０４０ｕａｉｏｒｉ５０
Ｃｒｓｏｄｎｕｏ，ｕｈｒ２０＠１６ｏｏｒｐｎｉｇｔｒｚｉ０３２．ｍｅａｈｘｕｔＡｂｔａｔＡｎｔｏｙｎｎｒｌｓｆｉｏｔｎｅｏｄｒｔｂｌｔｓｉｐｌｎｓｎｄｆａａｎ一ｄｏｙａｅｓｒｃｈｃａｉｓａｅａｃａｓｏｍｐｒａｔｓｃｎａｙｍｅａｏｉｅｎａｔ，ａｖｎｏｅ３ｈｙｒｘｌｓｌ

过量表达紫茎泽兰类黄酮3_羟化酶基因对转基因烟草POD_PAL活性的影响

中国农业科技导报,2009,11(3):98-101Journal of Agricultural Science and Technol ogy　收稿日期:2009202226;修回日期:2009205215　基金项目:国家自然科学基金项目(30771422);国家973计划项目(2009CB119201)资助。

　作者简介:张松焕,硕士研究生,主要从事植物基因工程研究。

通讯作者:程红梅,研究员,博士生导师,主要从事植物基因工程研究。

Tel:010*********;E 2mail:chenghm@caas .net .cn过量表达紫茎泽兰类黄酮3’-羟化酶基因对转基因烟草P OD 、P AL 活性的影响张松焕1,2,　李春奇1,　郭惠明2,　裴熙祥2,　程红梅2(1.河南农业大学生命科学学院,郑州450002;2.中国农业科学院生物技术研究所,北京100081)摘　要:紫茎泽兰具有强烈的化感作用,可抑制周围其他植物生长。

类黄酮3’-羟化酶(F3’H )属于细胞色素P450(CYP )单加氧酶,具有催化多种依赖NADPH 或NADH 的底物氧化反应的功能,在植物化感作用中行使一定的功能。

利用转F3’H 基因的烟草为实验材料,分别测定转F3’H 基因植株、转pB I 121空载体植株和野生型植株的过氧化物酶(P OD )和苯丙氨酸解氨酶(P AL )活性,结果表明,转F3’H 基因植株的P OD 活性分别是野生型植株和转空载体植株的3.8倍和2.0倍,而P AL 活性则相应为4.0倍和2.0倍。

由此推断F3’H 基因在抵御伤害方面具有重要作用。

关键词:类黄酮3’-羟化酶;过表达;P OD;P AL中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:100820864(2009)0320098204Effects of Eupa torium adenophorum Fl avono i d 3’2Hydroxyl a se O ver 2expressi on on POD and PAL Acti v ity i n Tran sgen i c TobaccoZHANG Song 2huan1,2,L I Chun 2qi 1,G UO Hui 2m ing 2,PE I Xi 2xiang 2,CHE NG Hong 2mei2(1.College of L ife Science,He πnan Agricultural University,Zhengzhou 450002;2.I nstitute of B i otechnol ogy,Chinese Acade my of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China )Abstract:Eupatorium adenophorum has str ong allel opathy,and can supp ress all p lants ar ound it .Flavonoid 3’2hydr oxylase bel ongs t o cyt ochr ome P450(CYP )monooxygenase,which can catalyze oxidati on reacti ons that depend on the substrate NADPH or NADH,and p lay an i m portant r ole in p lant allel opathy .U sing F3’H gene transgenic t o 2bacco as material,P OD and P AL activities of transgenic t obacco were tested compared with that in contr ol t obacco and transgenic t obacco with pB I 121vect or .The results showed that P OD activity value of transgenic t obacco with F3’H gene is 3.8ti m es t o contr ol t obacco,t w ice t o transgenic t obacco transf or med pB I 121vect or,while P AL activity val 2ue of transgenic t obacco with F3’H gene is 4ti m es t o contr ol t obacco,t w ice t o transgenic t obacco transf or med pB I 121vect or .So we s peculate that F3’H gene is considered i m portant for defense against exogenous da mage .Key words:flavonoid 3’2hydr oxylase;over 2exp ressi on;P OD;P AL 紫茎泽兰是入侵我国的恶性杂草之一,它入侵时间长,分布范围广,对农业、林业、畜牧业及生态系统的影响较大,造成了严重的经济损失和生物多样性丧失。

石榴花类黄酮3’羟化酶基因的克隆及序列分析

陶吉寒，招雪晴，苑兆和，尹燕雷，冯立娟
（山东省果树研究所，山东泰安２７１０００）
摘要：为研究花色苷生物合成途径中类黄酮３羟化酶基因（Ｆ３Ｈ）的序列信息，以泰山红石榴花瓣为试材，提取总ＲＮＡ后反转录为ｃＤＮＡ，根据ＧｅｎＢａｎｋ中登录的相关物种Ｆ３Ｈ基因的保守序列
文章编号：１００４ —３２６８（２０１３）０４— ０１２１— ０４
ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＦｌａｖｏｎｏｉｄ３＇－ＨｙｄｒｏｘｙｌａｓｅＧｅｎｅｉｎＰｏｍｅｇｒａｎａｔｅＦｌｏｗｅｒ
ｉｎＧｅｎＢａｎｋｄａｔａｂａｓｅ．ＰＣＲａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄａｎｄｔｈｅｎｔｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｗａｓｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．
ＣＹＰ７５Ｂ亚家族。该序列在ＧｅｎＢａｎｋ中的登录号为ＫＣ４３０３２８。关键词：石榴；类黄酮３羟化酶基因；基因克隆；序列分析
中图分类号：￥６６５．４
文献标志码：Ａ
河南农业科学，２０１３，４２（４）：１２１ — １２４
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ

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黄酮3-羟化酶(F3H)的生物信息学分析李萍;王若曦;王欢【摘要】通过生物信息学分析方法,对已经在GenBank上注册的青稞( Hordeum vulgare)、高粱( Sorghum bicolor)、小麦( Triticum aestivum)、玉米( Zea mays)、洋葱( Allium cepa)、花烛( Anthurium andraeanum)和美丽百合( Lilium specio-sum)等7种单子叶植物的F3H核酸以及相应氨基酸序列进行研究,并对其组成成分、理化性质、信号肽、亚细胞定位、跨膜结构、蛋白质二级、三级结构、结构域以及分子进化等方面进行分析与预测. 研究结果表明,除玉米F3 H蛋白定位于过氧化物酶体外,其他植物F3 H均定位于细胞质基质内;所有植物F3 H均为不含信号肽的非分泌型蛋白,且没有跨膜区域的亲水性蛋白;α-螺旋和无规则卷曲是F3 H的主要二级结构元件,而延伸链则散布于整个蛋白中;F3H拥有一个2OG-Fell Oxy super family和一个PLNO3176 super family保守结构域;所构建的F3H系统发育进化关系与形态学上物种发育关系基本吻合.%In this paper, F3H, sequences from Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Triticum aestivum, Zea mays, Allium cepa, An-thurium andraeanum and Lilium speciosum, which were registered in GenBank, were analyzed and predicted by toolsof bioinformatics in the following aspects:composition, physical and chemical properties, signal peptide,protein subcellular localization, transmembrane helices in proteins, structure of protein, conserved domain and phylogeny. The results demonstrated Zea mays F3H lies in peroxisome and F3H from other plants locate in cell matrix;F3H is a non-secretory protein without signal peptide and hydrophilic protein without transmembrane area;α-helix and random coil are primary secondarystructural components of F3H and extending chain spread in the whole protein;F3H contains a conserved 2OG-Fell Oxy super family domain and a conserved PLNO3176 super family domain; F3H phylogeny is in consistent with morphological species phylogeny in general.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2015(032)006【总页数】5页(P25-29)【关键词】黄酮3-羟化酶;青稞等;生物信息学【作者】李萍;王若曦;王欢【作者单位】西南交通大学生命科学与工程学院,成都610031;西南交通大学生命科学与工程学院,成都610031;西南交通大学生命科学与工程学院,成都610031【正文语种】中文【中图分类】Q943.2类黄酮在植物的生长、发育、繁殖和对多种压力的反应上有多样的功能[1]。

黄酮3-羟化酶(Flavanone-3-hydroxylase，F3H)是黄酮类化合物代谢途径上的关键酶之一[2]，属于依赖型2-酮戊二酸的双加氧酶(2-ODD)家族，代谢反应需要2-酮戊二酸、分子氧、铁和抗坏血酸，作用是催化柚皮素C3位羟基化，生成二氢山奈素(dhiydorkaempeforl，DHK)，而 DHK是黄酮和异黄酮合成的重要中间产物[3]。

F3H基因的cDNA最初从金鱼草(Antirrhinum majus)中克隆得到，现已在多种植物中克隆，如苹果(Malus)、紫花苜蓿(Medicago sativa)等[4]。

由于F3H的作用底物是柚皮素，因此F3H调控着黄酮与花青素苷产物的合成，是整个黄酮类化合物代谢途径的中枢位点[5]。

在不同植物或组织中，F3H具有底物特异性。

研究表明，F3H在大多数物种中仅以单拷贝形式存在[6-7]。

此外， F3H 基因在进化上也十分保守[8]。

本课题拟选择单子叶植物纲多种植物的F3H核苷酸序列以及对应的氨基酸序列作为生物信息学分析的目标序列，分析其结构、功能、进化关系和差异性，以期为深入研究F3H家族蛋白的酶学特性和黄酮化合物生物合成的分子机理提供理论依据。

1.1 基因序列从PDB数据库选取7种单子叶植物黄酮3-羟化酶(F3H)氨基酸序列作为研究对象(见表1)。

下载其氨基酸序列以及其对应的核苷酸序列，并以FASTA格式保存。

1.2 序列分析方法和所用软件通过在线软件(见表2 )对 F3H 进行理化性质、信号肽、跨膜结构域、亲/疏水性、二级结构、保守结构域、三级结构进行预测和分析，并使用MEGA 5.0软件来进行进化分析，构建进化树。

2.1 F3H理化性质分析结果2.1.1 单子叶植物F3H核苷酸序列分析从表3中不难看出，大部分单子叶植物F3H基因均包含5′/3′非编码区(untranslated region，UTR)和一个开放阅读框，仅小麦和美丽百合不存在5′/3′非编码区。

由于不同植物的基因全长不同，所以UTR长度存在差异。

单子叶植物F3H的开放阅读框在1 100 bp～1 200 bp，且ORF的终止密码子均为TGA。

2.1.2 单子叶植物F3H氨基酸序列理化性质分析结果利用Expasy软件包中ProtParam在线工具对F3H蛋白理化性质进行分析[9]，结果发现蛋白质理化性质差异不大，主要有以下几个特点：7个物种F3H氨基酸序列长度在360～400 bp，分子质量在40～45 ku；单子叶植物黄酮3-羟化酶的等电点理论值为5.5；7个物种中，Ala、Leu、Lys和Val残基比例较重，并且都不含Pyl和Sec；7个物种中，有6个F3H蛋白质不稳定性指数大于40，为不稳定蛋白，仅在花烛种中，黄酮3-羟化酶蛋白质不稳定性指数为36.47，是稳定蛋白。

2.2 信号肽、亚细胞定位和跨膜结构、亲/疏水性分析结果2.2.1 蛋白质信号肽分析使用SignalP 3.0 Server服务器预测信号肽，分别用神经网络(NN)和隐马尔科夫(HMM)模型完成预测。

7种单子叶植物F3H信号肽分析结果表明F3H均不含有信号肽，且属于非分泌蛋白。

2.2.2 蛋白质亚细胞定位运用WoLF PSORT的kNN算法对F3H进行亚细胞定位。

除玉米外另外6种单子叶植物黄酮3-羟化酶均定位于胞质溶胶中(见表4)。

2.2.3 蛋白质跨膜区预测和亲/疏水性分析TMHMM返回7个物种跨膜区预测结果，以青稞为例(图1)，其余6个物种结果相似：预测结果表明：青稞F3H位于inside的可能性为0，位于outside可能性为0.9，总的结果(粗线)显示F3H位于outside，表明青稞F3H蛋白没有跨膜区域。

其余6种单子叶植物F3H蛋白质跨膜区域预测结果相似，说明F3H蛋白没有跨膜区域。

Expasy数据库提供的ProtScale工具分别对7种单子叶植物中黄酮3-羟化酶的疏水性进行分析，采用其中的Kyte & Doolittle Scale方法构建疏水性图谱(以青稞为例，图2 )。

疏水性图谱中正值表示疏水性，负值表示亲水性。

对亲/疏水性氨基酸分布的观察可以间接反映蛋白质二级结构折叠情况[10]。

氨基端和羧基端多表现出亲水性，而中心区域则表现出高度疏水性，但总体上仍是亲水性程度更大，与理化性质分析时得到GRAVY为负值中描述的一致。

其余6个物种亲/疏水性分析结果见表5。

2.3 蛋白质结构与功能预测结果2.3.1 蛋白质二级结构预测GOR算法返回的7种单子叶植物的黄酮3-羟化酶的二级结构预测结果(见表6)。

不同单子叶植物F3H蛋白二级结构的构成比例基本一致。

在F3H二级结构中，无规则卷曲和α-螺旋约占85%，延伸链仅占15%左右。

原因可能是羧基末端富含脯氨酸，限制蛋白质形成规则α-螺旋和β-折叠结构，因此多表现为无规则卷曲结构。

从蛋白质总体结构来看，F3H蛋白无转角结构，无规则卷曲和α-螺旋是F3H主要二级结构元件，而延伸链则散布于整个蛋白质中。

2.3.2 蛋白质功能结构域预测在NCBI的CDD(Conserved Domain Database)数据库中搜索，进行蛋白质功能结构域的预测，结果如下，见表7。

用CDD分析不同单子叶植物F3H功能结构域，发现包含一个2OG-Fell_Oxy 蛋白超家族，即含有2-酮戊二酸的双加氧结构域，说明该蛋白能在含二价铁离子和氧分子的情况下催化柚皮素生成二氢堪非醇(DHK)，这与黄酮3-羟化酶功能相符。

CDD分析结果同时表明，F3H含有一个PLN03176蛋白质超家族，该蛋白超家族暂时没有正式命名，但其功能与黄酮3-羟化酶相关。

2.3.3 蛋白质三级结构预测在SWISS-MODLE服务器[11]上预测不同单子叶植物黄酮3-羟化酶三级结构。

过程大致如下：模板查寻、序列比对、目标模型的创建和结构的优化[12]。

找到模板，模板选择标准：序列同源性、氨基酸残基完整性及模板晶体的精度[13]。

通过Verify 3 D 评价至少80%氨基酸残基的评分大于0[14]，表明预测结果合理性评价良好。

预测结构图，见图3。

2.4 序列比对与进化树构建2.4.1 蛋白质序列比对对7种单子叶植物F3H蛋白质序列进行序列比对，比对结果见图4。

不同植物中F3H氨基酸序列在很多区域具有较高相似性，90～310区域是高度保守的，这与蛋白质功能结构域预测结果2OG-FeII_Oxy superfamily位置相同，可见重要结构域的氨基酸序列组成具有较高同源性。

2.4.2 进化树构建根据不同植物F3H蛋白质序列多序列比对结果，结合临近连接法，用MEGA5.0构建进化树[15](图5 )。