关于硫氢化钠后处理对培养心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用
RhoA激酶的硫巯基化修饰在硫化氢抗大鼠神经细胞缺氧性损伤中的作用
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网络出版时间：２０２１－６－１７１２：１９ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０２１０６１６．１４１６．０３６．ｈｔｍｌ
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０２１Ｊｕｌ；３７（７）
号：２０２００８２０；二硫 苏 糖 醇 （ＤＴＴ），购 自 阿 拉 丁 试 剂 有限公司，批号：Ｄ８２２０。 １．２ 仪器 流式细胞仪（美国 ＢＤ公司）；凝胶电泳 仪和电泳槽 （美国 ＢＩＯＲＡＤ公司）；ＴＧＬ１６Ｈ超速 冷冻离心机（珠海黑马仪器有限公司）；细胞培养箱 （美国 Ｔｈｅｒｍｏ公司） １．３ 动物 ＳＰＦ级 ＳＤ大鼠新生鼠，购自安徽医科 大学实验动物中心，实验动物合格证号：ＳＣＸＫ（皖） ２０１７００１。 １．４ 方法 １．４．１ 原代培养大鼠海马神经细胞［１０］ 取新生 ２４ ｈ内的 ＳＤ大鼠，在麻醉状态下断头取脑并剥离海马 组织，０．１２５％胰酶液消化 ２０ｍｉｎ，加入 １０％ ＦＢＳ的 ＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培 养 基，巴 氏 吸 管 将 组 织 吹 散，７０ μｍ细胞过滤器过滤，１０００ｒ·ｍｉｎ－１常温离心 ５ｍｉｎ 并留沉淀。加入完全培养基重悬细胞，调整细胞数 目为 １×１０７个·Ｌ－１，接种于预先用多聚赖氨酸包 被好的 ６孔板中，２４ｈ后用专用培养基（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ＋２％ Ｂ２７＋０５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ Ｌｇｌｕｔａｍｉｎｅ＋１％青霉 素 －链霉素溶液）半量换液，每隔 ３ｄ全量换液。
ｍＬＨＥＮＳ缓冲液吹打溶解，加入 ５０μＬ链霉亲和素 琼脂糖珠，室温避光放置 ２４ｈ。再 １２０００ｒ·ｍｉｎ－１ 离心 ２ｍｉｎ后弃上清，用 ＨＥＮＳ缓冲液重悬琼脂糖 珠并反复离心洗涤 ３次，用洗脱缓冲液洗脱琼脂糖 珠后得到纯化的硫巯基化蛋白。 １．４．３ ＲＯＣＫ２ 或 硫 巯 基 化 ＲＯＣＫ２（ＳＳＨＲＯＣＫ２） 的蛋白含量检测 神经元总蛋白或硫巯基化蛋白中 的 ＲＯＣＫ２含量分别用 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法测定。将 １００ μｇ的总蛋白或硫巯基化蛋白置 １００℃ 变性后，在 １２％ ＳＤＳ聚丙稀酰胺凝胶中电泳后将蛋白转膜至 ＰＶＤＦ膜。５％脱脂牛奶中封闭 １５ｈ，ＲＯＣＫ２ 一抗 孵育过 夜。次 日 加 入 ＨＲＰ标 记 的 二 抗 孵 育 １ｈ。 ＴＢＳＴ洗膜后用 ＥＣＬ化学发光显色液显影并拍照以 兔抗 βａｃｔｉｎ多克隆抗体为内参照，ＩｍａｇｅＪ进行灰 度值分析。 １．４．４ ＲＯＣＫ２活性检测 将培养 ８ｄ的海马神经 元细胞随 机 分 为 ＮＳ对 照 组 和 ＮａＨＳ（２００μｍｏｌ· Ｌ－１）组。ＮａＨＳ或生理盐水处理 ２４ｈ后，将 ＮａＨＳ组 进行硫巯基化蛋白分离纯化。采用 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法 定量分析各组 ＲＯＣＫ２蛋白的浓度，以灰度值的比值 来调整 ＲＯＣＫ２ 蛋白的浓度，待浓度一致后再进行 ＲＯＣＫ２活性检测。将蛋白样品加入到 ９６孔板中， 并设置空白孔和标准孔，按试剂盒说明书进行操作， 以空白孔调零，４５０ｎｍ波长测吸光度。 １．４．５ 神经细胞缺氧复氧损伤模型的建立 将原 代海 马 神 经 细 胞 随 机 分 为 正 常 对 照 组、模 型 组、 ＮａＨＳ（５０、１００、２００μｍｏｌ·Ｌ－１）组、硫巯基化抑制剂 ＤＴＴ组以及 ＮａＨＳ（２００μｍｏｌ· Ｌ－１）＋ＤＴＴ组。除 正常对照组外，细胞预处理 ２４ｈ后弃去培养基加入 缺氧液，置于 ９０％ Ｎ２ －１０％ ＣＯ２ 三气培养箱中孵 育 ４ｈ，再更换成完全培养基置于正常三气培养箱 （３７℃、５％ＣＯ２）孵育 １２ｈ，进行后续实验。 １．４．６ ＣＣＫ８法检测细胞活力 取缺氧 ４ｈ／复氧 １２ｈ铺满 ９６孔板（１００μＬ／孔）的神经元，每孔加入 １０μＬＣＣＫ８试剂，培养箱中孵育 １ｈ后用酶标仪测 定 ４５０ｎｍ处的吸光度，计算细胞活力。 １．４．７ 检测培养上清中 ＬＤＨ、ＮＳＥ水平 使用试 剂盒检测细胞培养上清中 ＬＤＨ和 ＮＳＥ活性。 １．４．８ 细胞凋亡检测 将细胞用不含 ＥＤＴＡ的胰 酶消化吹打分离出后，加入 １∶３稀释的结合缓冲 液。将 ５μＬＡｎｎｅｘｉｎＶ和 １０μＬ碘化丙啶（ＰＩ）加入 １００μＬ细胞悬液中避光放置 ５ｍｉｎ，立即检测各组 凋亡率。 １．４．９ 数据分析 使用 ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ８软件对 数据进行分析，采用 ｔ检验进行两组间比较，单因素
缺氧预处理对人心肌细胞缺氧复氧损伤的影响及其机制
缺氧预处理对人心肌细胞缺氧复氧损伤的影响及其机制
刘秀华;费宇行
【期刊名称】《北京医科大学学报》
【年(卷),期】1997(029)006
【摘要】目的：探讨缺氧预处理（ＰＣ）对于人类心肌细胞缺氧复氧（Ｈ／Ｒ）损伤的影响及其机制。
方法：在体外分离的人心房和心室肌细胞的Ｈ／Ｒ模型上观察缺氧ＰＣ的作用，及蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）抑制剂与蛋白磷酸酶激动剂和抑制剂对ＰＣ现象的影响。
结果：缺氧ＰＣ明显减轻Ｈ／Ｒ造成的心肌细胞损伤，ＰＫＣ抑制剂Ｈ７和蛋白磷酸酶激动剂ＢＤＭ分别完全消除ＰＣ的细胞保护，而蛋白磷酸酶抑制剂ＯＡ则能模拟ＰＣ的上述保护效应。
结论：人类
【总页数】4页(P493-496)
【作者】刘秀华;费宇行
【作者单位】中国人民解放军总医院老年心血管病研究所;北京医科大学心血管基础研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R542.2
【相关文献】
1.缺氧预处理对培养的人血管平滑肌细胞缺氧复氧损伤的影响 [J], 刘秀华;费宇行
2.有氧运动对老年人心肌细胞以及功能的影响机制研究进展 [J], 刘彬;刘忠民
3.有氧游泳运动对中老年人心肌细胞以及功能的影响机制研究 [J], 戴伟宇
4.二甲双胍对H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤中FUNDC1介导线粒体自噬的影响及其机制 [J], 王鑫; 刘乃丰
5.β-榄香烯调控miR-130b-5p/NF-κB信号通路对心肌细胞缺氧复氧损伤的影响及机制 [J], 邓瑞;卢小伟;马珍珍;王威
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缺氧后处理对缺氧／复氧心肌细胞的保护作用及其机理研究
机制 。本实验在心肌 细胞缺 氧／ 氧（ ｙｏｉ ｒｏｙｅａｏ ， ／ 模型上 观察 Ｈ Ｒ及缺氧 后处理 （ ｙ 复 ｈｐｘａ ｅｘｇｎｆ ｎ Ｈ Ｒ） ／ ｉ ／ ｈ—
Ｔ ｏ ｅ ｔｖ ｆｅ ｔ ｏ ｐ ｘ ｃ Ｐ ｓ ｃ ｎ ｉｉｎ ｎ Ｈ Ｉｃ ｅ ￣ ／ｒ ｐ ｒ ｕ ｉｎ －ｎｄ ｃ ｄ Ｍ ｙ ｃ ｒ ｉｌ ｈｅＰｒ ｔｃ ｉ ｅ Ｅｆ ｃ ｆ Ｈｙ ｏ ｉ ｏ ｔ ｏ ｄ ｔ ｉ ｇ Ｏ ｓ ｈ ｎ ｉ ｅ ｅ ｆ ｓｏ Ｉ ｕ ｅ ｏ ａ ｏ ａ ｄａ
ｐｘｃ ｏｔ ｎ ｉｏｉｇＨ—ｏｔ ） Ｇ Ｐ ８ Ｃ Ｔ表 达以及 ｃｓａｅ１ ｏｉ ｐ ｓ ｏｄｔ ｎ ， ｐ ｓ 对 Ｒ ７ 、 Ｒ ｅ ｉ ｎ Ｃ ａｐｓ．２活化的影响 ， 探讨 内质 网应激 （ ｎｏ ｅｄ—
ｐ ｍ ｅｒ ｉ ｌｍ ｓ ｅｓＥ Ｓ 在 Ｈ－ｏｔ 护机制 中的意 义及 其细胞信号 转导机 制 。方法 ｌ ｉ ｅｃ ｕ ｔ ｓ，Ｒ ） ｓ ａ ｔｕ ｒ ｐｓ Ｃ保
抑 制作用 （ Ｃ Ｔ蛋 白 其 Ｒ 相对 水平较 Ｈ Ｒ＋ —ｏＣ组 高 ４．％ ） ／ Ｈ ｐｓ ｔ ７２ 。结论
Ｈ ｐｓ ． ｔ ｏ Ｃ可调控 Ｅ Ｓ反应 程 Ｒ
度． 抑制 Ｈ Ｒ诱导的过度 Ｅ Ｓ 减轻内质网凋 亡信号介 导的细胞凋 亡 的发生 。ｐ ８Ｍ Ｐ ／ Ｒ， ３ Ａ Ｋ及 Ｊ Ｋ信 号 Ｎ
【 ｂｔ ｃ】 Ｏ ｊ ｔ ｅ Ｉ ｈｍｃｐｓｏｄｉ ｉ （－ｏ Ｃ ｉ ａ ｐｒｎ ｅｄｇ ｏｓｐ ｔ ｔｅ Ａ ｓ ａｔ ｒ ｂｅ ｖ ｓ ｅ ｉ ｏｅｎｉ ｎ ｇ Ｉ ｓ ） ｓ ｎｉ ｏａｔ ｎｏｅ ｕ ｒｅ ｉ ｃ ｉ ｃ ｔ ｔ ｎ ｐｔ ｏ ｍ ｔ ｎ ｏ ｃｖ
硫化氢对氧应激所致心肌细胞损伤的影响及机制
·实验研究·［文章编号］1007-3949(2011)19-04-0310-05硫化氢对氧应激所致心肌细胞损伤的影响及机制边云飞，秦卫伟，宋晓苏，肖传实(山西医科大学第二医院心内科，山西省太原市030001)［关键词］心肌细胞;硫化氢;氧化应激;PI3K/Akt［摘要］目的探讨硫化氢供体硫氢化钠对过氧化氢诱导心肌细胞氧化应激损伤的保护机制。
方法采用胶原酶消化分离培养SD大鼠乳鼠心肌细胞，过氧化氢诱导建立氧化应激模型。
经硫氢化钠和LY294002预处理探讨硫化氢对过氧化氢诱导心肌细胞损伤的保护作用，观察心肌细胞形态学变化，检测乳酸脱氢酶、丙二醛的含量和超氧化物歧化酶的活性，Western blot检测凋亡相关蛋白表达，流式细胞术检测心肌细胞的凋亡。
结果过氧化氢可引起乳鼠心肌细胞乳酸脱氢酶、丙二醛含量升高，Akt磷酸化水平下降，Bcl-2/Bad比值降低，细胞凋亡率升高(P＜0.05);硫氢化钠预处理能减轻过氧化氢引起的心肌细胞损伤，乳酸脱氢酶、丙二醛含量下降，Akt磷酸化水平升高，Bcl-2/Bad比值升高，细胞凋亡率下降(P＜0.05);PI3K/Akt特异性阻断剂LY294002能部分减轻硫氢化钠的保护作用(P＜0.05)。
结论硫氢化钠预处理能使Akt的磷酸化水平升高，Bcl-2/Bad比值升高，在一定程度上减轻过氧化氢诱导的心肌细胞损伤及凋亡，硫化氢可能通过激活PI3K/Akt信号转导通路发挥保护作用。
［中图分类号］R541［文献标识码］ACardioprotective Mechanism of Hydrogen Sulfide Attenuating Hydrogen Peroxide-in-duced Rat Neonatal Cardiomyocytes InjuryBIAN Yun-Fei，QIN Wei-Wei，SONG Xiao-Su，and XIAO Chuan-Shi(Department of Cardiology，The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan，Shanxi030001，China)［KEY WORDS］Cardiomyocytes;Hydrogen Sulfide;Oxidative Stress;PI3K/Akt［ABSTRACT］Aim To study the cardioprotective mechanism of hydrogen sulfide(H2S)on oxidative stress induced by hydrogen peroxide．Methods Primary-cultured cardiomyocytes were obtained from neonatal rats，an oxidativestress injury model was established by exposing the cells to H2O2for2h．To study the cardioprotective mechanism of hy-drogen sulfide(H2S)on oxidative stress induced by hydrogen peroxide，the cells were pre-incubated with ly294002for30 min．The morphology change of cardiomyocytes was observed by inverted phase contrast microscope，the activities of lac-tate dehydrogenase(LDH)and superoxide dismutase(SOD)，and content malondialdehyde(MDA)were determined，the activation of the PI3K/Akt signal pathway was observed by Western blotting，the cardiomyocytes apoptosis was detected byAnnexinV/PI flow cytometry．Results After exposing to H2O2for2h，the release of LDH，MDA and apoptosis wereincreased，the activities of SOD and ratio of Bcl-2/Bad were decreased(P＜0.05)．After pretreated with sodium hydro-sulfide(NaHS)for30mins，the injury effect was attenuated，moreover，the phosphorylation of Akt，Bad and ratio of Bcl-2/ Bad were upregulated．LY294002could block the protection effect of NaHS partly．Conclusion H2S can attenuate hydrogen peroxide-induced rat neonatal cardiomyocytes injury，which may involve the PI3K/Akt pathway．近年来，活性氧对心脏的损伤作用越来越引起人们的重视。
硫化氢减少缺氧时人脐静脉内皮细胞的凋亡
ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＨＢＳＳ）缓
２硫化氢抑制缺氧诱导人脐静脉内皮细胞钙离子 浓度上升 采用钙荧光探针Ｆｕｒａ－２／ＡＭ和钙离子成像系统 （ＣｅｌｌＲ＿ＭＴ２０）检测发现，缺氧使人脐静脉内皮细 胞［ｃａ２＋］．显著升高，引起钙超载。３００１ｘｍｏｌ／Ｌ
ＮａＨＳ、１ ｔｘｍｏｌｆＬＸｅｓｔｏ Ｃ、１ｍｍｏＬ／Ｌ
ＮＡＣ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＮａｒｉＳ
Ｘｅｓｔｏ
ｂｌｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｈｙｐｏｘｉａ・ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ心Ｓ ｍａｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅ ｔｈｅ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆ ＭＭＰ ｂｙ ｈｙｐｏｘｉａ
ｔｏ
ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ
ｔｈｅ ＲＯＳ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ
材料与方法 １材料 ＮａｒｉＳ、ＤＣＦＨ．ＤＡ、ＩＲ受体抑制剂Ｘｅｓｔｏｓｐｏｎｇｉｎ Ｃ（Ｘｅｓｔｏ Ｃ）购自Ｓｉｇｍａ公司；Ｆｕｒａ－２／ＡＭ、胰酶购
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色检测细胞凋亡率 细胞处理后ＰＢＳ洗两次，４％多聚甲醛室温固
定１５ｍｉｎ；ＰＢＳ洗两次，ｌＯｎｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染 核５ｍｉｎ；ＰＢＳ冲洗两次，荧光显微镜下观察，各组
冲液（ｐＨ ７．４）洗３次，加入５肛ｍｏｌ／Ｌ的ＤＣＦＨ－ ＤＡ于３７ｃｃ避光孵育５０ｍｉｎ；清洗３次，激光共聚 焦显微镜（激发波长４８８ｎｍ，发射波长５２５ｎｍ）随 机取３个视野拍照，重复３次，以平均荧光强度表 示活性氧含量。 ４细胞质内钙离子浓度的检测 细胞接种于圆形玻片，用３００¨ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＳ预 处理３０ｍｉｎ后缺氧处理２４ｈ，ＨＢＳＳ清洗３次，加入 １．５Ｉ山ｍｏｌ／Ｌ的Ｆｕｒａ－２／ＡＭ避光于３７℃孵育４５ｍｉｎ，
牛磺酸对培养的心肌细胞缺氧再给氧损伤的保护作用
牛磺酸对培养的心肌细胞缺氧再给氧损伤的保护作用
杨育红;肖志杰;等
【期刊名称】《锦州医学院学报》
【年(卷),期】2000(021)006
【摘要】目的：观察牛磺酸对培养的心肌细胞损伤的影响。
方法：以培养的心肌细胞为模型。
在缺氧再给氧损伤细胞后，观察心肌细胞活力及搏动频率的变化，结果：牛磺酸可以提高心肌细胞的活力，提高心肌细胞的搏动频率，使心肌细胞的搏动频率明显恢复。
结论：牛磺酸对缺氧再给氧损伤培养的心肌细胞有保护作用。
【总页数】3页(P1-3)
【作者】杨育红;肖志杰;等
【作者单位】锦州医学院药理教研室121001;锦州医学院药理教研室121001【正文语种】中文
【中图分类】R542.2
【相关文献】
1.麦冬总皂甙对培养心肌细胞缺氧再给氧损伤的保护作用 [J], 何平;代赵明
2.腺苷A1受体激动剂对心肌细胞缺氧再给氧脂质过氧化损伤的保护作用 [J], 杨育红;王洪新
3.小牛血去蛋白提取物注射液对培养的心肌细胞缺氧再给氧损伤的保护作用 [J], 杨育红;娄凤霞;王洪新
4.人urotensin Ⅱ对大鼠心肌细胞缺氧-再给氧损伤的保护作用及机制 [J], 王荣俊;丁波;文继月;陈志武
5.儿茶素单体对心肌细胞缺氧再给氧损伤的保护作用及机制研究 [J], 叶锦霞;王岚;梁日欣;杨滨
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气体分子硫化氢对心脏缺血再灌注保护机制的探讨
世界最新医学信息文摘 2017年 第17卷 第4期163·经验交流·气体分子硫化氢对心脏缺血再灌注保护机制的探讨赵沐霖１，徐鹏２，杨梅２，李雪蛟２，曹雪滨２（通讯作者）（1.河北大学医学部 中医系，河北 保定 071000；2.中国人民解放军第252医院 心内科，河北 保定 071000）0 引言硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）是一种具有臭鸡蛋气味的小分子有毒气体[1]，与气体信号分子一氧化氮（nitric oxide，NO）和一氧化碳（carbon monoxide，CO）一样，具有持续产生、弥散迅速、作用广泛的特点，参与 众多生理、病理生理过程[2-4]。
上世纪80年代，人们发现H2S可经酶促作用产生；此后人们又发现其对神经系统，特别是海马的功能具有重要的调节作用，并可调节消化道和血管平滑肌的张力，从而开始了对H2S功能的新探索[2-3]。
1 H2S的生物学性质1.1 内源性H2S的合成及存在形式。
内源性H2S的催化生成主要有4种途径。
人们最先发现H2S以磷酸吡哆醛5’磷酸依赖性酶（胱硫醚β-合成酶CBS、胱硫醚β-裂解酶CSE ）为限速酶、以半胱氨酸为底物催化生成[4]。
CSE是心血管组织内催化H2S产生的唯一酶，如心肌、主动脉、肺动脉等。
后来人们发现3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-mercaptopyruvate Sulfurtransfcrase，3-MST)同样可以催化体内生成H2S[5-6]。
近来Kimura实验室又发现了在小脑和肾脏中，D型半胱氨酸可在D 型氨基酸氧化酶作用下产生3-MP，后者通过3-MST的催化产生H2S，为产生的第四条途径[7]。
1.2 内源性H2S的分解代谢。
还原性物质H2S在体内易被循环系统中的氧化剂消耗，可能在线粒体内被氧化，或在细胞质内甲基化，也能被高铁血红蛋白及含有二硫化物的分子清除[8]。
H2S亦可在酶的作用下与血红蛋白结合生成S-血红蛋白[9]。
硫化氢的心脏保护作用
气体信号分子硫化氢的心脏保护作用研究进展【摘要】气体信号分子家族由一氧化氮、一氧化碳和硫化氢等内源性气体小分子组成，发挥重要的生物学效应。
已经证实硫化氢在多个系统中有重要的生理调节作用，本文重点综述其在心血管系统中的心脏保护作用，包括抑制心脏缺血再灌注损伤、负性调节心脏代谢消耗和抗心脏氧化应激等。
【关键词】气体；硫化氢；心脏1 内源性气体信号分子——硫化氢硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）是一种无色，有很强的臭鸡蛋气味的有毒气体。
人类认识并研究其毒性作用已有300 多年的历史，然而H2S的生理作用直到上世纪90年代才被逐渐认识。
H2S在生物体内可由内源性酶催化生成，受体内代谢途径的调控，生理浓度下有特定生理功能，已经证实其在神经、心血管、内分泌、消化等多个系统中具有特定的生理调节作用。
H2S的体内浓度远远低于其产生毒性的浓度，它和一氧化氮（NO）、一氧化碳（CO）一并称为气体信号分子，组成气体信号分子家族［1，2］。
2 硫化氢在体内的合成调节H2S 是一种弱酸，在体内1/3 以气体H2S形式存在，2/3以硫氢化钠（NaHS）形式存在，H2S与NaHS 存在动态平衡，这样既保证了H2S 在体内的稳定，又不改变内环境的pH 值。
H2S在脂溶性溶剂中的溶解度为水中的5 倍，故可自由通过细胞膜［1］。
内源性H2S的生成可以通过酶促反应途径也可以通过非酶促途径。
在哺乳动物体内主要是酶促反应途径，以L－半胱氨酸为底物，由磷酸吡哆醛－5′－磷酸依赖性酶，主要是胱硫醚γ裂解酶（cystathionineγlyase，CSE）和胱硫醚β合成酶（cystathionine βsynthase，CBS）催化而成，其两个终产物是铵和丙酮酸盐。
研究发现CSE和CBS 这两种酶的分布具有组织特异性，在心血管系统中CBS表达很少［3］，CBS是主要的硫化氢合成酶。
研究发现心脏高表达CSE，高于主动脉，而低于脑组织，其内源性H2S的生成量为（50.2±2.1）μmol/mg蛋白，生成率为（18.64±4.49）nmol/min·g蛋白，表明心脏也是内源性H2S的主要生成来源［4］，另外心梗组织中CSE也有表达［5］。
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关于硫氢化钠后处理对培养心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用【关键词】硫化氢后处理心肌细胞培养缺氧复氧损伤大鼠Abstract： Objective To explore the protective effects of H2S donor-NaSH postconditioning on the primary-cultured neonatal rat myocardial cells exposed to hypoxia/reoxygenation （H/R） injury. Methods Primary- cultured myocardial cells from neonatal rats were randomly pided into 4 groups: control group（normal）， hypoxia/reoxygenation group（H/R），hypoxia postconditioning group（HPC） and NaHS postconditioning group（H/R+NaHS）. A model of H/R injury was reproduced by exposing the cell culture to 2 h of hypoxia and 2 h of reoxygenation. The percentage of surval cells， the activities of lactate dehdrogenase (LDH) and superoxide dismutase (SOD)， and the content of malondialdehyde (MDA) were determined at the points of pre-hypoxia， hypoxia for 2 h and reoxygenation for 0.5 h ，1 h and 2 h. Results No obvious changes were detected in H/R group， HPC group and H/R+ NaHS group until hypoxia 2 h. After standard hypoxia postconditioning and NaHS postconditioning respectively， the surval rate was higher in the HPC and H/R+ NaHS groups than in the H/R group ［(70.5±2.2）% and （66.2±2.5）% vs （61.3±1.8）%， P�0.05］. Meanwhile the activities of LDH in HPC and H/R+ NaHS groups were obviously lower than that in H/R group ［(36.2±1.3）U·L-1 and （39.5±1.5） U・L-1 vs （44.6±1.7） U・L-1，P�0.05］. The contents of MDA in HPC and H/R+ NaHS groups were obviously lower than in H/R group ［(0.905±0.033） mmol・g-1 and（0.986±0.042） mmol・g-1 vs （1.120±0.045） mmol・g-1， P�0.05］; but the SOD activity was significantly higher in HPC group and H/R+ NaHS group than in H/R group ［(16.9±1.0） U・L-1 and （159±1.2） U・L-1 vs （13.3±1.5） U・L-1， P�0.05］. During the whole 2 hours of reoxygenation， the survival rate of cells and the SOD activity in HPC and H/R+ NaHS groups remained higher than in the H/R group， and the activity of LDH and the content of MDA kept to be lower than in H/R group (P�0.05). Conclusion NaHS postconditioning offers protective effect on myocardial cells against hypoxia/reoxygenation injury by enhancing the scavenging of oxygen - derived free radicals.Key words： H2S; postconditioning; myocardial cell culture;hypoxia/reoxygenation injury; rat缺血后处理(ischemic postconditioning)［1］是可以有效对抗缺血/再灌注损伤的一种重要内源性保护机制，长时间缺血后再灌注前，短时间内反复短暂的再缺血处理，可以明显减轻缺血组织的缺血/再灌注损伤。
药物后处理是用药物模拟缺血后处理的方式，试图达到与缺血后处理相似的保护效果。
内源性硫化氢（H2S）作为新发现的气体信号分子，其心肌保护作用近年来受到高度的关注。
研究发现，缺血前给予外源性硫化氢钠（NaHS）可改善因缺血/再灌注损伤（ischemia reperfusion injury， IRI）引起的心肌功能障碍和心肌损伤［2］。
但NaHS后处理的心肌保护作用尚未见报道。
本研究采用原代培养的大鼠乳鼠心肌细胞，建立缺氧/复氧损伤模型，探讨NaHS后处理对培养心肌细胞IRI的保护作用及其可能的机制。
1 材料和方法1.1 实验材料胎牛血清（杭州四季青有限公司）；DMEM培养基（GIBCO，America）；胶原酶I、胰蛋白酶（Sigma）；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase， LDH)、超氧化物歧化酶(super oxidedismutase， SOD)、丙二醛(malondialdehyde， MDA)试剂盒，考马斯亮蓝法蛋白测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所出品；其余试剂均为国产分析纯产品。
二氧化碳培养箱（上海），N750紫外分光光度计（上海）。
1.2 实验方法1.2.1 乳鼠心肌细胞原代培养选出生1～3天内的Sprague Dawley大鼠（由徐州医学院实验动物中心提供），雌雄不限。
参照文献［3］方法分离、纯化心肌细胞，制成浓度为1×109・L-1 的细胞悬液，接种于24孔培养板。
取原代培养72 h的心肌细胞进行实验。
1.2.2 实验分组将同批培养的心肌细胞随机分为4组。
①对照组（Normal 组）：将心肌细胞放入37℃含95%空气、5% CO2的二氧化碳培养箱中，用复氧液〔mmol・L-1， 0.9 Na2HPO4，20.0 NaHCO3， 1.8 CaCl2，1.2 MgSO4， 55.0 葡萄糖， 20.0 HEPES(hydroxyerhyl piperazine erhanesulfonic acid，羟乙基哌嗪乙磺酸)，129.5 NaCl和5.0 KCl，pH 7.4〕培养4 h。
②缺氧/复氧组（H/R组）:参照文献［3］，将心肌细胞换用高纯氮气饱和30 min、氧分压低于7 kPa的模拟缺氧液(mmol・ L-1，0.9 Na2HPO4、6.0 NaHCO3、1.8 CaCl2、1.2 MgSO4、40乳酸钠、20 HEPES、98.5 NaCl和10.0 KCl、pH 6.8)，并置于37℃含95% N2、5% CO2的密闭容器中缺氧2 h，然后换为复氧液在二氧化碳培养箱中复氧2 h。
③缺氧后处理组（HPC组）：缺氧2 h后，参照文献［4］方法给予缺氧后处理。
先用复氧液培养5 min，然后换为缺氧液培养5 min，复氧液5 min/缺氧液5 min重复3次，共计30 min，再继续用复氧液培养1.5 h。
④硫氢化钠后处理组（H/R+NaHS 组）：后处理方式同HPC组，用含NaHS复氧液（用复氧液配制，NaHS终浓度为1×10- 6 mo l・L-1，此浓度为预实验所选定）代替缺氧液给予后处理。
1.2.3 观察指标及检测方法每组重复6次，在5个时间点（缺氧前、缺氧2 h和复氧后 0.5 h、1 h、2 h）进行指标测定。
1.2.3.1 台盼蓝排斥试验制备单细胞悬液，调整细胞浓度为2×10-6・L-1。
然后将心肌细胞悬液0.1 ml和4 g・L-1台盼蓝溶液0.1 ml混匀，用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞数。
按公式计算细胞存活率：细胞存活率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。
1.2.3.2 LDH活性收集各个实验组培养基，按照LDH测定试剂盒说明书测定。
1.2.3.3 测定细胞内MDA和SOD 在各个需检测的时间点，吸去培养液，经超声破碎细胞后离心取上清液，按MDA和SOD测定试剂盒说明书进行测定。
1.3 统计学处理计量资料以±s表示。
多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较用 Student Newman Kenlsa法进行q检验。
检验水准：α=0.05。
2 结果2.1 培养心肌细胞的一般特性采用上述分离纯化方法培养的心肌细胞刚接种时细胞呈球形悬浮在培养液中；培养 4～6 h后开始贴壁生长，逐渐展开，伸出伪足，由圆形变为梭形、三角形或星形；12～24 h细胞基本贴壁，少数单个细胞呈现不同频率的自发性搏动(40～80次/min)；72 h后细胞伸出的伪足相互接触交织成网，逐渐形成细胞簇或细胞单层，呈放射状排列，同步节律性搏动(90～120次/min)，收缩明显而有力，形成功能性合体细胞。
2.2 心肌细胞存活率缺氧前各组细胞存活率无显著差异（P�0.05）。
H/R组在缺氧/复氧过程中细胞存活率持续下降，较Normal组显著降低（P�0.01）。
缺氧2 h时，H/R组、HPC组和H/R+NaHS组细胞存活率无显著差异（P�0.05）。