纯泰GST(GSH)亲和层析介质使用说明书

3. 装柱：
z 聚苯乙烯层析柱
1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析 柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内 空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持 水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方 滞留气泡。
2) 打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面 低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用移 液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子 内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min， 让介质自然沉降。
每次层析前，为达到最佳纯化效果，需对介质 进行再生，步骤如下：
1) 2倍介质体积高pH缓冲液（0.1M Tris-HCl, 0.5M
NaCl, pH8.5）和低pH缓 冲液（0.1M sodium acetate, 0.5M NaCl, pH4.5）交替洗脱三次。 2) 10倍介质体积缓冲液A平衡介质。 7. SDS-PAGE检测：
三、 适用范围
分离谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其 它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的 蛋白。
四、 操作说明
1. 缓冲液配制
z 缓冲液A（平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4， 1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl， 调节pH值至 8.0。
z 缓冲液 B（洗脱缓冲液）：10mM Glutathione
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1) 用10倍介质体积缓冲液A过柱，平衡介质； 2) 上样； 3) 用5~10倍介质体积缓冲液A过柱，洗去层析柱
中剩余上样液并重新平衡介质； 4) 用5~10倍介质体积缓冲液B洗脱，收集洗脱液； 5) 用5~10倍介质体积缓冲液A重新平衡介质。 注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速 保持在0.5ml/min为宜。 5. 介质清洗
mM Tris-HCl, pH8.0 z 流速：纯泰®GST 1ml，0.5ml/min；对照GST介
质 1ml，0.5ml/min 实验结果：
色谱分析结果见图1，色谱各组分的SDS-PAGE 结果见图2。
图1 GST Agarose分离GST融合蛋白色谱图 123456
1) 不同浓度SDS-PAGE分离胶分离范围
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六、GST亲和层析介质使用注意事项
1. GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓 慢，为获得最大结合量，需要保证足够的作用时间， 因而在上样时要维持较低流速。在样品中加入 5~10mM DTT可以增加介质对目标蛋白的吸附。对 于按常规步骤操作吸附效果不好的样品，可以先把
如果在使用一段时间后，介质因表面沉积过多 杂质导致蛋白结合能力下降，需对介质进行清洗。 步骤如下：
1) 沉淀或变性物质的清洗：
用2倍介质体积6 M盐酸胍清洗，然后用5倍介质 体积缓冲液A平衡介质。
2) 疏水缔合物质的清洗：
用3~4倍介质体积70%乙醇 (或2倍介质体积去 垢剂，如 1% Triton™ X-100) 清洗介质；然后用5 倍介质体积缓冲液A平衡介质。 6. 介质再生
包装规格 5ml 25ml 100ml
>200ml 2×1ml 1×5ml
说明 6% 交 联 琼 脂 糖 凝 胶 ， 动 态 载 量 约 15mg/ml，享受配套购买缓冲试剂、层 析柱 8 折优惠
单次购买量 含 2 根 1ml 重力预装柱 含 1 根 5ml 重力预装柱
市场价 1100 5200 1HCl，调节 pH 值至
8.0。因 Glutathione 易氧化，需现用现配。
____注__：__各__种___溶__液__配___制__完__毕___后__，__最__好__进___行__脱__气___处__理__，__0_._45
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3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平 面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片 与介质接触面滞留气泡（如对实验结果要求不 严，也可不放入上垫片，以提高流速）。
4) 在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可 先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒 出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、3）所 述步骤重新装柱。
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五、 GST Agarose分离GST融合蛋白实例 z 层析介质：纯泰®GST 1ml；对照GST介质（国
际领先品牌）1ml z 样品：表达可溶性 GST-tag 融合 thioredoxin 的
大肠杆菌 BL21 裂解液 z 结合缓冲液：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，
140mM NaCl，2.7mM KCl，pH 8.0 z 洗脱缓冲液：10 mM Glutathione（还原型）, 50
分离胶浓度 分离范围
6%
50～150kD
8%
30～90kD
10%
20～80kD
12%
12～60kD
15%
10～40kD
2) SDS-PAGE操作流程
A. 每个胶孔最适蛋白上样量为5~10μg。
1.低分子量 Marker；2.上样液； 3.纯泰®GST-流穿液；4.纯泰®GST-洗脱液； 5.对照-流穿液；6.对照-洗脱液
二、 性能参数
特点
基团密度高，载量大
基质 吸附载量 介质平均粒径 最大流速 pH范围 使用温度 保存温度 保存液体
化学稳定性
6%的交联琼脂糖凝胶
≥15mg GST融合蛋白（55kDa）/ml 100μm 300cm/h
3~10，在位清洗时pH范围可到2~11 常温
+4~8℃ 20%乙醇 室温下可在0.1M柠檬酸(pH 4.0)，0.1 M NaOH ， 70% 乙 醇 或 6M 盐 酸 胍 中 耐 受 2h，蛋白结合能力不受影响
Xa因子从融合蛋白中切除。蛋白酶解后，再用GST 亲和层析方法去除GST标签，目标蛋白存在于流出 液中。一般情况下，与切除GST标签后得到的外源 蛋白相比，凝血酶用量极小，如果后续实验要求不 严格，不需进一步除去与外源蛋白共存与洗脱液中 的凝血酶。如需除去凝血酶，则可将样品用pH7~8 的缓冲液溶解，然后直接过1ml的苯甲脒琼脂糖凝 胶或者肝素琼脂糖凝胶吸附凝血酶。
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解决方案：向缓冲液A和缓冲液B中加入1mM PMSF抑制蛋白酶活性，或0.1％TritonX-100或0.1％ Tween-20等稳定剂。 2) GST融合蛋白不完全表达
GST 融 合 蛋 白 有 时 候 只 表 达 到 GST 部 分 就 终 止，GST标签蛋白连同完全表达的融合蛋白均能与 介质结合并被洗脱下来，因而洗脱液中出现26KD 左右的杂带。
GST亲和层析介质使用说明书（完全版）
一、 简介
GST亲和层析介质（GST Agarose）是专门设计 用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其 它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋 白的分离介质，一步分离就可得到高纯度的GST融 合目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。
本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶，具 有优良的物理和化学稳定性，使用寿命长，操作方 便，批次重复性好，易于放大，是研发与生产的理 想选择。
解决方案：尝试用不同浓度的还原型谷胱甘肽 洗脱；优化表达条件，降低GST融合蛋白不完全表 达量；改变外源基因在载体中插入的酶切位点，重 新构建表达载体；在不改变外源基因两端酶切位点 的情况下，更换通用载体。 5. 如后续实验需要除去洗脱液中还原型谷胱甘 肽，可采用超滤或透析的方法。
七、GST标签切除 GST标签可用位点专一的蛋白酶如凝血酶或
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介质和样品混合，轻轻振摇2~4h，再装柱，用平衡 缓冲液进行重新平衡、洗脱等操作。 2. 不同的GST融合蛋白取得最佳纯化效果所需还 原型谷胱甘肽浓度、洗脱体积和洗脱时间可能有所 不同。必要时需对流穿液、洗脱液进行SDS-PAGE 以及Western杂交分析，以确定最佳纯化条件。 3. GST融合蛋白以包涵体形式存在时不能与介质 结合，必须先进行变性、复性、透析处理后才能用 介质进行纯化。纯化效果取决于复性效率。 4. 纯化后出现杂带的常见原因 1) 目标蛋白断裂或酶解
八、特色服务
1. 购买指定数量的介质，免费赠送优质层析柱。
介质规格
赠品层析柱规格
5ml GST Agarose
1ml 聚苯乙烯层析柱 1 支
10ml GST Agarose
5ml 聚苯乙烯层析柱层析柱 1 支
25ml GST Agarose 1ml 及 5ml 聚苯乙烯层析柱各 1 支
2. 接受委托开发各种生物大分子的分离纯化介质 和配套工艺。
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μm 滤膜过滤备用。 2. 样品预处理：
按每克湿重菌体/2~5ml 平衡缓冲液的比例充 分悬浮离心收集的菌体；600w 功率，每循环超声 3s，冷却 3s，循环 99×3 次,破碎菌体；4℃、15000rpm 离心 15m，收集上清液，或用 0.45μm 滤膜过滤。
z 玻璃层析柱 1) 将层析柱洗净后垂直固定到铁架台上；向柱中