亲和层析
5. 亲和层析
加入过量的小分子伯氨基试剂封闭多余的活化基团
封闭的试剂有乙醇胺、葡萄糖胺、甘氨酸、谷氨酸、甘露 糖等。
①配基偶联量 (μmol／g 或μmol／ml)。
②样品吸附量 (mg／s或mg／ml)。
③化学稳定性 ④耐酸碱 抗氧化物，配基不降解。
如pH3～10。
1. 亲和层析实验流程 2. 吸附条件的选择
①竞争性洗脱
②离子强度洗脱 ③pH+离子强度洗脱 ④变性剂洗脱 ⑤化学断裂
①一步洗脱：非选择性洗脱。 ②分步洗脱：选择性洗脱。 ③梯度洗脱：选择性洗脱， 洗脱液浓度梯度变化
①0.5-1.0 mol／L NaCl中性盐处理，除去离子性
较强的杂质。
②异丙醇处理，除去疏水性较强的杂质。 ③6 mol／L 脲处理，除去中性分子杂质。 ④6mol／L 盐酸胍处理，除去中性分子杂质。
3. 洗脱条件的选择
4. 洗脱方式 5. 亲和介质的处理
6. 亲和层析介质的保存
1. 亲和层析实验流程
装柱、平衡与上样品 亲和层析 介质
洗去 未吸附杂质
预处理
洗脱 收集洗脱峰
层析柱：吸附容量、待分离物质的总量 平衡缓冲液：pH和pI、上样体积、温度和流速等 因素
多次吸附，使纯化对象与配基充分作用
第5章 亲和层析
一、亲和层析的特点
第7章 亲和层析
二、配体的选择
理想的配体应具有以下一些性质： 1) 配体与待分离的物质有适当的亲和力。亲和力太弱，待分 离物质不易与配体结合，造成亲和层析吸附效率很低。而且 吸附洗脱过程中易受非特异性吸附的影响，引起分辨率下降。 但如果亲和力太强，待分离物质很难与配体分离，这又会造 成洗脱的困难。总之，配体和待分离物质的亲和力过弱或过 强都不利于亲和层析的分离。应根据实验要求尽量选择与待 分离物质具有适当的亲和力的配体。
4) 配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够 耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以 多次重复使用。
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为 两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体 （general ligand）。 特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生 物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶 和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异 性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性 是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一 般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子， 要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。
例如胰蛋白酶的天然蛋白质类抑制剂有胰脏蛋白酶 抑制剂（pancreatic trypsin inhibitor，PTI），卵粘蛋白 （ovomucoid）和大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor，STI）等，小分子抑制剂有苄脒 （benzamidine）、精氨酸和赖氨酸。这些抑制剂均可作 为亲和纯化胰蛋白酶的配基，但与酶的结合常数各不相同。 例如，STI与胰蛋白酶的结合常数达109L/mol以上，而对 氨基苄脒（p-aminobenzamidine）与胰蛋白酶的结合数约 为4×104L/mol（25℃）。
亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法亲和层析是一种分析方法，通过利用物质之间的亲和性来分离和分析目标物质。
它基于物质之间的特异性亲和作用，通过将目标物质与具有亲和性的固相材料结合，实现目标物质的富集和分离。
亲和层析的原理是基于生物分子之间的亲和性。
在生物体内，许多分子之间存在着特定的亲和性相互作用。
例如，抗体与抗原之间的结合就是一种典型的亲和性相互作用。
利用这种亲和性原理，可以将含有特定抗原的样品与具有相应抗体的固相材料结合，然后通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析的方法包括亲和层析柱和亲和层析片。
亲和层析柱是将具有亲和性的固相材料填充在柱子中，样品通过柱子时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则通过柱子。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析片则是将具有亲和性的固相材料固定在薄膜上，样品与薄膜接触时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则被排除。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从薄膜上分离出来。
亲和层析方法具有许多优点。
首先，亲和层析可以选择性地富集目标物质，从而降低了样品中其他干扰物质的影响。
其次，亲和层析具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以检测到低浓度的目标物质。
此外，亲和层析还具有快速、简单和可重复性的优点，适用于大规模的样品分析。
亲和层析在许多领域中得到了广泛的应用。
在生物医学领域，亲和层析可以用于分离和富集特定蛋白质或生物分子，以便进行后续的分析和研究。
在药物研发中，亲和层析可以用于筛选和分离具有特定药物靶点亲和性的化合物。
在环境监测和食品安全领域，亲和层析可以用于检测和分离目标污染物或有害物质。
亲和层析是一种基于亲和性相互作用的分析方法，通过选择性地富集和分离目标物质，实现了样品的准确分析。
亲和层析方法具有许多优点，并在各个领域中得到了广泛应用。
未来随着技术的不断发展，亲和层析方法将进一步完善和应用于更多的领域，为科学研究和工业生产提供更多的可能性。
亲和层析
3、含有辅酶的酶类的亲和层析； 4、酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析；
5、肝素为配体的亲和层析；
6、染料配体亲和层析； 7、金属螯合层析；
例如：凝集素和糖蛋白的亲和层析—凝集素是在自然界广泛存在的一大类糖结合
蛋白。它们具有不同的糖结合专一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不
蛋白质亲和层析中的合适配体
配体 抗原 待纯化的蛋白质 特定单克隆抗体或多克 隆抗体 配体 肝素 待纯化的蛋白质 凝聚因子、脂酶、结缔组 织蛋白酶、DNA聚合酶
单克隆抗体 蛋白质A、 蛋白质G
蛋白酶抑制 剂 磷酸
特定抗原 免疫球蛋白
蛋白酶 磷酸酶
胆固醇 脂肪酸
核苷酸 苯基硼酸盐
胆固醇受体、胆固醇结合 蛋白 脂肪酸结合蛋白、白蛋白
五、亲和层析
（一）亲和层析的概念：
1、亲和力：根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子特异识别和
可逆结合的特征,将生物分子间的这种结合能力称为亲和力.
2、亲和层析法：利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性吸附而进行选 择性分离的一种生物大分子分离的层析方法。
（二）亲和层析法的原理：
在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一般反应性能的间隔臂,随后 再连接配体（酶、抗原、激素等）组成固定相,而固载的配体高选择地吸附与其 有生物特性的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析柱,保留在柱上
方法 特异性配体亲 和层析法
通用性配体亲 和层析法
配体
性能
复杂的生命大分子物 具有较强的吸附选择性和 质（如抗体、受体和 较大的结合力 酶的类似底物等） 简单的小分子物质 成本低廉，具有较高的吸附 （如金属、染料、以 容量，通过改善吸附和脱附 及氨基酸等） 条件可提高层析的分辨率
亲和层析原理和步骤
亲和层析原理和步骤亲和层析（affinity chromatography）是一种常用的分离和纯化靶标蛋白的方法。
它利用配体与目标蛋白的高亲和力来实现目标蛋白的选择性结合和纯化。
亲和层析的原理和步骤如下。
一、亲和层析的原理亲和层析的原理基于配体与目标蛋白之间的特异性结合。
配体是一种具有特异性反应性的化合物，可以和目标蛋白的结构域或位点发生特异性作用。
在亲和层析中，配体被固定在固定相上，也可以被连接到大分子载体上，形成亲和层析介质。
当样品通过亲和层析柱时，目标蛋白会与配体发生选择性结合，而其他非目标蛋白则不结合或弱结合，从而实现了目标蛋白的分离和纯化。
亲和层析的步骤通常包括以下几个方面：2.固定配体：将配体固定在固定相上是亲和层析的关键一步。
固定相可以是固定在柱子内壁的小分子配体，也可以是连接在大分子载体上的配体。
常用的固定剂包括琼脂糖、丙烯酰胺凝胶、硅胶等。
3.样品准备：在进行亲和层析之前，需要对样品进行准备。
通常包括细胞裂解、蛋白质提取、预处理等步骤。
样品中的废物和干扰物需要被去除，以便目标蛋白的有效分离和纯化。
4. 亲和层析操作：样品通过亲和层析柱时，目标蛋白与配体发生特异性结合。
通常需要选择适当的Buffer、pH值和盐浓度等条件来提高结合效率。
非目标蛋白会通过柱子流失，而目标蛋白则留在柱子中。
目标蛋白可以通过洗脱步骤从柱子中进行脱附。
5.洗脱与纯化：在洗脱过程中，目标蛋白从亲和层析柱中脱附。
洗脱条件需要根据结合强度和目标蛋白的特性来选择。
常用的洗脱方法包括pH值的调节、离子浓度的变化、配体浓度的变化等。
洗脱后的目标蛋白可以通过浓缩和纯化步骤得到纯品。
二、亲和层析的优缺点亲和层析作为一种分离和纯化方法，具有以下优点：1.特异性：亲和层析可以选择性地结合目标蛋白，从而实现与其他非目标蛋白的分离。
2.高纯度：亲和层析可以显著提高目标蛋白的纯度，使其达到实验或工业应用的要求。
3.选择性：亲和层析可以基于不同的配体，实现对不同蛋白的选择性结合和纯化。
亲和层析法
第三节 提高吸附剂的操作容量
亲和吸附剂的操作容量的影响因素： 配体性质 配体在吸附剂中的含量 配体与吸附物结合时的位阻效应大小、 基质的多孔性 操作条件 等因素
一、在配体和基质之间引入“手臂”
1．原理
在配体和基质之间，特 别是在小分子的配体 和基质之间，引入适 当长度的“手 臂 ” ( arm)， 使 配 体 离开基质的骨架，
• 将琼脂糖衍生物与溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物 反应(见图7-9)后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基 团的化合物反应，
• 即可生成一系列具有长短不等“手臂”的亲和吸附剂，
二、增加配体取代的程度
对一些解离常数较大的配体而言，增加配体在基质上 的浓度也是增加吸附剂结合量的有效手段。
增加配体数的方法是： 在配体量一定时，随着基质活性基团的增加(通过活化 时pH值的提高和溴化氰量的增加)偶联配体的量也相
• ①亲和力比较小时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗 脱，得到迟缓的大分子物质峰。
• ②亲和力一般时，主要靠改变缓冲液的性质(如改变 pH值或离子强度，或者同时改变pH值和离子强度)， 使复合物之间的亲和力下降到足以分离的程度。
• ③亲和力较强时，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白 质变性剂洗脱。
A．竞争性洗脱剂 这类洗脱剂的优点是专一性强，并能洗脱出和配体特 异结合的大分子物质。
• 2)间接测定法
①推算法
一般情况下，从加入配体的数量中减去配体与活化琼脂糖偶联后洗涤出 来的配体量，即可大致推算出配体的结合量。 ②根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量 其方法有： 一是把亲和吸附剂装入柱(0.5cm×10cm)内，加入过量的欲分离大分子 物质，使其结合量达到最大，用适当的洗涤剂彻底洗去非专一性的物质， 然后再用特异的洗脱剂洗出欲分离的大分子物质。根据分离出的大分子 物质的量，计算出配体的结合量。 二是把少量纯品大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和平衡为止，
亲和层析
样品制备
样品浓度
尽量适度，即有利于充分交换，又节省操作时间
样品组成
离子组成尽量与上样缓冲液相同，如果不同，可以 通过过滤、脱盐或者透析更换。
层析柱的规格
装柱体积适于蛋白的样品量 5-40% 可用载样量 柱长 5-10 cm
Short, fat
洗涤
样品吸附上柱后，要用几倍起始缓冲液的体 积过柱洗去杂质，可以适当增加离子强度洗 去静电吸附的非特异性结合物。当OD280吸光 值回到基线时，停止洗涤。
洗脱液中含量较少
1、咪唑浓度低 2、降低pH洗脱（低于pH3.5以下，离子会有大量脱落） 3、+4 °C洗脱过夜
优化条件
1、起始缓冲液中加入咪唑，如20mM，以减少杂蛋白。 2、线性洗脱，探索纯度高的洗脱梯度。 3、使用其他离子，如Zn（吸附较弱）或Cu（吸附较强）等
亲和层析的应用? 亲和层析的应用
声前加融菌酶） 2、柱子平衡液以及样品缓冲液中没有EDTA、DTT等 使用过的柱，是否已经再生。 3、降低起始缓冲液中咪唑的浓度有利于融合蛋白的吸 附 4、是否过载，chelating sepharose 大约12mg/ml。 5、融合蛋白可能是包涵体表达，破菌上清不含融合蛋 白 6、Ni离子是否已经鳌和好了。
Protocols for cleaning-in-place (CIP), 清洁和灭菌
去除沉淀蛋白 4个柱体积的0.5-1.0 M NaOH ，线性流速40 cm/h ，然后使用水清洗2-3 个柱体积 。 去除强结合的疏水蛋白、脂蛋白和脂类 4-10 个柱床体积的70% ethanol 或30% isopropanol ，然后使用3-4个柱 体积或1-2个柱体积的0.5% non-ionic detergent (e.g. in 1 M acetic acid) ， 然后使用5个柱体积的70% ethanol 去除去污剂，最后3-4个柱体积的水。 清洁 0.5-1.0 M NaOH 接触时间 30-60min. 灭菌 高压介质 121 °C 15 min.
亲和层析名词解释
亲和层析名词解释
亲和层析是一种蛋白质分离技术，是将亲水性聚合物——聚丙烯酰胺按预先设计的程序加入到样品溶液中，以胶束为架桥剂。
当待测蛋白质在一定浓度梯度的聚合物溶液中通过胶束时，吸附在胶束上并随之进入疏水相中的待测蛋白质就会被高度保留在胶束周围，然后用洗脱缓冲液洗脱，最后将得到的疏水性高聚物的清液在超声波场作用下去除。
由于蛋白质和聚丙烯酰胺之间的特异性吸附，使蛋白质在层析液中移动形成特征的拖尾现象。
亲和层析是利用层析介质表面上所固有的吸附力，将物质分配到具有不同吸附能力的两相之间，形成彼此分离的各个分子层。
亲和层析的种类很多，常见的有：亲和柱层析、疏水膜层析、液膜层析等。
亲和层析技术由英国纽卡斯尔大学与美国加州大学伯克利分校
共同开发的一种新型的蛋白质分离技术，它可以直接分离纯化蛋白质。
亲和层析技术的原理基于吸附与解吸附的机理，当待分离物质从层析柱移动时，由于受到吸附介质的吸附，使得该物质的分子量下降，经分离后达到分子量高的蛋白质的峰展宽，而分子量低的蛋白质的峰缩窄甚至消失。
这样就把峰位展宽或展宽消失的蛋白质区分开来，分别采集收集它们的蛋白质样品。
这种方法对层析介质的选择十分重要。
常用的层析介质有以下几种。
1、固相支持物质； 2、疏水固体颗粒；
3、多孔介质。
亲和层析亲和层析技术是在疏水性载体上，借助于疏水性基团对蛋白质的选择性吸附而进行分离纯化的。
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Fig5 . Principle of preparing AC media来自 第三节：亲和层析的基本操作方法：
1.平衡（
Equilibration）
用平衡Buffer 冲洗柱体，至基线平稳.
2. 样品上柱和冲洗：
（Sample application and wash） 样品中的目的物与层析介质选择 性的吸附，杂质不被吸附。用上样 Buffer冲洗柱体，杂质被冲洗下来。 形成杂质峰（见下图）。
3： 基质（matrix):亦称为载体（vector):是
构成固定相的骨架 。
二：亲和层析有如下特点： (Characteristics of Affinity Chromatography)
1:纯化过程简单、迅速. 2:分离效率高。 3:产物纯度高。 4:必须针对某一分离对象制备专一的配基及 寻求稳定的层析条件。
( Fig1. Mechanism of AC)
( Fig2. Mechanism of AC)
具有特异性亲和作用的生物分子 四：配基的种类:(sorts of ligand)
1：抗原与抗体。 2：DNA与互补DNA或RNA（cDNA、 mRNA)。 3：酶与其底物。 4：激素与其受体。 5：维生素与结合蛋白。 6：糖蛋白与植物凝集素。
五：亲和层析载体的性质与选择
亲和层析载体的选择(selection of vectors)
1：多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的 大分子自由通过。 2：颗粒均匀，具有良好的流速。 3：具有惰性，尽量减少非专一性吸附。 4：在温和的条件下 能与配基共价偶联。
亲和层析载体的性质与选择 六：常用的亲和层析载体：
第一节： 亲和层析（Affinity Chromatography）的基本概念及特点： 一、 基本概念：(basic concept)： 1： 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配基
之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术. Typically offers purities >95% in one step. 2： 配基（ligand） ：被固定在基质上的分 子称为配基，配基和基质是以共价键结合的。
亲和层析配基的性质与选择
配基的偶联:
1： 酸酐法 2： 羟基琥珀酰亚胺法 3：叠氮化作用 4：还原性烷基化合物（西夫碱）的形成
第二节:载体、配基、目的物的连接： (Conjunction of vector、ligand and target material)
载体（Vectors or Matrix) + 配基（Ligand) + 目的物（target material） 见(Fig3,Fig4, Fig5)
(Vectors of Affinity Chromatography)
1：纤维素 (cellulose) 2：葡聚糖凝胶 (Sephadex) 3：琼脂糖凝胶 (Sepharose) 4：聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel P) 5：多孔玻璃珠 (Bio-Glass) 6：其它新型载体 (Other gels)
七： 亲和层析配基的选择 (Selection of ligand)
1.纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力. 2.但亲和力太高也是有害的，因为在解离配 基复合物时所 需的条件就要强烈，这样可 能使生物分子变性。 3.配基必须具有适当的化学基团，可用于和 载体相连，同时又不影响配基与生物分子 之间的亲和力。
因此应用范围受到一定的限制。
三：亲和层析的基本原理
(Mechanism of Affinity Chromatography)
1：亲和的一对分子中的一方以共价键形式 与不溶性载体相连作为固定相吸附剂。 2：当含有混合组份的样品（流动相）通过 此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力 的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲 和力的无关组份就随流动相流出。 3：然后改变流动相成份，将结合的亲和物 洗脱下来。（见Fig1、Fig2)。
生物制药工艺学
Biopharmacetical
Technology
第七章 亲和层析 Affinity Chromatography
亲和层析
( Affinity Chromatography, AC)
亲和层析的基本概念 亲和层析载体的性质与选择 亲和层析配基的性质与选择 载体、配基、目的物的连接（难点） 亲和层析的基本操作(重点）
Fig 3. AC relies upon a reversible highly specific binding reaction.
Fig4 .Spacer arm principle
A spacer is sometimes used to ensure full accessibility of the affinity ligand.
3. 洗脱（Elution）
选择适当的条件，将吸附在亲和介质 上的目的物解吸下来（见下图）。