DNA甲基化详解
DNA甲基化解析
DNA甲基化DNA甲基化（DNA methylation）是最早发现的修饰途径之一，大量研究表明，DNA 甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
含义：在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列。
大多数脊椎动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5' 端的非编码区，并成簇存在。
甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。
DNA的甲基化可引起基因的失活，DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA的过渡，由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的原件缩入大沟而不利于转录的起始，导致基因失活。
另外，序列特异性甲基化结合蛋白（MBD/MeCP）可与启动子区的甲基化CpG岛结合，阻止转录因子与启动子作用，从而阻抑基因转录过程。
DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7－甲基鸟嘌呤（7-mG）结构基因：含有很多CpG 结构，2CpG 和2GPC 中两个胞嘧啶的5 位碳原子通常被甲基化，且两个甲基集团在DNA 双链大沟中呈特定三维结构。
基因组中60%～90% 的CpG 都被甲基化，未甲基化的CpG 成簇地组成CpG 岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。
有实验证明超甲基化阻遏转录的进行。
DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化，使DNA 失去核酶ö限制性内切酶的切割位点，以及DNA 酶的敏感位点，使染色质高度螺旋化，凝缩成团，失去转录活性。
5 位C 甲基化的胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶（C-T转换），由此可能导致基因置换突变，发生碱基错配，如果在细胞分裂过程中不被纠正，就会诱发遗传病或癌症。
解读DNA甲基化
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3、DNA甲基化与表观遗传学
• 基因组印迹的分子机理与甲基化密切相关。DNA 甲基化模式的维持对基因印迹在亲子代之间的遗 传是必须的。 • 生长发育过程中，雌性哺乳类动物细胞中的两条 X染色体其中一条失去活性的现象。 X染色体上存 在一个与X染色体失活有密切联系的核心部位。 核心区命名位X染色体失活中心。失活的染色体 上DNA序列都呈高度甲基化，导致绝大多数基因 转录处于关闭状态。
肿瘤的去甲基化治疗
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DNA甲基化程度依赖于DNMT活性。正常甲
基化模式的建立需要DNMT1和DNMT3的共同作用， DNMT1是DNMT3启动CpG核苷酸从头甲基化的保证，而 DNMT3则使甲基化水平稳定在正常需要水平（去甲基化
）
—— 抑制DNMT活性药物是治疗肿瘤的新希望
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DNA甲基化的生物学功能
1. 2. 3. 4. 5. DNA甲基化与遗传物质的稳定性 DNA甲基化与基因表达调控 DNA甲基化与表观遗传学 DNA甲基化与胚胎发育 DNA甲基化与肿瘤
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1、DNA甲基化与遗传物质的稳定性
a) 研究证明细菌DNA复制起始与DNA甲基化以及DNA 与细菌质膜的相互作用有关。DNA便甲基化作为一 种标签决定了复制起始点与细胞膜的结合，控制了 复制起始，使得DNA复制与细胞分裂保持一致。 b) DNA错配修复（mismatch repair）作为细胞增殖过 程中纠正DNA复制错误的重要手段，对保证DNA复 制的忠实性与基因组的稳定性起重要作用。复制后 双链DNA在短期内（数分钟）保持半甲基化状态， 错配修复系统从而能够区分“旧链”与“新链’”， 为校正新链中掺入的错误碱基提供了理想的分子标 记。
甲基化特点-概述说明以及解释
甲基化特点-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述：甲基化是一种重要的表观遗传学修饰方式，指的是DNA分子上的甲基基团与蛋白质相互作用，通过改变DNA的结构和功能来影响基因的表达。
甲基化在生物学中扮演着至关重要的角色，可以影响细胞的分化、发育和疾病的发生。
本文将重点介绍甲基化的定义、在生物学中的重要性以及甲基化的机制，旨在加深对这一重要生物学现象的认识。
1.2 文章结构文章结构部分的内容应该包括对整篇文章的组织和内容安排进行介绍。
在这个部分，我们可以简要说明本文分为引言、正文和结论三个部分，每个部分包含几个小节，以及各个小节的主要内容和要点。
同时也可以提及文章的主题和独特性，以引起读者的兴趣。
具体内容可以包括：本文共分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分主要介绍了甲基化的概念和背景，以及本文的研究目的和意义。
正文部分涵盖甲基化的定义、在生物学中的重要性和甲基化的机制三个主要话题，详细介绍了甲基化在基因表达和细胞分化中的作用。
结论部分对整篇文章进行了总结，强调了甲基化的特点和在疾病中的作用，同时展望了未来的研究方向。
通过本文的阐述，读者将对甲基化的重要性和机制有更深入的了解，同时也能够了解到甲基化在疾病中的可能作用，为未来的研究提供了一定的参考和展望。
1.3 目的:本篇文章的目的在于探讨甲基化的特点，深入探讨甲基化在生物学中的重要性以及其机制。
通过对甲基化的定义和相关知识的介绍，使读者对甲基化有更深入的了解。
同时，通过对甲基化在疾病中的作用和未来研究方向的展望，拓展对甲基化在生物学领域中的应用和研究价值的认识，为未来相关研究提供启示和参考。
希望通过本文的深入探讨，能够进一步促进甲基化研究领域的发展，为生物学领域的进步和发展提供新的思路和方向。
2.正文2.1 甲基化的定义:甲基化是一种生物化学反应，指的是DNA分子上甲基基团的添加。
甲基基团是由一个碳原子和三个氢原子组成的小分子，通过DNA甲基转移酶酶的作用，可以将甲基基团加到DNA的嘌呤或嘧啶碱基上。
DNA甲基化
DNA甲基化DNA甲基化概述在哺乳动物基因组中，甲基化是一种表观遗传机制，包括将甲基转移到胞嘧啶的C5位置形成5-甲基胞嘧啶。
DNA甲基化通过招募参与基因抑制的蛋白或通过抑制转录因子与DNA的结合来调节基因表达。
在发育过程中，DNA甲基化的模式在基因组中发生变化，这是DNA 从头甲基化和去甲基化的动态过程的结果。
DNA甲基化是被一个甲基转移酶家族所催化，转移S腺苷甲硫氨酸(SAM)的一个甲基到第五个碳胞嘧啶残基形成5mc , Dnmt3a和Dnmt3b可以建立一个新的DNA甲基化模式来去修饰DNA，被称为从头甲基化。
另一方面，Dnmt1在DNA复制过程中起作用，将亲代DNA链上的甲基化模式复制到新合成的子链上。
这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。
这三种DNA都广泛参与胚胎的发育。
当细胞到达终末分化时，Dnmt的表达大大降低。
这似乎表明有丝分裂后细胞的DNA甲基化模式是稳定的。
大部分DNA的甲基化发生在鸟嘌呤核苷酸或CpG位点之前的胞嘧啶上。
总的来说，哺乳动物基因组中CpG位点的减少可能是由于5 - mc可脱氨成胸腺嘧啶的诱变潜力。
剩余的CpG位点分布在整个基因组中，除了CpG岛外，它们都被严重甲基化。
DNA甲基化对沉默逆转录病毒分子、调节组织特异性基因表达、基因印记和X染色体失活至关重要。
不同基因组区域的DNA甲基化可能根据潜在的遗传序列对基因活动产生不同的影响。
一、DNA甲基化的位置1.1 基因间区大约45%的哺乳动物基因组由转座因子和病毒因子组成，这些因子被大量甲基化而沉默。
这些元素中的绝大多数是通过DNA甲基化或随着时间的推移由于5mC的破坏而产生的突变而失活的。
如果表达，这些元素是潜在的有害的，因为它们的复制和插入可以导致基因损坏和DNA突变。
胞内颗粒(IAP)是小鼠基因组中最具侵袭性的逆转录病毒之一。
在整个生命过程中，IAP在配子形成、发育和成年阶段都被高度甲基化。
甚至在胚胎内部，当基因组其余部分相对低甲基化时，Dnmtl维持对IAP元件的抑制。
DNA甲基化与临床应用医学知识讲解
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应用前景3--肿瘤旳去甲基化治疗
➢ DNA甲基化程度依赖于DNMT活性。正常甲基化 模式旳建立需要DNMT1和DNMT3旳共同作用， DNMT1是DNMT3开启CpG核苷酸从头甲基化旳 确保，而DNMT3则使甲基化水平稳定在正常需要 水平（去甲基化） —— 克制DNMT活性药物是治疗肿瘤旳新希望
应用前景3--肿瘤旳去甲基化治疗
31 引言及概念 2 甲基化旳作用 3 甲基化检测有关技术 4 临床有关应用
甲基化检测有关技术
A．基因组甲基化水平(Methylation Content)旳分析
1. 高效液相色谱 2. 高效毛细管电泳法
B．候选基因(Candidate Gene)甲基化分析
1. 甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法 2. 重亚硫酸盐测序法 3. 甲基化特异性旳PCR 4. 甲基化荧光法(MethyLight) 5. 焦磷酸测序 6. 结合重亚硫酸盐旳限制性内切酶法
DNA甲基化在动物胚胎和生殖细胞发育过程中旳重编程
转录克制
CPG island旳功能：经过甲基化与去甲基化，调控下游基因旳体现 —— 基因体现旳调控开关
影响基因体现
直接克制基因体现或甲基化 旳 CpG双核苷酸序列可被甲基结 合蛋白家族 辨认，而后者可经过 吸引补充组蛋白去乙酞化酶和组 蛋白甲基化转移酶等组蛋白修饰 蛋白质来变化染色质旳活性 ，以 间接方式影响基因体现。
cfDNA甲基化液体活检技术
燃石医学自主研发了无创甲基化检测系统 (MERMAID™)，利用多层级甲基化探针设计策略， 可实目前检测成本可控旳情况下同步检测超出10万个 临床诊疗有关旳甲基化CpG位点，并经过机器学习 算法建立分类模型，实现对检测样本自动分型。
DNA甲基化——表观遗传学的重要组成部分
DNA甲基化——表观遗传学的重要组成部分DNA甲基化是一种表观遗传学调控机制，通常指DNA分子上的甲基化修饰。
这种化学变化涉及DNA链上的甲基基团与Cytosine碱基的配对，对基因表达和细胞分化等生命过程具有重要作用。
DNA甲基化不仅在正常生长发育中发挥至关重要的作用，而且也涉及很多人类疾病的发展。
本文将介绍DNA甲基化的基本原理、分布方式、调控机制及其在疾病中的作用。
一、DNA甲基化的基本原理DNA是由4种不同的核苷酸构成的，其中包括Adenine、Thymine、Cytosine和Guanine。
DNA的甲基化通常发生在Cytosine碱基的C5位，即通过甲基基团与细胞内的S-Adenosyl Methionine（SAM）反应，形成5-甲基Cytosine（5mC）。
DNA甲基化是基因组合成和生物遗传变异的关键机制之一。
它可以调控基因的表达和细胞分化，与疾病的发展密切相关。
虽然越来越多的研究表明，DNA甲基化是一种可逆的表观遗传修饰，但它仍然是一种稳定的标记，可以被逐代遗传，影响基因表达和细胞分化。
二、DNA甲基化的分布方式DNA甲基化在不同种类和类型的细胞中存在和分布不同。
在人体内，DNA甲基化主要发生在GC富集区域，如基因启动子、繁殖起始点、转录因子结合区等。
这些区域往往影响到基因表达的调控，因此被视为关键的甲基化信号的地点。
另一方面，DNA甲基化还出现在基因体内部的非编码区域，如intron、intergenic regions、satellite DNA和telomeres。
虽然对它们的确切功能还有争议，但这些甲基化信号可能参与调控DNA复制、染色体结构和修复。
三、DNA甲基化的调控机制DNA甲基化是由DNA甲基转移酶（DNMTs）负责催化核苷酸中的甲基基团的加成。
DNMTs可以对一些具有特定序列和结构的DNA区域进行偏好性的甲基化修饰。
这些区域的一个重要特征是在基因表达和细胞分化中发挥着重要的作用。
dna甲基化作用及与亲本印记的关系
dna甲基化作用及与亲本印记的关系DNA甲基化是一种生物学过程，它涉及在DNA分子中添加甲基基团（-CH3）。
这一过程在许多生物体中都普遍存在，包括人类。
DNA 甲基化在基因表达调控、胚胎发育、细胞分化和生物体的稳态维持等方面发挥着重要作用。
与亲本印记（imprinting）的关系则是指某些基因的甲基化状态是由亲本遗传的，而不是由其它环境或遗传因素决定的。
以下是DNA甲基化作用及其与亲本印记的关系的一些关键概念：1.DNA甲基化作用：•DNA甲基化主要发生在DNA分子的胞嘧啶（Cytosine）基上，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）。
•这一甲基化作用通常发生在CpG二核苷酸对（CpG位点），其中CpG二核苷酸对是DNA中富含的一种碱基对。
2.基因表达调控：•DNA甲基化可以对基因的表达进行调控。
通常，DNA甲基化会抑制基因的转录过程，使得该基因在细胞中的表达水平降低。
•在一些情况下，甲基化还可能影响某些转录因子的结合，从而影响基因表达。
3.亲本印记（Imprinting）：•亲本印记是指某些基因在传递到后代时保持亲本来源的特定甲基化模式。
这意味着在一个基因座上，来自母亲的基因副本和来自父亲的基因副本具有不同的甲基化状态。
•亲本印记在胚胎发育和细胞分化等过程中起着重要作用。
4.细胞分化和发育：•在胚胎发育过程中，亲本印记在特定的基因座上产生差异化。
这种差异化在胚胎早期的细胞分裂过程中就已经开始。
•亲本印记的建立与维持对于正常的胚胎发育和细胞分化至关重要。
5.与疾病的关联：•异常的DNA甲基化和亲本印记与一些遗传性疾病、肿瘤等疾病的发生有关。
例如，一些疾病可能涉及到特定基因座上的DNA甲基化异常。
总体而言，DNA甲基化在生物体内的调控机制和亲本印记的形成是一个复杂的生物学过程，对于正常的发育和细胞功能维持至关重要。
研究人员正在深入研究这些过程，以更好地理解它们在生物体内的功能和与疾病的关联。
dna甲基化名词解释
DNA甲基化名词解释什么是DNA甲基化？DNA甲基化是指在DNA分子中加入甲基基团（CH3）的过程。
甲基基团可以与DNA 中的胞嘧啶碱基（Cytosine，C）相连，形成5-甲基胞嘧啶（5-Methylcytosine，5mC）。
为什么DNA甲基化重要？DNA甲基化在生物体中起着重要的调控作用。
它可以影响DNA的稳定性、基因的表达和细胞的功能。
DNA甲基化在个体发育过程中起着关键的作用，也与许多疾病的发生和发展密切相关。
DNA稳定性维护DNA甲基化可以稳定DNA分子的结构，防止DNA双链解旋和酶切。
在DNA复制和修复过程中，甲基化可以保护DNA不受到不必要的修复或降解。
基因表达调控DNA甲基化可以直接或间接地影响基因的转录和翻译过程，从而调节基因的表达。
在一些基因的启动子区域，高度甲基化可以阻止转录因子结合，从而抑制基因的转录。
相反，低度甲基化可以促进基因的转录。
细胞功能调节DNA甲基化在细胞的分化和功能调控中起着关键的作用。
在多细胞生物中，不同细胞类型的DNA甲基化模式是不同的，这有助于维持细胞的特异性和功能。
DNA甲基化还可以调节细胞的增殖、凋亡和分化等过程。
DNA甲基化的调控机制DNA甲基化的形成和去甲基化是通过一系列酶的催化下进行的。
在哺乳动物细胞中，DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase）可以将甲基基团添加到DNA上，而DNA 去甲基化酶（DNA demethylase）可以将甲基基团从DNA上去除。
DNA甲基化与疾病的关联DNA甲基化异常与多种疾病的发生和发展密切相关。
以下是一些与DNA甲基化异常相关的疾病：1.癌症：DNA甲基化异常在多种癌症中广泛存在。
甲基化模式的改变可以导致关键基因的失活或过度表达，从而促进癌细胞的生长和侵袭。
2.免疫系统疾病：某些自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎，与DNA甲基化异常有关。
这些异常可以导致免疫系统的功能紊乱。
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提到遗传，我们都已经习惯于这样的概念，即基因组的编码信息存在于ACGT 这四种碱基的排列顺序中。
然而，诸如胞嘧啶的甲基化修饰及其分布，组蛋白的乙酰化等，同样影响着表型。
这就构成了表观遗传学(epigenetics)的主要研究内容。
其实，早在1942年，C.H.Waddinton就提出了表观遗传学的概念，他指出，表观遗传与遗传相对，主要研究基因型和表型的关系。
而现在，对于表观遗传学，比较统一的认识是，其研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时，基因功能的可逆的可遗传的改变。
也就是说，在不改变基因组序列的前提下，通过DNA和组蛋白的修饰等来调控基因表达，其中又以DNA甲基化(DNA methylation)最为常见，成为表观遗传学的重要组成部分。
随着人类基因组计划的开展，科学家们开始在基因组水平来研究表观遗传学，逐步形成表观基因组学(epigenomics)。
表观基因组学就是要在整个基因组水平来研究表观遗传过程以及与这些过程密切相关的特定基因组区域的识别与鉴定。
2000年10月，人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium)由欧盟赞助，启动了旨在于人类6号染色体MHC区域首先做出DNA的甲基化图谱的先导计划(Pilot Project)。
该计划顺利完成，引导启动了2003年的人类表观基因组计划(Human Epigenome Project，HEP)。
2005年，美国国家卫生院(NIH)下属的国立癌症研究所启动了癌症基因组先导计划。
2006年，该所与国立人类基因组研究所一起共同启动癌症基因组计划(Cancer Genome Project)。
表观基因组学和DNA甲基化与癌症的研究成为新的热点。
本文将简要介绍DNA甲基化与CpG岛，癌症与DNA甲基化，和DNA甲基化的重要检测方法。
DNA甲基化与CpG岛：在人类表观遗传学研究中，最常见的就是CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰。
其主要过程是，在CpG甲基化结合蛋白(Methyl-CpG Binding Proteins,MBDs) 和DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下，使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变成为5’甲基胞嘧啶。
在正常人类的DNA中，约有3-6%的胞嘧啶被甲基化。
在哺乳动物中，约有50,000,000个CpG二核苷酸，其中70%的被甲基化。
而那些可被甲基化的CpG 二核苷酸并非随机的分布于基因组序列中，相反，在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端非翻译区和第一个外显子区，CpG 序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。
CpG岛的概念最早由Adrian Bird提出，他称之为未甲基化的HapII小片段(HpaII Tiny Fragment，HTF)，更正式的定义是这样的区域，该区域的序列长度至少200个碱基对，GC含量超过50%，CpG比值(观测值/期望值) 超过0.6。
CpG比值的计算方法如下：最近，为了排除那些Alu重复序列，提出了更严格的标准：长度至少500碱基对，GC含量超过55%，CpG比值大于0.65。
据估计，哺乳动物基因组中的CpG岛约有4万个。
在健康人的基因组中，CpG岛中的CpG位点一般处于非甲基化状态，而CpG岛外的CpG位点通常是被甲基化的。
研究表明，DNA的甲基化在遗传印记(genetic imprinting)，胚胎发育以及维持正常细胞功能等方面发挥着重要作用。
DNA甲基化与肿瘤发生： DNA甲基化水平和模式的改变是肿瘤发生的一个重要因素。
这些变化包括CpG岛局部的高甲基化和基因组DNA低甲基化状态。
如图1左所示，在正常细胞中，位于抑癌基因启动子区域的CpG岛处于低水平或未甲基化状态，此时抑癌基因处于正常的开放状态，抑癌基因不断表达抑制肿瘤的发生。
而在肿瘤细胞中，该区域的CpG岛被高度甲基化，染色质构象发生改变，抑癌基因的表达被关闭，从而导致细胞进入细胞周期，凋亡丧失，DNA修复缺陷，血管生成以及细胞粘附功能缺失等，最终导致肿瘤发生。
同样，如图1右所示，对于在正常细胞中处于高度甲基化的一些基因和重复序列，如果其甲基化水平降低，这些基因将表达和重复序列将激活，从而导致基因印记丢失，细胞过度增长，不合适的细胞特异性表达，基因组脆性增加，以及内寄生序列(endoparasitic sequence)的激活，最终也导致肿瘤发生。
图1. 肿瘤生成中的DNA甲基化改变模式 (取自Esteller M，Nat Rev Genet 2007, 8(4):286-298) 由于CpG岛的局部高度甲基化要早于细胞恶性增生，故其甲基化的检测可用于肿瘤的预测，而全基因组水平的低水平甲基化状态，则随着肿瘤恶性程度的增加而进一步降低，使其可用于肿瘤的诊断以及分级。
近年来，不断有研究显示人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有关,而且早在肿瘤临床确诊之前就可检测出特异基因的甲基化异常现象。
所以甲基化可以作为肿瘤等早期诊断的生物标记物和预后评估指标，对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。
DNA甲基化检测方法：随着DNA甲基化研究的不断深入，其检测方法也层出不穷。
这些方法针对不同研究目的，运用不同的处理方法，几乎涵盖了从基因到基因组各个层次水平的研究。
据检测样本不同，可以分为DNA和mRNA。
现有方法，绝大部分都是取样于细胞的DNA，根据研究水平，又将这些方法归为3大类，即：基因组甲基化水平(Methylation Content)的分析，候选基因甲基化分析，和基因组层次的DNA甲基化模式(Methylation pattern)与甲基化谱(Methylation Profiling)分析。
主要方法分述如下：A．基因组甲基化水平(Methylation Content)的分析:1. 高效液相色谱(High-performance Liquid Chromatography,HPLC) HPLC是一种比较传统的方法，是根据DNA或蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。
由于在动态相和静态相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。
随着系统的压强的增加，其分辨率增高。
故而能够定量测定基因组整体水平DNA甲基化水平。
该方法由Kuo等1980 年首次报道。
过程是将DNA 样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5 mC/(5mC+5C)的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。
这是一种检测DNA甲基化水平的标准方法。
2. 高效毛细管电泳法(High-performance Capillary Electrophoresis,HPCE)这是一种利用窄孔熔融石英毛细管来从复合物中分离不同化学组分的技术。
其基础是在强电场下不同分子的由于其所带电荷，大小，结构以及疏水性等不同而相互分开。
用HPCE方法处理DNA水解产物来确定5mC水平，简便，经济且敏感性高。
在这两种方法的基础上，不断有新方法改进，包括，变性高效液相色谱(DHPLC)，逆向高效液相色谱(Reversed phase HPLC)以及HPLC与薄层色谱(Thin-layer Chromatography, TLC)相结合的HPLC-TLC方法。
除上述方法外，还有其他原理的检测方法，如单纯的TLC方法以及最佳近邻TLC(Nearest neighbour TLC)，基于抗5mC的免疫学技术(Anit-5mC immunological techniques), SssI 甲基转移酶法(SssI methyl Acceptance Assay)，在重亚硫酸盐处理的基础上而进行的氯乙醛反应法(Chloacetaldehyde reaction)和酶区甲基化分析(Enzymatic Regional methylation Assay, ERMA)。
必须指出，以上各种方法虽然能够明确检测出目的序列中所有CpG位点的甲基化状况，但并不能对甲基化位点进行定位。
B．候选基因(Candidate Gene)甲基化分析:1. 甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法( methylation-sensitive restriction Endonuclease -PCR/Southern, MSRE-PCR/Southern)这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后，进行Southern 或PCR扩增分离产物，明确甲基化状态再进行分析。
常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有HpaⅡ-MspⅠ(CCGG)和SmaⅠ-Xmal(CCCGGG)等。
2. 重亚硫酸盐测序法(Bisulphite Sequencing)该方法首先用重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后,对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化。
此方法是精确度很高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序,过程较为繁琐、昂贵。
3. 甲基化特异性的PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR)该方法同样DNA先用重亚硫酸盐处理，随后行引物特异性的PCR。
其设计两对引物，分别与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即一对结合处理后的甲基化DNA链，另一对结合处理后的非甲基化DNA链。
检测MS-PCR 扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；反之亦然。
4. 甲基化荧光法(MethyLight)结合重亚硫酸盐处理待测DNA片段，设计一个能与待测位点区互补的探针，探针的5’端连接报告荧光，3’端连接淬灭荧光，随后行实时定量PCR。
如果探针能够与DNA杂交，则在PCR用引物延伸时，TaqDNA 聚合酶5′到3′端的外切酶活性会将探针序列上5′端的报告荧光切下，淬灭荧光不再能对报告荧光进行抑制，这样报告荧光发光，测定每个循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化情况及水平。
本方法高效，迅速，具备可重复、所需样本量少、不需要电泳分离的特点。
5. 焦磷酸测序(Pyrosequencing)该方法，由4种酶催化同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就能将其加入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸(PPi)。
PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，其高度与核苷酸数目成正比。