小鼠肾脏原代细胞的分离和计数
乳鼠肾细胞原代培养边晔
乳鼠肾细胞的原代培养生05 边晔 2010030026周二班同组同学：解智博实验时间 2012年11月12日一、实验背景1.细胞分离技术根据所取组织可分为：离心分离法（细胞外液环境）；机械分离法（如切割，挤压等）；化学分散法（如酶）；细胞表面抗原等。
2.培养细胞的纯化自然纯化；人工纯化。
人工纯化又包括酶消化法，反复贴壁法，机械刮除法，克隆法，培养基限定法，流式细胞仪等。
3.细胞冻存与复苏基本原则：慢冻快融。
二、实验步骤1.取出肾脏1)将乳鼠（3天左右）用剪刀断头放血致死。
2)进入无菌间，用70%乙醇消毒乳鼠体表，将其固定在蜡盘上。
3)在超净台内，将其背部皮肤剪出一个“工”字型开口，然后将皮肤拉开，固定在蜡盘上，使其腰背部肌肉暴露出来。
4)用70%乙醇消毒背部肌肉，在脊柱两侧各剪一切口，取出肾脏，置于盛有 PBS溶液的平皿中。
（由于肾太小不易操作，故未除去肾膜与脂肪等）5)纵向将肾脏剪开（除去肾盂）。
将肾脏剪成数块，用PBS溶液再洗涤一次。
6)吸弃PBS溶液，将肾脏剪碎（小而均匀，肉泥状）。
2.消化法原代培养1)加入0.5mL 胰酶—EDTA溶液，于37℃消化15分钟，直至组织块变白、呈疏松状（镜检可见分散细胞）。
2)加入0.5mL含血清DMEM培养基终止消化，将枪头顶住皿底反复“吹打”分散细胞。
3)实际试验中并没有出去任何大块组织（结果证明得到很多细胞，应该是损失较少）。
1000rpm离心10min；弃上清。
4)加入PBS溶液重复洗涤、离心一次。
5)加入1mL含血清DMEM细胞培养液重悬细胞；取20μl细胞悬液进行细胞计数（由于细胞太多，故放弃计数）。
6)将剩余980μl细胞悬液加入到10mL培养瓶中，补加血清DMEM培养基到终体积为1.5ml。
37℃、5% CO2培养。
7)第三天（周四）上午，更换全部培养液。
8)下个周一，进行传代培养。
3.整理：1)取肾后，将鼠尸体置于专门的垃圾袋中。
2)蜡盘、大头针用洗干净后，浸泡于酒精中。
小鼠肾小球分离方法比较及原代足细胞鉴定
小鼠肾小球分离方法比较及原代足细胞鉴定方际;吴鹤瑾;王浩【摘要】目的通过比较小鼠肾小球分离技术,明确小鼠原代足细胞培养的最优方法.方法分别采用差异过筛法和免疫磁珠法分离C57/BL6 J小鼠肾小球,用Ⅳ型胶原酶消化去除包曼囊,用相差显微镜观察肾小球纯度和形态结构,采用免疫荧光染色和聚合酶链反应法(polymerase chain reaction,PCR)鉴定足细胞的标志蛋白Podocin 的分布和表达.结果差异过筛法获得肾小球纯度达90.2％±1.6％,一只C57/BL6J 小鼠可以得到(10421±2421)个肾小球;视野中肾小球结构完整,可见肾小管碎片.免疫磁珠法获得的肾小球纯度达96.7％±1.2％,一只C57/BL6J小鼠可以得到(16112±2651)个肾小球;视野中肾小球结构完整,基本无肾小管.免疫磁珠法获得肾小球纯度和数目均高于差异过筛法,差异均有统计学意义(P<0.05).7～10 d可见肾小球周围大量多边形细胞爬出,呈铺路石样外观,符合足细胞特征;免疫荧光染色和PCR法均证实有足细胞特异性蛋白Podocin表达.结论 C57/BL6J小鼠肾小球的分离,免疫磁珠法明显优于差异过筛法,可以更简便、高效地培养出原代足细胞.【期刊名称】《武警医学》【年(卷),期】2018(029)012【总页数】4页(P1151-1154)【关键词】肾小球;足细胞;原代培养;免疫磁珠【作者】方际;吴鹤瑾;王浩【作者单位】200062,上海中医药大学附属普陀医院肾内科;200062,上海中医药大学附属普陀医院肾内科;200062,上海中医药大学附属普陀医院肾内科【正文语种】中文【中图分类】Q813.11;R322.61足细胞在蛋白尿的发生发展中起重要作用[1]，但因其为高度分化的终末期细胞，其体外培养一直较为困难。
国外已有实验室成功建立人、鼠条件永生化足细胞株[2,3]，但细胞株在生长、遗传特征及细胞结构等方面与原代细胞相差较大，不能很好地模拟相关的肾脏病理生理学状况，这使基于永生化足细胞株的实验结果的可信度大大降低。
小鼠肾小球内皮细胞使用说明
小鼠肾小球内皮细胞小鼠肾小球内皮细胞产品说明：为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的小鼠肾小球内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的小鼠肾小球内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
小鼠肾小球内皮细胞注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。
培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。
4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。
5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。
小鼠肾小球内皮细胞其他相关小鼠原代细胞：小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞小鼠肺大动脉内皮细胞小鼠前脂肪细胞小鼠肺动脉成纤维细胞小鼠成骨细胞小鼠肺大静脉内皮细胞小鼠关节软骨细胞小鼠气管和支气管上皮细胞小鼠胎儿表皮角质形成层细胞小鼠胰岛细胞小鼠成年表皮角质形成层细胞小鼠胰腺星状细胞小鼠皮下脂肪细胞小鼠胰腺导管上皮细胞小鼠内脏脂肪细胞小鼠颌下腺上皮细胞小鼠脑动脉血管内皮细胞小鼠腮腺细胞小鼠脑动脉血管平滑肌细胞小鼠乳腺上皮细胞小鼠脑静脉血管内皮细胞小鼠胰腺上皮细胞小鼠脑静脉血管平滑肌细胞小鼠甲状腺上皮细胞小鼠脑膜细胞小鼠淋巴管内皮细胞小鼠神经胶质细胞小鼠淋巴成纤维细胞小鼠海马神经元细胞小鼠外周血白细胞小鼠脑微血管内皮细胞小鼠骨髓基质细胞小鼠脑成纤维细胞小鼠食管上皮细胞小鼠神经小胶质细胞小鼠食管平滑肌细胞小鼠雪旺氏细胞小鼠肠动脉内皮细胞小鼠小脑颗粒细胞小鼠肠静脉内皮细胞小鼠嗅鞘细胞小鼠肝实质细胞小鼠视网膜微血管内皮细胞小鼠肝动脉内皮细胞小鼠小梁网细胞小鼠肝动脉平滑肌细胞小鼠视网膜色素上皮细胞小鼠小肠血管内皮细胞小鼠视网膜muller细胞小鼠小肠隐窝上皮细胞小鼠虹膜色素上皮细胞小鼠肝内胆管上皮细胞小鼠晶状体上皮细胞小鼠胃粘膜上皮细胞小鼠角膜上皮细胞小鼠肝窦内皮细胞小鼠视网膜神经节细胞小鼠肝星形细胞小鼠角膜成纤维细胞小鼠直肠平滑肌细胞小鼠脉络膜血管细胞小鼠小肠平滑肌细胞小鼠牙乳头细胞小鼠结肠平滑肌细胞小鼠肝外胆管上皮细胞小鼠肠上皮细胞小鼠肝Kupffer细胞小鼠肠微血管细胞小鼠骨髓间充质干细胞小鼠肠巨噬细胞小鼠下丘脑神经元细胞小鼠子宫内膜上皮细胞小鼠睾丸支持细胞小鼠卵巢颗粒细胞小鼠心肌微血管内皮细胞小鼠子宫颈上皮细胞小鼠真皮微血管上皮细胞小鼠子宫平滑肌细胞小鼠胚胎成纤维细胞小鼠卵巢上皮细胞小鼠心脏干细胞小鼠子宫成纤维细胞小鼠神经干细胞小鼠卵巢成纤维细胞小鼠骨髓来源内皮祖细胞小鼠肾实质细胞小鼠椎间盘髓核细胞小鼠肾系膜细胞小鼠肾足突细胞小鼠膀胱上皮细胞小鼠肾小管平滑肌细胞小鼠膀胱平滑肌细胞小鼠肾成纤维细胞小鼠肾动脉内皮细胞小鼠尿道上皮细胞小鼠肾动脉平滑肌细胞小鼠输尿管上皮细胞小鼠肾小管上皮细胞小鼠肾管状上皮细胞小鼠肾小球内皮细胞小鼠心肌细胞小鼠前列腺上皮细胞小鼠心肌成纤维细胞小鼠肾上皮细胞小鼠主动脉内皮细胞小鼠膀胱成纤维细胞小鼠主动脉平滑肌细胞小鼠血管外膜成纤维细胞。
乳鼠肾细胞原代培养传代培养
乳鼠肾细胞的原代培养、传代培养目的要求一、了解细胞原代培养、传代（继代）培养的基本方法和操作过程。
二、初步掌握培养过程中的无菌技术。
三、掌握在例置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。
用品超净工作台恒温培养箱普通显微镜例置相差显微镜水浴箱、离心机解剖剪、眼科剪镊子（尖头、平头和有钩镊）烧杯培养瓶离心管吸管血球记数板酒精灯单个仪器逐个弹出在屏幕上，小器械逐个弹出在超净台上培养用品RPM1 1640培养液（含小牛血清及青、链霉素）试剂库弹出具体内容酒精冻存培养液胰蛋白霉---⎪⎪⎭⎪⎪⎬⎫75%PBS 0.25% RPM1 1640、0.25%胰蛋白霉、PBS ，冻存培养液微热字显示动物细胞及细胞系新生乳鼠（小鼠）中国仓鼠卵巢细胞（CHO ）人宫颈癌细胞（HELA ）以上三个也为热字显示乳鼠肾细胞原代培养方法1—单层细胞培养法所有组织中都有一定量的细胞间质（纤维和基质等），对细胞生长有妨碍作用，用胰酶消化能出去间质，使组织松散成单个细胞或小的细胞团，细胞易于生长。
步骤1．培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。
2．点燃酒精灯，用品按布局放置，安装吸管等3．取材取新生乳鼠一只，采用颈椎脱臼法处死，然后把这个小鼠进入盛有75%酒精的烧杯中2-3秒，随即携入超净工作台内。
在超净工作台内取出小鼠，置于消毒培养皿中打开消毒器械包用镊子掀起乳鼠腹部皮肤，用解剖剪剪开腹腔，充分暴露腹腔，用另一镊子轻轻夹起肠管，翻置一侧，充分暴露位于腹腔背壁脊柱两侧的肾脏取下双侧肾脏，放入消毒培养皿中用吸管吸取PBS加入培养皿中，清洗肾脏3次，尽量去掉血污再将肾组织用解剖剪剪成几块再用PBS漂洗，去净血液为止4．消化将洗净的组织块移入消毒小瓶中（如毒霉素瓶）用眼科剪深入瓶内反复剪切组织直至0.5mm大小的组织块加入5-8倍量（体积）的0.25%胰蛋白酶，盖好放入37︒C水浴中消化20-30分钟，注意应每隔5分钟振摇一次。
一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基[发明专利]
![一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/77508d653d1ec5da50e2524de518964bcf84d2df.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810952148.3(22)申请日 2018.08.21(71)申请人 华中科技大学同济医学院附属同济医院地址 430030 湖北省武汉市解放大道1095号(72)发明人 曾锐 徐虎子 邓旋 赵志 (74)专利代理机构 北京一格知识产权代理事务所(普通合伙) 11316代理人 赵永伟(51)Int.Cl.C12N 5/071(2010.01)(54)发明名称一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基(57)摘要本发明涉及一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基，该培养基由以下各原料混合而成：500 mL DMEM/Ham ´s F12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B 500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂50uL和激素混合物5mL。
本发明还提供了使用上述培养基提取及培养高纯度原代肾小管上皮细胞的方法。
有益效果为，采用本发明的高选择性的培养基，可提取及培养出纯度高达92%以上的小鼠原代肾小管上皮细胞，培养得到的高纯度原代肾小管上皮细胞是研究急性肾损伤或慢性肾脏病损伤机制的较好工具细胞。
权利要求书1页 说明书3页 附图2页CN 109022350 A 2018.12.18C N 109022350A1.一种培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的培养基，其特征在于，由以下各原料混合而成：500 mL DMEM/Ham ´s F12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B 500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂50uL和激素混合物5mL。
2.根据权利要求1所述的一种培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的培养基，其特征在于，所述激素混合物由以下各原料混合而成：HBSS缓冲液28.5mL、两性离子缓冲剂0.5mL、前列腺素E2 1mL、 Trijod -Thyronine 5mL、氢化可的松5mL和肾上腺素5mL。
小鼠肾实质细胞使用说明
小鼠肾实质细胞小鼠肾实质细胞产品说明：为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的小鼠肾实质细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的小鼠肾实质细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
小鼠肾实质细胞注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。
培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。
4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。
5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。
小鼠肾实质细胞其他相关小鼠原代细胞：小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞小鼠肺大动脉内皮细胞小鼠前脂肪细胞小鼠肺动脉成纤维细胞小鼠成骨细胞小鼠肺大静脉内皮细胞小鼠关节软骨细胞小鼠气管和支气管上皮细胞小鼠胎儿表皮角质形成层细胞小鼠胰岛细胞小鼠成年表皮角质形成层细胞小鼠胰腺星状细胞小鼠皮下脂肪细胞小鼠胰腺导管上皮细胞小鼠内脏脂肪细胞小鼠颌下腺上皮细胞小鼠脑动脉血管内皮细胞小鼠腮腺细胞小鼠脑动脉血管平滑肌细胞小鼠乳腺上皮细胞小鼠脑静脉血管内皮细胞小鼠胰腺上皮细胞小鼠脑静脉血管平滑肌细胞小鼠甲状腺上皮细胞小鼠脑膜细胞小鼠淋巴管内皮细胞小鼠神经胶质细胞小鼠淋巴成纤维细胞小鼠海马神经元细胞小鼠外周血白细胞小鼠脑微血管内皮细胞小鼠骨髓基质细胞小鼠脑成纤维细胞小鼠食管上皮细胞小鼠神经小胶质细胞小鼠食管平滑肌细胞小鼠雪旺氏细胞小鼠肠动脉内皮细胞小鼠小脑颗粒细胞小鼠肠静脉内皮细胞小鼠嗅鞘细胞小鼠肝实质细胞小鼠视网膜微血管内皮细胞小鼠肝动脉内皮细胞小鼠小梁网细胞小鼠肝动脉平滑肌细胞小鼠视网膜色素上皮细胞小鼠小肠血管内皮细胞小鼠视网膜muller细胞小鼠小肠隐窝上皮细胞小鼠虹膜色素上皮细胞小鼠肝内胆管上皮细胞小鼠晶状体上皮细胞小鼠胃粘膜上皮细胞小鼠角膜上皮细胞小鼠肝窦内皮细胞小鼠视网膜神经节细胞小鼠肝星形细胞小鼠角膜成纤维细胞小鼠直肠平滑肌细胞小鼠脉络膜血管细胞小鼠小肠平滑肌细胞小鼠牙乳头细胞小鼠结肠平滑肌细胞小鼠肝外胆管上皮细胞小鼠肠上皮细胞小鼠肝Kupffer细胞小鼠肠微血管细胞小鼠骨髓间充质干细胞小鼠肠巨噬细胞小鼠下丘脑神经元细胞小鼠子宫内膜上皮细胞小鼠睾丸支持细胞小鼠卵巢颗粒细胞小鼠心肌微血管内皮细胞小鼠子宫颈上皮细胞小鼠真皮微血管上皮细胞小鼠子宫平滑肌细胞小鼠胚胎成纤维细胞小鼠卵巢上皮细胞小鼠心脏干细胞小鼠子宫成纤维细胞小鼠神经干细胞小鼠卵巢成纤维细胞小鼠骨髓来源内皮祖细胞小鼠肾实质细胞小鼠椎间盘髓核细胞小鼠肾系膜细胞小鼠肾足突细胞小鼠膀胱上皮细胞小鼠肾小管平滑肌细胞小鼠膀胱平滑肌细胞小鼠肾成纤维细胞小鼠肾动脉内皮细胞小鼠尿道上皮细胞小鼠肾动脉平滑肌细胞小鼠输尿管上皮细胞小鼠肾小管上皮细胞小鼠肾管状上皮细胞小鼠肾小球内皮细胞小鼠心肌细胞小鼠前列腺上皮细胞小鼠心肌成纤维细胞小鼠肾上皮细胞小鼠主动脉内皮细胞小鼠膀胱成纤维细胞小鼠主动脉平滑肌细胞小鼠血管外膜成纤维细胞。
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告-山东大学
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】1.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。
但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。
被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。
因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。
细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。
小鼠原代kupffer细胞分离
1、小鼠肝脏Kupffer 细胞分离、纯化参照Tetsuya Abe等的方法并加以改进。
腹腔注射2%戊巴比妥钠（40mg/kg），沿腹部正中做一约2cm 的切口，完全暴露门静脉，经门静脉置入18G 套管针，置入位置约距离肝门1cm，插入约0.8cm，4-0 丝线固定后，立即剪开下腔静脉，用无钙灌注液进行灌注，灌注速度约为10ml/min,同时剪开上腔静脉，灌注过程见图 1.1、图1.2。
灌注5min，共灌注无钙灌注液50ml/只，灌注后肝脏体积膨大、颜色变浅，解剖剪分离取下肝脏，去除结缔组织及胆囊，在75%的酒精里漂洗5s，然后用PBS 漂洗三次，以防污染。
放到盛有PBS 的50ml 无菌瓶中，每批细胞需要灌注3-5 只小鼠。
待所有小鼠肝脏灌注好之后，一起放到细胞培养皿中，用眼科剪剪碎，加入0.1% 四型胶原酶，每只约需5ml，放至37℃CO2培养箱，消化一小时，摇匀一次/15 min，并用移液枪轻轻吹打1min。
待组织块消化完全，细胞基本散落形成细胞悬液后，过350 目滤网2 次，以去除未消化的组织块和结缔组织。
用15ml 离心管收集细胞悬液，300 rpm×3 min，离心两次，收集上清，可以去除大部分的小鼠肝脏细胞。
然后，1500 rpm×5 min，弃上清，收集沉淀，用含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640 培养基悬浮细胞沉淀。
Percoll不连续密度梯度离心，2000g×20min，4℃；各层为上：细胞悬液2ml，中：25%Percoll 3ml，下：50%Percoll 3ml（用15ml 离心管，2-3 管/只）。
先将50%的Percoll液3ml 置于离心管底部，再沿着离心管管壁缓慢加入25%Percoll3ml在50%Percoll 液上面，最后沿着管壁缓慢加入细胞悬液2ml 于最上层，见图1.3 。
离心后可见四层区带：最上一层为细胞碎片；第二层为富含肝窦内皮细胞的区带；第三层为富含Kupffer 细胞的区带；第四层为积于管底的沉淀，主要是红细胞，见图1.4 。
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一小鼠肾脏原代细胞的分离及细胞计数
(一)原理
细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。
由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。
原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。
一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
(二)操作
1．取材
用颈椎脱位法使小鼠迅速死亡。
然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
用消过毒的剪刀剪开用乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肾脏。
置于无菌平皿中。
2．切割
用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1 mm左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。
移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
3．消化
吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1 ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化30分钟，每隔5分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清。
4．制备单细胞悬液
向含有经消化的肾组织的离心管中加入2-3 ml PBS，用吸管吸打数次，直到看不到块状组织。
5．细胞计数
1 盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2 将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
3 统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数目。
4 计算原细胞悬液的细胞数（按照下面公式计算细胞密度）：
（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×104
说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为1.0mm（长）×1.0 mm（宽）×0.1 mm （高）＝0.1 mm3 而1 ml＝1000mm3。
(三)结果
观察显微镜下的细胞形态，并计算细胞的数目。
（四）注意事项
1．取材
然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1 mm左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。
2．制备单细胞悬液
向含有经消化的肾组织的离心管中加入2-3 ml PBS，用吸管吸打数次，直到看不到块状组织。
3．细胞计数
如果细胞太浓，要稀释后再进行计数，一般要求细胞浓度在106左右较好。
注意：
写实验报告，将细胞的形态和数量要记清楚。