贴壁细胞的脂质体转染
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
脂质体转染实验原理与操作步骤总(精)
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全日期:2012-06-25 来源:互联网作者:青岚点击:3644次摘要:细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等, 本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。
找产品,上生物帮 >> >>细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等,本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。
脂质体 (lipofectin regeant, LR 试剂是阳离子脂质体 N-[1-2, 3-Dioleyoxy , Propyl]-n, n , n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA和 Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE的混合物 [1:1(w/w]。
它适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中 ,是目前条件下最方便的转染方法之一。
转染率高,优于磷酸钙法,比它高5~100倍,能把 DNA 和 RNA 转染到各种细胞。
用 LR 进行转染时, 首先需优化转染条件, 应找出该批 LR 对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批 LR 都要做:第一,先要固定一个 DNA 的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间, DNA 可从1~5μg和孵育时间 6小时开始,按这两个参数绘出相应 LR 需用量的曲线,再选用 LR 和 DNA 两者最佳的剂量,确定出转染时间 (2~24小时。
因 LR 对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过 24小时为宜。
细胞种类:COS-7、 BHK 、 NIH3T3、 Hela 和 Jurkat 等任何一种细胞均可作为受体细胞。
脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染原理及操作步骤脂质体转染是一种常用的基因传递技术，用于将外源的核酸（例如DNA、RNA）转入细胞内。
脂质体是由人工合成的类似于细胞膜的双层脂质膜组成，具有较好的生物相容性和可降解性，因此可以用来包裹并传递外源核酸进入目标细胞内。
本文将详细介绍脂质体转染的原理和操作步骤。
脂质体由两个疏水性脂质尾部和一个亲水性脂质头部组成，形成类似生物细胞膜的双层结构。
这种双层结构使得脂质体可以包裹水溶性的外源核酸，并形成脂质体-核酸复合物。
当复合物与细胞膜接触时，由于脂质体的类似性，这些复合物可以与细胞膜融合，并释放外源核酸进入细胞。
然而，简单地将脂质体-核酸复合物添加到细胞培养基中并不能有效地将外源核酸转入细胞内。
为了提高转染效率，常常需要使用电穿孔或钙磷共沉淀等方法，以增加细胞膜的通透性。
操作步骤：1.准备工作：-完整的脂质体转染试剂盒。
-DNA或RNA溶液。
-靶细胞。
-无菌操作条件下的实验室。
2.重组脂质体的合成：-按照试剂盒说明将脂质体复合物合成。
-使用无菌的工具和试剂。
3.核酸引物的制备：-将外源DNA或RNA与引物混合，使其形成核酸复合物。
4.细胞处理：-将培养皿中的细胞进行冲洗，去除培养基。
-将适量的细胞培养基添加到培养皿中，以保证细胞的正常生长。
5.导入核酸：-将所制备的核酸复合物滴加到细胞培养基中。
-将细胞培养皿置于无菌环境中，以便细胞吸收和利用核酸。
6.细胞培养：-按照细胞类型和所使用的培养基，将细胞置于恰当的培养条件下，并进行培养。
-根据需求添加所需要的生长因子和抗生素。
7.观察和分析：-在一定的培养时间后，观察细胞是否发生了显著的变化。
- 使用适当的实验方法（如PCR、Western blot等）检测外源基因的表达。
-观察并记录实验结果。
以上是脂质体转染的原理和操作步骤。
脂质体转染是目前常用的基因传递技术之一，可以用于研究基因功能、疾病治疗等领域。
随着技术的不断发展，转染效率和特异性将逐渐提高，为研究和治疗带来更多的机会和挑战。
脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染原理及操作步骤
脂质体转染是一种常用的基因传递方法，通过将目标基因以及负载该基因的脂质体添加到细胞培养物中，使其与细胞膜融合，并将基因导入到细胞内。
脂质体转染的操作步骤如下：
1. 提取脂质体：首先，从脱脂牛奶或其它来源中提取脂质体。
可以通过超声处理、离心等方法将脂质体分离出来。
2. 混合目标基因与脂质体：将目标基因与脂质体混合，目标基因可以是质粒DNA、RNA等。
将基因加入脂质体溶液中，进
行充分混合。
3. 孵育：将脂质体-基因混合物在室温下孵育一段时间，通常
为15-30分钟。
这一步主要是让脂质体与基因充分结合。
4. 加入细胞：将孵育好的脂质体-基因混合物加入需要转染的
细胞培养物中。
细胞种类可以是哺乳动物细胞、脊椎动物细胞、细菌等。
5. 孵育细胞：将细胞培养物保持在适宜的培养条件下，孵育一定时间，让细胞充分吸收脂质体-基因复合物。
6. 收获转染细胞：经过一定时间的孵育后，可从培养物中收获转染细胞。
可以根据实验需要进行后续分析。
需要注意的是，脂质体转染的效率与脂质体组分、浓度、孵育时间、细胞类型等因素密切相关，需要进行参数优化才能达到较高的转染效果。
【2017年整理】体内实验研究的常见问题及解答
体内实验研究的常见问题及解答问：进行体内研究前需要注意什么？答：为体内研究设计的实验需要考虑：动物模型的选择、给药途径、剂量以及重复给药的频率。
选择siRNA 的用量和浓度时应该考虑以下因素：靶器官的特性和研究物的大小。
问：进行小鼠的体内研究需要多少量的siRNA？答：siRNA体内研究领域相对较新，很少有已经确定的实验程序，因而很难确切地说实验需要多少量的siRNA。
我们推荐您通过文献检索参考其他类似的体内研究需要的siRNA的量。
小鼠全身给药需要100uL 浓度为10－500uM的siRNA。
有研究表明在大剂量给药时，一些毒性在20 mg/kg/day (416 mM)以上才能观测到。
问：锐博合成的siRNA能用于体内研究吗？答：我们已经对合成的siRNA进行处理，使其能应用于动物研究。
问：在体内研究中，最好的给药途径是什么？答：寡核苷酸可以通过大剂量给药或使用ALZET微小泵持续给药。
大剂量给药时要慎重，因为已有研究表明：一些毒性与寡核苷酸反义链的浓度有关，快速给药时可能会导致动物下肢瘫痪或致死，所以给药时要注意观察。
很多已发表的论文实验是通过尾静脉给药的。
任何给药方式都需要优化，以确保最佳的导入方式和动物的健康。
剂量/浓度计算的常见问题及解答问：定量RNA的公式是什么？答：研究者可以用Beer法则定量RNA：吸光度（260nm）=(摩尔消光系数)*(浓度)*(路径长度,cm)。
为了便于理解，等式变为：浓度＝（吸光度,260nm）/[(摩尔消光系数)*(路径长度,cm)]。
当使用一个标准的10mm 比色皿时，在公式中路径长度这个变量等于1。
问：我需要浓度为20uM的样品，如何计算重悬siRNA缓冲液的量？答：锐博为您提供的siRNA是nmol数量级的冻干粉。
样品浓度的计算如下：（siRNA的量，nmol）/（重悬体积，uL）＝样品浓度，umol/L。
在解答前应先统一单位，确保单位可以抵消。
脂质体转染原理
脂质体转染原理
脂质体转染是一种常用的基因传递工具，可以将外源DNA有效地引导进入目标细胞。
其原理基于脂质体的特殊结构和细胞膜的特性。
脂质体是由疏水性和亲水性分子组成的结构，可以形成类似细胞膜的双层结构。
在细胞培养条件下，脂质体会与目标DNA 结合，形成脂质体/DNA复合物。
当脂质体/DNA复合物与目标细胞接触时，由于脂质体与细胞膜的亲和性，复合物可以通过与细胞膜融合的方式进入细胞。
一旦脂质体/DNA复合物进入细胞，复合物会被内吞作用包裹成内吞体，内吞体随后与溶酶体融合形成溶酶体内嘌呤体。
在溶酶体内，复合物会被酸性环境和溶酶体内含的酶分解，释放出DNA分子。
最后，释放出的DNA会进入到细胞核中，并与细胞核中的染色体相结合，启动目标基因的表达。
脂质体转染的原理可以归纳为三个步骤：脂质体与DNA结合形成复合物，复合物与细胞膜融合进入细胞，复合物在细胞内释放DNA并进入细胞核。
这个过程提供了一种可靠的手段，用于将外源DNA引导进入目标细胞，实现基因传递和表达。
(完整版)LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染实验步骤：(在生长培养基中直接加入复合物)1。
转染前一天，胰酶消化细胞并计数,将细胞转至24孔板，控制密度使其在转染日密度接近90％.细胞铺板在0。
5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
2.对于每孔细胞,使用50μl OPTI—MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
温柔混匀LIPOFECTAMINE 2000,室温温浴5分钟（在5-25分钟内同稀释的DNA混合.保温时间过长会降低活性。
可以批量制备。
）注意：即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI—MEMⅠ稀释,细胞也可以使用D-MEM培养. 3。
对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI—MEMⅠ培养基)稀释0。
8μg-1.0μg DNA。
多孔操作可以批量制备。
4。
混合稀释的DNA（由第3步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000(由第2步).在室温保温20分钟。
注意:溶液可能会混浊,但不会影响转染。
复合物可以在室温保持6小时稳定.5。
直接将复合物（100μl）加入到每孔中，前后（或左右）摇动培养板,轻轻混匀.注意：如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。
在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.2ml无血清培养基。
6.在37℃，5％的CO2中保温18—48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4—5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。
7.在细胞中加入复合物18—72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。
这依赖于细胞类型和启动子活性.对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中（1:10），两天后加入筛选抗生素。
进行稳定表达需要数天或数周.。
OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法
OPTI-MEM进行贴壁细胞培养的实验方法日期：2012-05-17来源：互联网作者：青岚点击： 194次•MEM细胞培养基无血清培养基可以提供细胞贴壁需要的一些基质，本文总结了利用无血清培养基OPTI-MEM进行贴壁细胞的脂质体转染试验材料，步骤、个人经验以及问题分析。
贴壁细胞的脂质体转染一、实验材料1、宿主细胞CHO(贴壁细胞)2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000(invitrogen公司)3、6孔细胞培养版4、无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)5、转染级质粒二、实验步骤invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔......板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。
以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧!1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。
(我的接种密度是3~4*105/ml.)转染时，细胞要达到90~95%的融合。
2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well (总体积250 ul)(温育5min)3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well(总体积250 ul)4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
在37℃，5%的CO2中保温5~6小时。
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5%的CO2中48~72h检测转染水平。
8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的培养板，加抗生素进行筛选。
三、个人经验：我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。
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一、实验材料
1、宿主细胞CHO（贴壁细胞）
2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司）
3、6孔细胞培养版
4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）
5、转染级质粒
二、实验步骤
invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔……板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。
以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！
1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。
（我的接种密度是
3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。
2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min）
3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul）
4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。
5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。
6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。
7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h检测转染水平。
8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养基。
三、个人经验：
我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。
转染率很高。
以下是个人经验，与大家分享。
1.细胞的状态。
这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。
有文献说传代不要超过17代。
我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。
2.细胞的融合度。
细胞的融合度必须要达到90%才能做，细胞太少，容易死的。
3.无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍（我曾比较过OPTI-MEM与PBS或无血清的DMEM，前者的转染效率确实高）。
注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。
如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。
4.加入无血清培养基后5~6小时更换全培养基。
无血清培养基培养时间过长，对细胞是有毒性的，这里有血的教训！
5.转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。
浓度不要低于0.35ug/ul。
低浓度的质粒，我做的结果都不好。
6.48小时mRNA表达最高；72h蛋白表达最高。